片仔癀調(diào)控ABCC1抑制大腸癌HCT-8／5-FU細(xì)胞藥物外排功能的作用機(jī)制研究

黃進(jìn)明，沈阿靈，李瓊瑜，齊 飛，洪 緋，陳宏偉，褚劍鋒，林久茂，洪振豐，彭 軍

（1.漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建漳州363000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

片仔癀調(diào)控ABCC1抑制大腸癌HCT-8／5-FU細(xì)胞藥物外排功能的作用機(jī)制研究

黃進(jìn)明1，沈阿靈2，李瓊瑜2，齊 飛2，洪 緋1，陳宏偉2，褚劍鋒2，林久茂2，洪振豐2，彭 軍2

（1.漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建漳州363000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州350122）

目的 探討片仔癀對(duì)大腸癌HCT-8／5-FU細(xì)胞對(duì)藥物外排功能的影響，并探討其機(jī)制。 方法MTT法檢測(cè)5-FU對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞和HCT-8細(xì)胞活力的影響和片仔癀對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞活力的影響；倒置顯微鏡觀察片仔癀對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞形態(tài)的影響；采用羅丹明染色通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)片仔癀對(duì)其在耐藥細(xì)胞內(nèi)蓄積的影響；RT-PCR檢測(cè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族重要成員ABCC1的表達(dá)。 結(jié)果 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度的5-FU干預(yù)可顯著降低HCT-8細(xì)胞活力，呈現(xiàn)一定的劑量依賴和時(shí)間依賴，而對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞活力未見(jiàn)影響。經(jīng)片仔癀干預(yù)后，HCT-8／5－FU細(xì)胞活力也受到顯著的抑制；形態(tài)學(xué)觀察表明：隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，體積縮小，出現(xiàn)懸浮、脫落而死亡；羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)顯示：片仔癀干預(yù)可顯著增加其在細(xì)胞內(nèi)的蓄積；RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明：經(jīng)片仔癀干預(yù)可顯著下調(diào)HCT-8／5-FU細(xì)胞ABCC1在mRNA水平的表達(dá)。 結(jié)論 片仔癀可抑制HCT-8／5-FU細(xì)胞生長(zhǎng)和藥物外排功能，通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCC1的表達(dá)是其重要機(jī)制之一。

片仔癀；大腸癌；逆轉(zhuǎn)耐藥；5-FU

大腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其死亡率已位于惡性腫瘤第二位，嚴(yán)重危害人類健康［1］。大腸癌的治療過(guò)程中所產(chǎn)生的多藥耐藥的現(xiàn)象是造成當(dāng)前化療失敗的最常見(jiàn)、最難解決的問(wèn)題。多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指在腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象［2］。腫瘤產(chǎn)生MDR的機(jī)制極其復(fù)雜，其中腫瘤細(xì)胞膜上的ATP結(jié)合盒式跨膜（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物外排是MDR產(chǎn)生的主要機(jī)制［4］。ABCC1基因編碼的多藥耐藥性相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated protein，MRP）是ABC（ATP binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的重要成員之一［5］，是目前研究的熱點(diǎn)。

我國(guó)傳統(tǒng)中藥具有療效高、靶點(diǎn)多、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)，在逆轉(zhuǎn)耐藥的同時(shí)有殺傷腫瘤細(xì)胞、調(diào)節(jié)和提高機(jī)體免疫功能的多重功效［6-7］。片仔癀（PZH）是傳統(tǒng)名貴中成藥，由三七、麝香、牛黃、蛇膽等組成，已有研究［8-9］證實(shí)：片仔癀對(duì)許多晚期癌癥患者能明顯改善疼痛，縮小瘤體，延長(zhǎng)生命，提高生活質(zhì)量。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)片仔癀對(duì)大腸癌細(xì)胞有明顯抑制作用，具有多靶點(diǎn)抗腫瘤活性，既可以直接殺傷腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分化，抑制腫瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)［10-16］，還可逆轉(zhuǎn)大腸癌耐藥［17］，但其逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制尚不明晰。故本文旨在探討片仔癀逆轉(zhuǎn)大腸癌5-FU耐藥的可能機(jī)制，進(jìn)一步闡明片仔癀抗大腸癌的分子機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物和細(xì)胞株 人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT-8／5-FU和HCT-8細(xì)胞購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；片仔癀片劑（漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：0908035）；5氟尿嘧啶（5-FU，美國(guó)sigma公司）

1.2 試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）、瓊脂糖、羅丹明（美國(guó)Life technology公司）；Trizol試劑盒、RT試劑盒、PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）；Goldview核酸染料（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司）；無(wú)水乙醇、氯仿（分析醇，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站）；磷酸鹽緩沖液（PBS，美國(guó)Hyclone公司）。

1.3 儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；ELX 800酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraeus公司）；IX70熒光倒置相差顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；9600型PCR儀（美國(guó)PE公司）；Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)、APC 300型電泳儀、水平式電泳槽（美國(guó)Bio-Rad公司）；5417R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）；低速普通離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；微調(diào)加樣器（德國(guó)Eppendorf公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物的配制 PZH溶液：配制前將片仔癀用研磨棒研成粉末，用PBS配制成20 mg／mL的溶液，超聲溶解，高壓滅菌后-20℃貯存?zhèn)溆谩?-FU溶液的配制：稱取適量5-FU粉末，溶解于DMSO配制成濃度為含1 M的5-FU溶液，超聲30 mim，分裝于-20℃貯存?zhèn)溆?。使用前置室?nèi)恢復(fù)室溫，用培養(yǎng)基配制成含5-FU培養(yǎng)液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用單層貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)，細(xì)胞用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液（含100 U／mL青霉素、100 μg／mL鏈霉素），置于37℃含5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入0.8 mL 0.25%胰蛋白酶消化，后加入2.4 mL的新鮮培養(yǎng)基終止消化后，1 000 rpm／min離心5 min，棄上清收集沉淀細(xì)胞，用完全培養(yǎng)液重懸制成新細(xì)胞懸液后傳代或接種。HCT-8／5-FU和HCT-8細(xì)胞分別用含或不含5-FU（15 μg／mL）培養(yǎng)液中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前或接板前改用不含5-FU的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞終濃度為0.8×105／mL接種于96孔板中，每孔100 μL。分別加入終濃度為25～800 μM的5-FU或0.25～0.75 mg／mL的片仔癀干預(yù)。以不加藥細(xì)胞作為對(duì)照組，細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)一定時(shí)間后，每孔加入0.5 mg／mL的MTT溶液100 μL，37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄去各孔中的MTT液體，加入DMSO各100 μL／孔，振蕩混勻，于全自動(dòng)酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定各組吸光度值（即A值），并按下列公式計(jì)算細(xì)胞活力［8］：

細(xì)胞活力／%＝（實(shí)驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值）× 100%。

2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察 HCT-8／5-FU細(xì)胞經(jīng)不同濃度片仔癀（0 mg／mL，0.25 mg／mL，0.5 mg／mL，0.75 mg／mL）干預(yù)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化并拍照（400×）。

2.5 羅丹明染色觀察細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排功能取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8／5-FU細(xì)胞，以2×105個(gè)／孔接種于六孔板，37℃培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的片仔癀干預(yù)，用胰酶消化成細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106／mL重懸于培養(yǎng)基中，10 mM羅丹明染液染色，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育10 min。用PBS清洗細(xì)胞2次，重懸細(xì)胞于PBS中，用流式細(xì)胞儀（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm）檢測(cè)熒光強(qiáng)度，判斷其在細(xì)胞內(nèi)的蓄集。

2.6 RT-PCR檢測(cè)ABCC1的mRNA表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-8／5-FU細(xì)胞，以2×105個(gè)／mL接種于六孔板，37℃培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的片仔癀干預(yù)24 h，用PBS洗清洗后每孔加入1 mL Trizol，按說(shuō)明書進(jìn)行RNA的抽提。采用逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，在體外進(jìn)行PCR的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系包括：cDNA1 μL上游引物，1 μL，1 μL下游引物，7 μL水及2×PCR Master Mix 10 μL，共20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸45 s，持續(xù)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，保存于4℃。ABCC1的引物序列為F：GTCGGGGCAT ATTCCTGGC；R：CTGAAGACTGAACTCCCTTCCT。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析后，置于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，以GAPDH為內(nèi)參基因。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果如圖1所示，經(jīng)不同濃度的5-FU干預(yù)48 h后，HCT-8細(xì)胞活力顯著降低，而HCT-8／5-FU細(xì)胞活力下降不明顯，二者比較具有顯著性差異（P＜0.05），可見(jiàn)HCT-8／5-FU細(xì)胞具有一定的耐藥性。如圖2所示，與對(duì)照組比較，經(jīng)不同濃度片仔癀（0 mg／mL、0.25 mg／mL、0.5 mg／mL、0.75 mg／mL）干預(yù)后，細(xì)胞活力顯著下降，具有顯著性差異（P＜0.05），并呈一定的劑量依賴。

圖1 不同濃度5-FU干預(yù)HCT-8／5-FU和HCT-8的細(xì)胞活力影響

圖2 不同濃度片仔癀干預(yù)對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞活力影響

3.2 不同濃度片仔癀對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞形態(tài)的影響 以不同濃度片仔癀干預(yù)24 h后，在倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組細(xì)胞均勻，核仁清楚，貼壁生長(zhǎng)，片仔癀干預(yù)后，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，體積縮小，甚至出現(xiàn)懸浮、脫落而死亡。

3.3 羅丹明染色檢測(cè)片仔癀對(duì)細(xì)胞藥物外排泵功能的影響 羅丹明染色檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。經(jīng)不同濃度的片仔癀干預(yù)后HCT-8／5-FU細(xì)胞中羅丹明熒光波峰右移，提示細(xì)胞內(nèi)熒光明顯增強(qiáng)，證實(shí)PZH可增加HCT-8／5-FU細(xì)胞中羅丹明的蓄積。3.4 片仔癀對(duì)ABCC1在mRNA水平表達(dá)的影響RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，以不同濃度PZH干預(yù)24 h后，與對(duì)照組比較，片仔癀能顯著下調(diào)ABCC1的mRNA水平的表達(dá)，提示通過(guò)下調(diào)ABCC1的表達(dá)可能是片仔癀抑制細(xì)胞外排功能的機(jī)制之一。

圖3 不同濃度片仔癀干預(yù)HCT-8／5-FU細(xì)胞的形態(tài)圖

圖4 不同濃度片仔癀對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞內(nèi)羅丹明蓄積的流式圖

圖5 不同濃度片仔癀干預(yù)后ABCC1的電泳圖

4 討 論

細(xì)胞表面存在具有能量依賴性“藥泵”功能的跨膜糖蛋白，能將細(xì)胞內(nèi)帶陽(yáng)性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)化療藥物達(dá)不到有效作用濃度而產(chǎn)生耐藥性。耐藥基因高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)化療藥物的外排增加是導(dǎo)致多藥耐藥產(chǎn)生的最重要機(jī)制之一。目前進(jìn)入臨床應(yīng)用研究的西藥逆轉(zhuǎn)劑仍因作用機(jī)制單一、選擇性差、毒副作用明顯等原因使得其臨床應(yīng)用受到了較大的限制，這也使得具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療作用的中藥備受關(guān)注。臨床和基礎(chǔ)研究均證實(shí)片仔癀可通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)轉(zhuǎn)到通路及其下游靶基因表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管新生、干細(xì)胞生長(zhǎng)和逆轉(zhuǎn)耐藥的作用［14-21］。本文通過(guò)檢測(cè)片仔癀對(duì)細(xì)胞外排功能和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族重要成員ABCC1的表達(dá)水平探討了片仔癀逆轉(zhuǎn)大腸癌的可能機(jī)制。MTT檢測(cè)結(jié)果表明：與其親本細(xì)胞相比，HCT-8／5-FU對(duì)5-FU具有一定的耐藥性，而不同濃度片仔癀作用下，細(xì)胞活力受到明顯抑制，并呈一定的劑量依賴。顯微鏡觀察進(jìn)一步證實(shí)了片仔癀對(duì)HCT-8／5-FU細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。羅丹明染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)了片仔癀干預(yù)可顯著增加羅丹明在HCT-8／5-FU細(xì)胞內(nèi)的蓄集，降低細(xì)胞外排功能。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：片仔癀干預(yù)可顯著下調(diào)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCC1在mRNA水平的表達(dá)，該結(jié)果提示：通過(guò)抑制下調(diào)ABCC1的表達(dá)降低細(xì)胞外排功能可能是片仔癀逆轉(zhuǎn)大腸癌多藥耐藥的機(jī)制之一。

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R285.5

：A

：1000-338X（2014）06-0051-03

2014-9-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373819）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2012M511437，2013T60636）

黃進(jìn)明（1966—），男，主要從事中藥的研發(fā)工作。

彭軍（1969—），男，教授，博士生導(dǎo)師。

E-mail：pjunlab@hotmail.com