N/C對碳氮膜修飾的多壁碳納米管細胞相容性的影響

趙夢鯉，李德軍，董 磊，劉小綺，曹 葉

（天津師范大學物理與材料科學學院，天津300387）

多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）是由多層同心石墨片卷曲而成的無縫、中空管體[1]，其管徑由零點幾至數(shù)十納米，而長度可達微米甚至毫米量級，超大的長度直徑比[2]賦予它們獨特的電子、力學和化學特性[3-5].因此，多壁碳納米管被用作藥物和生物分子的傳導工具以及組織工程中的支架[6-9]，成為近年來物理、醫(yī)學和生物材料等多領域的研究前沿和熱點[10-13].隨著研究的不斷深入，純碳納米管也逐漸暴露出一些缺陷，如親水性差、易在水性溶液中團聚.為了使其更好地應用于生物醫(yī)學領域，必須要提高碳納米管的親水性及其生物相容性.功能化修飾作為一種可以有效改善碳納米管親水性及其生物相容性的物理、化學方法逐漸嶄露頭角.

共價修飾[14-18]、氟化[19]和自由基氧化[20]是目前常用的碳納米管化學修飾方法，具有造價低廉、反應速度快和可大批量生產(chǎn)的優(yōu)勢；但同時，容易引入雜質(zhì)基團、引起材料結構改變及對修飾基團的選擇性等問題也成為化學修飾法難于克服的缺陷.作為一種物理方法，離子束輔助沉積（IBAD）技術將電離的原子經(jīng)電場加速后快速轟擊靶材，產(chǎn)生帶電離子，然后使目標離子注入固體材料表面，從而引起材料表層成分和結構的改變，達到改善材料表面性能的目的.該技術的最大特點是不會對改性的碳納米管的力學性能造成影響，產(chǎn)生的沉積層與碳納米管附著緊密，在改善生物材料的生物相容性方面收效甚好.

課題組的前期研究已證實沉積納米碳氮膜的多壁碳納米管具有更優(yōu)秀的細胞相容性[21]，文獻[22]曾報道在表面沉積不同比例納米碳氮膜的多壁碳納米管的抗凝血性不同.本研究對原始MWCNTs和沉積CNx（x=N/C，x=0.20，0.21，0.27）膜的MWCNTs進行了細胞黏附和增殖實驗，以分析MWCNTs表面CNx薄膜的存在與N含量對其細胞相容性的影響.體外細胞實驗選用小鼠成纖維細胞（L929）、人內(nèi)皮細胞（EAhy926）和新西蘭兔血紅細胞分別與MWCNTs和3種不同N/C比的沉積納米CNx薄膜的MWCNTs表面相接觸，通過觀察3種細胞在材料表面的黏附和生長情況，研究N元素劑量對沉積納米CNx膜的MWCNTs細胞相容性的影響.

1 材料與方法

1.1 沉積納米CNx薄膜的MWCNTs的制備

MWCNTs（中國深圳市納米港有限公司提供）由CVD方法制備，純度為90%，直徑為40～50nm，長度為5～15μm.表面沉積納米CNx薄膜前，將MWCNTs的水懸浮液噴涂在直徑15mm、厚度0.5mm的圓形SiO2基片上，噴涂過程和具體參數(shù)見參考文獻[21，23].

單面覆著MWCNTs的基片經(jīng)高真空離子束輔助沉積系統(tǒng)（ion beam assisted deposition，IBAD）于其表面沉積CNx薄膜，并通過改變實驗中輔助槍束流的大小（5、15和25mA）達到調(diào)節(jié)碳氮膜中N/C比的目的.沉積過程中濺射氣體選用高純度氬氣和氮氣，濺射靶材為石墨靶（純度為99.9%），本底真空為1.9×10-4Pa，工作氣壓保持在 1.2×10-2～1.3×10-2Pa，加速電壓為200V，放電電壓為70V，濺射能量為1.05keV，濺射束流25mA，N離子輔助能量為200eV[21，23].

1.2 結構和成分特征測試

使用JOEL JEM2100型透射電子顯微鏡觀察改性前后單根MWCNTs的表面形貌；使用PHI5000型X線能譜儀（1486.6eV的AlKα射線源）檢測CNx薄膜中N和C原子百分比；使用Renishaw micro-Raman 2000型顯微拉曼光譜儀（A+離子激光器的掃描波長為514nm，橫向空間分辨率為0.5μm，縱向空間分辨率為2μm，波數(shù)掃描范圍為40～3 200cm-1）分析修飾前后MWCNTs的原子組態(tài)；使用CAM KSV021733型光學接觸角測量儀測試樣品的水接觸角.

1.3 細胞相容性測試

本研究在材料表面種植國標GBT1688.6-2003小鼠成纖維細胞系L929[24]和在血管形成、組織生長過程中起重要作用的內(nèi)皮細胞株EAhy926，在1個生長周期內(nèi)，通過體外觀察材料對細胞黏附和生長的影響，研究MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs的細胞相容性.取滅菌后的MWCNTs樣品18個，沉積CNx膜的MWCNTs樣品（CN0.20、CN0.21和 CN0.27）每種各 18個，6個為一組，分成3組（3次重復實驗）；將已培養(yǎng)48h、生長旺盛的L929細胞制成2×104個/mL細胞濃度的細胞懸浮液（細胞存活率96%），5×104個/mL的人內(nèi)皮細胞懸浮液（細胞存活率97%）使用移液槍等量（700μL）滴加在樣品表面.在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每種樣品各取出1片在掃描電鏡下觀察材料表面L929和 E926細胞的形貌；并在 0.5、1、2、3、5和 7d時，每組樣品各取1孔，用胰蛋白酶消化，將消化下來的細胞用臺盼藍染色，對活細胞進行計數(shù)，繪制生長曲線.

取健康新西蘭兔耳動脈血，加入抗凝劑，并按體積比1∶1與生理鹽水稀釋，制成抗凝血溶液.取抗凝血溶液滴加在滅菌后的MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs樣品（CN0.20、CN0.21和 CN0.27）表面，每個樣品700μL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min后取出，掃描電鏡下觀察材料表面紅細胞形態(tài).取MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs樣品（CN0.20、CN0.21和 CN0.27）分別放入裝有5mL生理鹽水的錐形瓶中；另取錐形瓶，加入5mL生理鹽水和5mL蒸餾水，分別作為陰性和陽性對照組.每只錐形瓶中再加入50μL的抗凝血溶液，搖勻，使混合液充分與樣品接觸并相互作用，在（37±1）℃下水浴60min，最后將樣品組和對照組的溶液分別移至離心管中，離心15min，觀察離心管內(nèi)溶液.

2 結果與討論

文獻[22]已報道，沉積納米碳氮膜的MWCNTs中N含量受輔助槍束流大小的影響，對應輔助槍束流為5、15和25mA，N元素含量依次為17.04%、21.34%和17.54%，換算成N、C兩原子的比例（N/C）依次為0.20、0.27和 0.21，記作 CN0.20、CN0.27和 CN0.21.

為獲得制備樣品的結構特征，并直觀觀察到CNx薄膜的存在，在文獻[22]的基礎上，對MWCNTs和沉積CN0.27膜的MWCNTs進行透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察，結果如圖1所示.由圖1（a）可以看出，MWCNTs具有典型的同心管狀結構，單根MWCNTs內(nèi)徑約為8～10nm，管壁厚為10～15nm，外徑約為 40～50nm，管壁層次清晰.圖 1（b）顯示了沉積CNx膜后的MWCNTs，圖中白色方框內(nèi)的MWCNTs最外層管壁外側(cè)包覆有約10nm厚的涂層，結合XPS結果可知這層薄膜即為沉積在MWCNTs表面的CNx膜.由圖1（b）還可以看出，CNx膜的厚度并不均勻，有些單根MWCNTs外側(cè)包覆的薄膜較薄，有些MWCNTs甚至未被包裹.這是因為被噴涂在基片上的MWCNTs具有一定厚度，沉積過程中只有表面裸露出的MWCNTs能夠接受到來自濺射源的低能粒子，故CNx膜僅在MWCNTs裸露部分沉積.同時，TEM觀測到CNx膜層的最大厚度不超過10nm，因此只能包裹在MWCNTs表面，在MWCNTs與細胞接觸時發(fā)揮作用，并不會影響MWCNTs噴涂在SiO2基片后形成的宏觀多孔型支架結構.

圖1 MWCNTs TEM圖Fig.1 TEM images of MWCNTs

圖2為沉積CNx膜前后，碳納米管在低頻率波數(shù)范圍內(nèi)采點的顯微Raman光譜圖.從圖2中可以看到，MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs均在1350cm-1、1580cm-1和2700cm-1附近位置出現(xiàn)典型的峰.一般情況下，碳材料的拉曼活動模式包括2個峰：一個是由石墨或CNTs的布里淵區(qū)K點附近的光學聲子模產(chǎn)生的D峰（1350cm-1附近）；另一個來自Γ點的振動，對應E2g對稱性的光學聲子模G峰（1580cm-1附近）.同時，由于激發(fā)的電子被有相同能量但相反波矢的聲子2次散射，在2700cm-1附近會產(chǎn)生D峰的二階峰（D*峰）.對于完整晶體，G峰和D*峰均是拉曼活性的，而D帶則是被禁戒的.當有缺陷存在時，D*模被激活.如果G峰或D*峰的強度與缺陷無關，則可以用D峰相對于G峰或D*峰的強度（ID/IG或ID/ID*）標定石墨或碳納米管樣品的無序程度和缺陷密度[25].一般文獻都采用ID/IG描述缺陷大小[26-27].由圖2可以發(fā)現(xiàn)，由于MWCNTs表面沉積了CNx薄膜，引入的N元素改變了MWCNTs的缺陷度，當N/C比為0.21時，ID/IG的比值最高，缺陷度最大.

圖2 MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs的拉曼光譜圖Fig.2 Raman spectra of MWCNTs with and without CNxcoatings

文獻[22]已報道了MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs的親水性.純MWCNTs的水接觸角為139.96°，疏水性極強.而經(jīng)IBAD表面沉積CNx后，親水性得到了極大改善，3種沉積CNx薄膜的MWCNTs均轉(zhuǎn)化為親水材料，說明在改善MWCNTs親水性方面實驗達到了預期目標.同時，可以發(fā)現(xiàn)親水性的改變規(guī)律與Raman結果相關，沉積CN0.21膜的MWCNTs缺陷度最大（接觸角平均值為33.12°），親水性最強.相反，含氮量最高的沉積CN0.27膜的MWCNTs的親水性反而較高（接觸角平均值為55.69°）.一些研究表明，細胞更易在接觸角為60～90°的中等濕潤表面黏附增殖[28-31].所以，從接觸角結果可以推測出沉積CNx膜的MWCNTs的細胞相容性將得到提高，且N/C比值的高低會對材料的細胞相容性產(chǎn)生影響.

圖3為培養(yǎng)24h后，掃描電鏡下MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs表面黏附的小鼠成纖維細胞和人內(nèi)皮細胞的形態(tài).從圖3可以看出，MWCNTs表面黏附的L929和E926細胞數(shù)目均明顯少于沉積CNx膜的MWCNTs，這說明在材料與細胞接觸初期，潤濕且親水性較強的表面更適于細胞黏附.沉積CN0.27膜的MWCNTs表面黏附細胞數(shù)目最多，說明L929和E926細胞更容易在N含量高、中等濕潤的材料表面黏附.同時，放大2500倍的SEM照片清晰地顯示出，沒有沉積CNx膜的MWCNTs表面黏附的單個細胞形態(tài)略微隆起，呈長條狀或橢圓狀，偽足細小，這說明細胞與材料結合并不牢固，細胞的分裂、增殖能力較差，如圖 3（a）和圖 3（d）所示.而沉積 CNx膜 MWCNTs表面的細胞形態(tài)扁平，呈三角狀，偽足長且粗壯，細胞形態(tài)伸展，如圖 3（b）、圖 3（c）、圖 3（e）和圖 3（f）所示.這說明在細胞與材料接觸初期，沉積CNx膜的MWCNTs對細胞無毒副作用，2種細胞在其表面生長旺盛，已準備好進一步的分裂增殖.初步判斷，沉積CNx膜的MWCNTs具有優(yōu)于未沉積CNx膜MWCNTs的細胞相容性.

圖3 （a～c）小鼠成纖維細胞，（d～f）人內(nèi)皮細胞黏附在材料表面的SEM圖Fig.3 SEM images of the（a～c）mouse fibroblast cells，（d～f）human endothelial cells adhered on samples

為驗證SEM的結果并觀察材料與細胞長期作用的效果，在1個細胞周期內(nèi)，對黏附在MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs表面的L929小鼠成纖維細胞進行細胞計數(shù)，繪制成生長曲線如圖4所示.

圖4 MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs上的L929成纖維細胞數(shù)量隨培養(yǎng)天數(shù)的變化情況Fig.4 L929mouse fibroblast cell numbers on MWCNTs with and without CNxcoating vs.incubation time

由圖4可以看出，L929細胞自第3 d開始大量分裂增殖，沉積CNx膜MWCNTs表面的細胞數(shù)目明顯高于MWCNTs，第5d，沉積CNx膜的MWCNTs表面的細胞數(shù)已超過對照組.沉積CN0.27膜的MWCNTs在第7d時也達到了空白對照組的細胞數(shù)目，并在其他組細胞進入衰亡期后依舊保留強勁增長趨勢.總體來看，L929細胞在沉積CNx膜的MWCNTs表面生長和增殖情況良好，整個生長周期內(nèi)明顯超越普通MWCNTs，與用于細胞培養(yǎng)的24孔板（空白組）上的細胞增殖情況不相上下.這說明在MWCNTs表面沉積納米CNx薄膜可以有效提高MWCNTs的細胞相容性，且較高的N/C比有利于細胞相容性的增強.這是因為在體外當細胞與材料相接觸時，材料的親疏水性對體液和細胞表面蛋白與材料表面相互作用具有重要影響[32].在Groth和Altankov[33-34]進行的一系列親水、疏水材料與細胞作用界面吸附蛋白（FN，V N等）及其受體功能方面的研究中發(fā)現(xiàn)，細胞更好地生長于親水性材料表面，其原因在于親水表面吸附蛋白的數(shù)目、構型和重組能力不同.相較于MWCNTs，沉積CNx膜的MWCNTs的親水性提高非常明顯，當其與細胞接觸時，細胞更容易黏附在功能化的MWCNTs表面.而且，沉積的CNx薄膜中富含N元素，N元素的存在對提高材料細胞相容性具有積極作用.

圖5顯示了兔血紅細胞黏附在MWCNTs和沉積CNx膜MWCNTs表面上的形態(tài).圖5（a）所示的黏附在MWCNTs上的血紅細胞存在大量變形，只有少數(shù)紅細胞保持了原有的圓餅狀，說明MWCNTs對于血紅細胞具有一定的毒副作用.而在MWCNTs上沉積CNx薄膜后，紅細胞的變形明顯被抑制，尤其是當覆蓋的CNx薄膜中N/C比較高（N/C=0.27）時，幾乎看不到紅細胞的變形，絕大多數(shù)紅細胞呈現(xiàn)出健康的圓餅狀形態(tài).這說明沉積CNx膜的MWCNTs具有良好的紅細胞相容性，且較高的N/C比可提高紅細胞的相容性.

圖5 兔血紅細胞黏附在材料表面的SEM圖Fig.5 SEM images of the rabbit blood cells adhered on samples

除了觀察紅細胞的形變之外，對其與材料接觸后的破損狀態(tài)也進行了實驗測試，結果如圖6所示.

圖6 材料與兔血作用及離心后照片F(xiàn)ig.6 Images of the centrifugal rabbit blood cells adhered on samples

圖6中，紅細胞在生理鹽水中無破損，細胞中的血紅素沒有釋放出來，所以離心后試管底部沉淀的紅細胞形成1個紅色圓斑，上清液完全透明；而蒸餾水會破壞紅細胞的滲透壓，導致紅細胞破裂，釋放出血紅素，因而陽性對照組離心后呈現(xiàn)出紅色溶液狀.根據(jù)與MWCNTs和沉積CNx膜的MWCNTs充分作用1h后溶液的顏色即可判斷該材料是否會導致紅細胞破損.由圖6可以看出，MWCNTs和沉積CNx薄膜的MWCNTs均不會引起紅細胞的破裂，這與圖5掃描電鏡的觀察一致.結合小鼠成纖維細胞和兔血紅細胞黏附實驗的觀察結果可以說明：在MWCNTs表面沉積高N/C比的CNx薄膜既不會引起紅細胞破裂，也不會導致紅細胞變型，MWCNTs具有良好的細胞相容性.

3 結論

本研究采用IBAD方法在MWCNTs表面沉積不同N/C比的納米CNx薄膜，通過一系列細胞實驗證實：沉積CNx膜的MWCNTs具有優(yōu)于MWCNTs的細胞相容性，小鼠成纖維細胞和人內(nèi)皮細胞在沉積CNx膜的MWCNTs表面形態(tài)扁平、偽足粗壯，生長增殖旺盛，且黏附其上的兔血紅細胞也無破損，這說明改性后MWCNTs材料的中等濕潤性表面有利于細胞相容性的提高.同時，通過對比3種不同N/C比的沉積CNx膜的MWCNTs的細胞相容性可知，N元素的存在對細胞相容性提高具有積極的促進作用，含氮量最高的沉積CN0.27的MWCNTs表面因其接觸角為55.69°，更適宜細胞在其表面黏附增殖，所以具有最強的促進細胞增殖能力，對細胞毒性最小.使用離子束輔助沉積方法，通過調(diào)節(jié)轟擊能量、束流大小等實驗條件可以調(diào)節(jié)CNx膜中N/C比達到最大值，使MWCNTs具有最優(yōu)的細胞相容性，該方法在生物醫(yī)用材料改性方面具有良好的發(fā)展前景和應用價值.

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