神經(jīng)干細胞治療甲基丙二酸血癥繼發(fā)腦損傷4例臨床觀察

楊 輝，屈素清，劉衛(wèi)鵬，杜 侃，楊印祥，欒 佐

神經(jīng)干細胞治療甲基丙二酸血癥繼發(fā)腦損傷4例臨床觀察

楊 輝，屈素清，劉衛(wèi)鵬，杜 侃，楊印祥，欒 佐

目的觀察神經(jīng)干細胞治療甲基丙二酸血癥繼發(fā)腦損傷兒童的臨床療效。方法2008年4月—2010年10月在我院治療的甲基丙二酸血癥繼發(fā)腦損傷兒童4例，所有患兒均在磁共振頭皮定位下行側(cè)腦室穿刺神經(jīng)干細胞移植。移植后1個月對患兒綜合評估，并隨訪至移植后6個月，對患兒行Gesell發(fā)育量表評估。結(jié)果4例中，3例在移植后1個月內(nèi)出現(xiàn)大運動、精細動作、視聽反應(yīng)及智力反應(yīng)等方面的進步；跟蹤隨訪至移植后6個月，3例均持續(xù)出現(xiàn)不同程度進步。細胞治療均未出現(xiàn)不可逆不良事件。結(jié)論神經(jīng)干細胞治療安全可靠，能在短時間改善甲基丙二酸血癥繼發(fā)腦損傷患兒的運動和智力表現(xiàn)，并能持續(xù)至移植后6個月。在維持基礎(chǔ)對因治療的前提下，為甲基丙二酸血癥繼發(fā)腦損傷患兒提供了新的治療方法，但遠期療效有待進一步隨訪觀察。

甲基丙二酸血癥；腦損傷；細胞移植；神經(jīng)干細胞

甲基丙二酸血癥（methylmalonic acidemia，MMA）是有機酸代謝病中最常見的一種疾病，屬于常染色體隱性遺傳，發(fā)病率高，危害大［1-2］。其致病主要原因是甲基丙二酰輔酶A變位酶或其腺苷鈷胺的代謝缺陷所致。這使得體內(nèi)甲基丙二酸、丙酸、甲基枸櫞酸等有機酸異常蓄積，造成腦、肝、腎等多組織器官受損［3］，其中對腦造成的損傷常常導(dǎo)致智力運動發(fā)育落后、抽搐、反復(fù)嘔吐等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。然而，目前針對MMA的治療包括藥物治療、特殊飲食以及肝腎移植治療，均不能阻止腦損傷的進展，對其引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷尚無有效療法［4-5］。大量實驗表明，神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）在神經(jīng)修復(fù)方面有著確切的療效［6-8］。因此，本研究嘗試對確診為MMA且合并明確腦損傷的4例患兒進行側(cè)腦室內(nèi)NSCs移植，對治療后患兒進行臨床觀察，并對此治療的安全性及有效性進行評價和探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年4月—2010年10月在我科住院治療的4例MMA患兒資料，均為男性，年齡10個月至3歲3個月；確診時年齡2個月至2歲10個月，移植治療的時間為確診后經(jīng)常規(guī)治療4～12個月。其中，2例為第2胎第2產(chǎn)，1例明確有家族史。4例均在北京大學(xué)第一醫(yī)院行尿液氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及血液相串聯(lián)質(zhì)譜分析方法確診為MMA。診斷后給予維生素B12、左卡尼汀、甜菜堿等治療。移植前血尿甲基丙二酸控制穩(wěn)定。3例移植前已行常規(guī)康復(fù)訓(xùn)練治療，但均有明顯的智力、運動發(fā)育落后，Gesell發(fā)育量表評估均為重度缺陷；同時，頭顱MRI均提示腦損傷表現(xiàn)。4例移植前腦電圖均為異常范圍腦電圖，背景節(jié)律均較慢；其中3例有明顯的癲癇異常放電，2例有臨床表現(xiàn)（表1）。

表1 4例MMA患兒移植前一般資料

確診標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患兒串聯(lián)質(zhì)譜分析檢測血丙酰肉堿、氣相色譜-質(zhì)譜檢測尿有機酸譜等檢驗資料及臨床癥狀進行診斷；其中，血丙酰肉堿、丙酰肉堿／游離肉堿及丙酰肉堿／乙酰肉堿增高，尿甲基丙二酸、丙酸升高。

1.2 細胞獲取與移植方式

1.2.1 細胞獲取 取孕10～12周自然流產(chǎn)胚胎的前腦組織，所有胚胎均為自愿捐獻并簽署知情同意書，家族史、流行病史、遺傳性疾病、染色體疾病及感染性疾病病原學(xué)篩查均無異常，且通過海軍總醫(yī)院倫理委員會的倫理審查。

無菌條件下將組織用機械分散法制備成細胞懸液，接種于達爾伯克改良伊格爾／F12培養(yǎng)基，添加表皮生長因子20 ng／mL、成纖維細胞生長因子10 ng／mL、白血病抑制因子1 ng／mL，培養(yǎng)至第l4天，獲取生長旺盛的NSCs小集落，制成細胞懸液，臺盼藍拒染法計數(shù)活細胞量，移植前行細胞培養(yǎng)液污染檢測和神經(jīng)干細胞活性鑒定。

1.2.2 細胞移植 移植前患兒行血常規(guī)、凝血三項、免疫四項、血生化檢驗，心電圖、胸片及腦電圖檢查，無手術(shù)禁忌。所有患兒均由其法定監(jiān)護人簽署移植治療知情同意書。術(shù)前頭部備皮及消毒，氯胺酮基礎(chǔ)麻醉下，顱骨鉆鉆開顱骨，選擇沿目內(nèi)眥方向及外耳道假想連線方向進針；根據(jù)頭顱MRI影像頭皮定位，穿至右側(cè)側(cè)腦室前角后拔出針芯，見清亮腦脊液流出，后緩慢注射6.0×106／0.5 mL NSCs，注射完畢后拔針并壓迫包扎術(shù)區(qū)。術(shù)后平躺48 h，監(jiān)測生命體征。

1.3 移植后治療 移植后給予腦循環(huán)治療促進腦部血流循環(huán)，其余治療同移植前。

1.4 療效評估 對患兒進行移植前、移植后自身對照，記錄移植前、移植后1個月及6個月內(nèi)的變化，進行智力及運動功能評估，記錄發(fā)育各功能區(qū)（大運動、精細運動、應(yīng)物、應(yīng)人、語言）進步情況，同時對移植后1、6個月的發(fā)育情況進行追蹤隨訪分析。有效標(biāo)準(zhǔn)判斷：①患兒運動、智力表現(xiàn)有所進步；②根據(jù)患兒家長觀察及描述較移植前進步；③Gesell發(fā)育量表評估至少2個功能區(qū)進步大于3個月。

2 結(jié)果

2.1 移植療效 移植前4例經(jīng)維生素B12、左卡尼汀、甜茶堿等治療，嘔吐、精神委靡等酸中毒癥狀均已消失，基礎(chǔ)疾病控制良好；但康復(fù)訓(xùn)練后仍有明顯的智力及運動功能落后，進步緩慢。

4例中有3例于移植后1個月運動、智力出現(xiàn)改善。有的患兒精神及睡眠較移植前好轉(zhuǎn)、注意力集中、聽指令好轉(zhuǎn)等，有的表現(xiàn)為眼神靈活、對親人依戀、有主動表達意識、可提示家長二便、獨坐時間延長、翻身靈活、雙手精細動作好轉(zhuǎn)、獨站或扶走較移植前穩(wěn)等（表2）。移植后6個月對4例進行了隨訪，其中1例失訪，另3例在運動、語言及智力出現(xiàn)了飛躍性的進步。病例1智力及運動功能均較移植前有所進步，表現(xiàn)為獨坐較移植前穩(wěn)、可部分建立平衡、與家人有眼神交流、能手握筆亂畫、語言較前增多、聽智力好轉(zhuǎn)、清晰指示二便、會打招呼。病例2移植后6個月隨訪時雙手精細動作較前好轉(zhuǎn)，可捏取小豆子，會說“不，爸爸，dada”，眼神注視好，喚名字有反應(yīng)，但大運動仍落后于同齡兒童。病例4移植后6個月隨訪進步最為明顯，表現(xiàn)能獨立行走、體位轉(zhuǎn)換自如、能捏取、自行喂食、能串珠、聽懂指令、表達簡單要求、會叫“爸爸、媽媽”、與家人能簡單交流，而這些移植前均不能獨立完成；后家長自行回院復(fù)診，移植后2年運動功能仍有一定的進步，智力和語言進步不明顯，獨走穩(wěn)，會跑、欠穩(wěn)，雙手可用勺子吃飯、略狼藉，會明確表達二便，認識日常用品，會唱數(shù)至5，語言較前增多，智力測試提示中度缺陷。病例3移植后2個月失訪。移植后6個月隨訪患兒進行Gesell發(fā)育量表評估，月齡變化情況見表3。

表2 3例移植后1個月改善情況

表3 3例移植后6個月Gesell量表發(fā)育月齡變化情況（月）

2.2 移植的安全性 4例進行顱骨穿刺并側(cè)腦室NSCs移植，均操作成功。1例術(shù)后當(dāng)晚出現(xiàn)一過性發(fā)熱，給予物理降溫、協(xié)助飲水處理后體溫降至正常。另有1例術(shù)后出現(xiàn)嘔吐2次，當(dāng)時測血壓正常，無明顯其他不適，考慮與原發(fā)病及手術(shù)應(yīng)激相關(guān)，給予調(diào)整體位、補液對癥處理后未再出現(xiàn)嘔吐；術(shù)后第2天出現(xiàn)體溫一過性升高，物理降溫后未再復(fù)升。另外2例術(shù)后無明顯不適。4例術(shù)后均未發(fā)生不可逆的不良反應(yīng)。4例移植前及移植后1個月均要求進行視頻腦電圖檢查。2例移植后1個月時復(fù)查視頻腦電圖，其中1例見癲癇放電較移植前有所減少，另1例無明顯變化；另2例因患兒配合欠佳，家長拒絕復(fù)查。所有患兒移植后均無癲癇臨床發(fā)作。

3 討論

隨著診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，如血串聯(lián)質(zhì)譜分析、尿液氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析以及酶學(xué)和基因診斷等，使越來越多兒童的智力及運動發(fā)育落后明確了病因。其中甲基丙二酸血癥作為一種有機酸血癥，因其缺乏甲基丙二酰輔酶A變位酶及腺苷鈷胺，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物堆積［9］，造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷；尤其早期發(fā)病的患兒，可能出現(xiàn)廣泛的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，包括小頭畸形、腦積水、肌張力低下以及認知障礙、癲癇發(fā)作，預(yù)后欠佳，嚴(yán)重影響患兒的生活質(zhì)量和總體預(yù)后［10］。研究表明，MMA可引起患兒腦發(fā)育的延遲及損傷，MRI可表現(xiàn)為腦外間隙增寬、胼胝體發(fā)育不良、腦白質(zhì)容積減少、腦白質(zhì)髓鞘化延遲、基底節(jié)損害等［11］。而本研究中4例移植前頭顱MRI表現(xiàn)與之相符，均有不同程度的腦損傷表現(xiàn)，臨床上也出現(xiàn)明顯的智力及運動功能落后。目前，臨床上主要為合并同型半胱氨酸血癥和維生素B12無效型，而針對MMA的治療主要有特殊飲食及藥物治療。因我國大部分MMA患兒為MMA合并同型半胱氨酸血癥，一般無需特殊飲食，診斷明確后給予口服或肌內(nèi)注射維生素B12、口服左卡尼汀及甜菜堿治療，針對維生素B12有效型效果尚可帶來一定進步；但對已造成的顱腦損傷不能逆轉(zhuǎn)，且不能阻止其腦損傷的進展。維生素B12無效型預(yù)后更差，起病早，神經(jīng)系統(tǒng)損傷更為嚴(yán)重，很多在1歲內(nèi)夭折［12］。本研究中4例均合并同型半胱氨酸血癥，4例診斷后經(jīng)藥物治療，血尿代謝指標(biāo)均已達正常水平，但智力及運動功能已明顯落后，進行NSCs移植治療前3例已行訓(xùn)練等輔助治療，Gesell發(fā)育量表測定均提示各功能區(qū)重度缺陷。

因此，根據(jù)MMA對患兒神經(jīng)系統(tǒng)損傷的嚴(yán)重性，且目前藥物及飲食控制無特效治療，使得不斷尋求新的治療方法和手段來改善患兒預(yù)后。NSCs在體內(nèi)和體外的動物實驗均已證明了其治療神經(jīng)損傷的巨大潛力，可用于各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化癥、實驗性自身免疫性腦脊髓炎、脊髓損傷、腦卒中、創(chuàng)傷性腦損傷及嚴(yán)重肢體缺血等治療［13-16］。我科從2005年起開始了NSCs治療兒童多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床觀察，并進行了相關(guān)的實驗和研究，NSCs應(yīng)用于新生兒中毒缺氧缺血性腦損傷、新生兒重度一氧化碳中毒、腦性癱瘓、廣泛性發(fā)育障礙等疾病治療，且結(jié)果提示有一定療效［17-20］。在長期的臨床觀察中，對于神經(jīng)傷殘患兒，NSCs移植可在一定程度上對患兒的智力及運動功能有改善的作用。2005年美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)開展人胎腦NSCs腦內(nèi)移植治療小兒Batten綜合征，研究（NCT00337636）表明，該方法具有良好的安全性，移植細胞能植入并長期存活，提高生存率［21］。本研究針對已明確合并智力及運動發(fā)育落后的MMA患兒進行了NSCs腦內(nèi)移植治療，進行自身移植前、移植后對照，觀察其神經(jīng)修復(fù)作用及臨床的改善。

目前，NSCs移植治療神經(jīng)傷殘作用機制仍未明，可能包括NSCs的替代效應(yīng)及因子效應(yīng)。移植入體內(nèi)的NSCs在受者體內(nèi)進行增殖、遷移和分化，且刺激內(nèi)源性NSCs動員起來，遷移到受損傷區(qū)域發(fā)揮作用；同時，NSCs及其分化的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細胞能夠自分泌和旁分泌如神經(jīng)生長因子、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、胰島素生長因子1等，起到神經(jīng)營養(yǎng)及促進神經(jīng)再生的作用。本研究MMA患兒代謝產(chǎn)物堆積導(dǎo)致神經(jīng)受損，移植入腦內(nèi)的NSCs遷移分化并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子起到神經(jīng)修復(fù)作用，是其改善的可能原因。由于干細胞發(fā)揮療效的機制更多認為是其因子效應(yīng)，即使替代效應(yīng)也多在移植后6個月左右完成。既往研究也提示1次干細胞治療療效多持續(xù)6個月左右［18-20］，本組病例4移植6個月后進步緩慢也證實這點。因此，本組研究未進行較長時間的隨訪，但對如何提高長期療效是我們今后需要不斷探索和改進的?？傊谆嵫Y繼發(fā)性腦損傷導(dǎo)致智力及運動發(fā)育落后，除對因治療外，還應(yīng)更加關(guān)注患兒的發(fā)育情況，如進行康復(fù)訓(xùn)練、營養(yǎng)神經(jīng)及抗癲癇等治療，在傳統(tǒng)治療效果欠佳的情況下，NSCs移植不失為治療的另一種選擇。

［1］Vatanavicharn N，Champattanachai V，Liammongkolkul S，et al.Clinical and molecular findings in Thai patients with isolated methylmalonic acidemia［J］.Mol Genet Metab，2012，106（4）：424-429.

［2］Han L，Han F，Ye J，et al.Spectrum analysis of common inherited metabolic diseases in Chinese patients screened and diagnosed by tandem mass spectrometry［J］.J Clin Lab Anal，2014［Epub ahead of print］.

［3］王斐，韓連書.甲基丙二酸血癥診治研究進展［J］.臨床兒科雜志，2008，26（8）：724-727.

［4］Nyhan WL，Gargus JJ，Boyle K，etal.Progressive neurologic disability inmethylmalonic acidemia despite transplantation of the liver［J］.Eur JPediatr，2002，161（7）：377-379.

［5］Lubrano R，Elli M，Rossi M，et al.Renal transplant in methylmalonic acidemia：could it be the best option？Report on a case at10 years and review of the literature［J］. Pediatr Nephrol，2007，22（8）：1209-1214.

［6］Bachoud-Lévi AC，Gaura V，Brugières P，etal.Effectof fetal neural transplants in patientswith Huntington′s disease 6 years after surgery：a long-term follow-up study［J］.Lancet Neurol，2006，5（4）：303-309.

［7］Seledtsov VI，Kafanova MY，Rabinovich SS，et al.Cell therapy of cerebral palsy［J］.Bull Exp Biol Med，2005，139（4）：499-503.

［8］Wei P，Liu J，Zhou HL，et al.Effects of engrafted neural stem cellsderived from GFP transgenicmice in Parkinson′s disease rats［J］.Neurosci Lett，2007，419（1）：49-54.

［9］Stark RJ，Naik-Mathuria BJ，Lam FW，et al.Extracorporeal membrane oxygenation support of a severemetabolic crisis in a child with methylmalonic acidemia［J］.ASAIO J，2012，58（4）：438-439.

［10］Carrillo-Carrasco N，Venditti CP.Combined methylmalonic acidemia and homocystinuria，cblC type.Ⅱ.Complications，pathophysiology，and outcomes［J］.J Inherit Metab Dis，2012，35（1）：103-114.

［11］李素榮，袁新宇，朱彥麗，等.兒童甲基丙二酸血癥顱腦常規(guī)MRI影像分析［J］.臨床放射學(xué)雜志，2006，25（12）：1143-1146.

［12］張建明，邵新華，宋小青，等.遺傳性代謝病致兒童腦發(fā)育落后的治療與預(yù)后［J］.臨床兒科雜志，2008，26（12）：1016-1020.

［13］Reekmans K，Praet J，Daans J，etal.Current challenges for the advancementof neural stem cellbiology and transplantation research［J］.Stem Cell Rev，2012，8（1）：262-278.

［14］Mathieu P，Battista D，Depino A，etal.Themore you have，the less you get：the functional role of inflammation on neuronal differentiation of endogenous and transplanted neural stem cells in the adult brain［J］.J Neurochem，2010，112（6）：1368-1385.

［15］Carletti B，Piemonte F，Rossi F.Neuroprotection：the emerging conceptof restorative neural stem cell biology for the treatment of neurodegenerative diseases［J］.Curr Neuropharmacol，2011，9（2）：313-317.

［16］Katare R，Stroemer P，Hicks C，et al.Clinical-grade human neural stem cells promote reparative neovascularization in mouse models of hindlimb ischemia［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2014，34（2）：408-418.

［17］屈素清，欒佐，尹國才，等.新生鼠缺血缺氧性腦損傷后經(jīng)腦室人神經(jīng)干細胞移植的實驗研究［J］.中華兒科雜志，2005，43（8）：576-579.

［18］欒佐，尹國才，胡曉紅，等.人神經(jīng)干細胞移植治療重度新生兒缺氧缺血性腦病一例［J］.中華兒科雜志，2005，43（8）：580-584.

［19］Luan Z，LiuW，Qu S，etal.Effects ofneural progenitor cell transplantation in children with severe cerebral palsy［J］. Cell Transplant，2012，21 Suppl 1：S91-S98.

［20］劉衛(wèi)鵬，王君，屈素清，等.人神經(jīng)前體細胞移植治療兒童廣泛性發(fā)育障礙初探［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2013，15（10）：860-865.

［21］A service of the U.S.National Institutes of Health［EB／OL］.（2013-10-15）［2014-04-30］.http：／／www.clinicaltrials.gov.

Clinical observation of neural stem cells in treatment of 4 patients with methylmalonic acidemia secondary to brain injury

YANG Hui，QU Suqing，LIUWeipeng，DU Kan，YANG Yinxiang，LUAN Zuo

（Department of Pediatrics，Navy General Hospital，Beijing 100048，China）

ObjectiveTo observe the neural stem cell therapeutic effectwithmethylmalonic acidemia（MMA）secondary to brain injury.MethodsFrom April2008 to October 2010，4 patients with methylmalonic acidemia secondary to brain injury admitted to our hospital.All the patients received the neural stem cell transplantation via ventricle puncture positioned by MRI，and all the patientswere given a follow-up at 1 month and 6 month after the transplantation with Gesell scales assessment.ResultsThree of the four patients got improvements inmotor and fine skills，visual and intellectual reactions after the transplantation within 1 month.In the following 6 months the continuing improvements could be observed after the transplantation among the 3 patients.Cell therapy did not appear irreversible adverse events.ConclusionNeural stem cell therapy is safe and reliable，it can improve the clinicalmanifestations in children with methylmalonic academia secondary to brain injury in a short time.The efficacy can sustain to 6 months after the transplantation.On the basis of the treatment for the cause，the neural stem cell transplantation provides a new method of treatment formethylmalonic acidemia secondary to brain injury.But the long-term effect needs a further followup observation.

Methylmalonic acidemia；Brain injury；Cell transplantation；Neural stem cells

R725.8；R45

B

2095-3097（2014）04-0212-04

10.3969／j.issn.2095-3097.2014.04.006

2014-05-28 本文編輯：徐海琴）

科技部國際合作專項項目（2012DFA30880）

100048北京，海軍總醫(yī)院兒科（楊 輝，屈素清，劉衛(wèi)鵬，杜 侃，楊印祥，欒 佐）

欒 佐，E-mail：luanzuo＠aliyun.com