胃腸道間質(zhì)瘤中c-kit和PDGFRA基因突變多態(tài)性分析

田玉旺，許春偉，高文斌，張玉萍，石明偉，亓崠東

胃腸道間質(zhì)瘤(gastrointestinal stomal tumors，GIST)是胃腸道最常見的原發(fā)性間葉性腫瘤［1-2］。GIST免疫組化一般為CD117胞膜陽性、胞質(zhì)彌漫陽性或核周陽性，表型與Cajal細(xì)胞分化相同［3］，大部分病例具有c-kit或PDGFRA活化突變，并相互獨(dú)立地獲得傳導(dǎo)性激活。即在無配體結(jié)合的情況下，ckit或PDGFRA蛋白仍然能保持持續(xù)的自身酪氨酸蛋白激酶活性，從而激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路［4-6］。其基因功能獲得性突變被認(rèn)為是GIST發(fā)病的主要機(jī)制［7］。目前對(duì)GIST中c-kit或PDGFRA基因的突變率、基因突變與生物學(xué)行為的關(guān)系報(bào)道不一［8-11］，而臨床體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均已證明伊馬替尼對(duì)GIST的療效與有無基因突變及突變位點(diǎn)和類型密切相關(guān)［12-13］，因此對(duì)GIST相關(guān)基因突變進(jìn)行研究具有重要的臨床意義。本研究通過PCR擴(kuò)增、測(cè)序法獲得基因突變類型，分析GIST患者相關(guān)基因突變情況，為判斷疾病發(fā)展過程、預(yù)后及伊馬替尼靶向治療提供分子病理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源:收集北京軍區(qū)總醫(yī)院、大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院和山東省濰坊市人民醫(yī)院2007～2013年病理診斷為GIST并行c-kit和PDGFRA基因檢測(cè)的標(biāo)本共93份，93例中男53例，女40例;首發(fā)年齡23～83歲，中位年齡57歲;腫瘤直徑5～45 cm，中位直徑8.7 cm;原發(fā)病變部位:胃71例(76.34%)，十二指腸8例(8.60%)，直腸、食管各5例(5.38%)，回腸、結(jié)腸、胸膜、宮腔各 1例(1.08%);依據(jù) Fletcher等［14］方案危險(xiǎn)度分級(jí):極低度和低度侵襲危險(xiǎn)41例，中度侵襲危險(xiǎn)17例，高度侵襲危險(xiǎn)35例。每例標(biāo)本由3名病理醫(yī)師復(fù)查。

1.1.2 GIST納入標(biāo)準(zhǔn):常規(guī)形態(tài)符合GIST診斷要點(diǎn)，有85例免疫組化CD117為胞膜彌漫強(qiáng)陽性而確診，8例CD117陰性者中有3例DOG-1陽性而確診，其余5例因SMA、Desmin和S-100均陰性，排除了平滑肌源性和神經(jīng)源性腫瘤，形態(tài)符合GIST而納入本研究。

1.1.3 主要試劑和儀器:DNA提取試劑盒(德國QIAGEN公司)，核酸蛋白質(zhì)濃度測(cè)量?jī)xB-500(上海創(chuàng)萌生物科技有限公司)，CD117(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，克隆號(hào):YR145)，DOG-1(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，克隆號(hào):SP31)，SMA(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，克隆號(hào):IA4)，Desmin(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，克隆號(hào):ZC18)，S-100(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，克隆號(hào):4C4.9)，引物合成(上海英俊生物科技有限公司)，ABI9700PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色:所有標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4μm厚連續(xù)切片，60℃溫箱烘烤90 min。采用En-Vision二步法，試驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，高溫高壓抗原修復(fù)，DAB顯色，PBS代替一抗為陰性對(duì)照，已知陽性的結(jié)腸腺體組織為陽性對(duì)照。

1.2.2 引物設(shè)計(jì):c-kit基因和PDGFRA基因序列參照 GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，GenBank Accession:NC_000004和 NG_009250。引物由Primer及Oligo軟件設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn):引物擴(kuò)增片段大小190～270 bp，引物長(zhǎng)度17～25 bp，GC含量40%～70%，兩條引物的Tm值盡量接近。避免引物內(nèi)部或之間形成3 bp以上的互補(bǔ)序列。對(duì)其進(jìn)行BLAST檢查符合要求，并由上海英俊生物科技有限公司合成。c-kit和PDGFRA基因各外顯子引物序列見表1。

表1 c-kit和PDGFRA基因各外顯子引物序列

1.2.3 DNA提取:采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取病變組織DNA，將含有DNA組織的蠟塊連切5張10μm的厚蠟?zāi)?，?yán)格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行操作，并測(cè)定其純度和濃度備用。

1.2.4 PCR擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系(50μl):2×Taq PCR Master Mix 25μl;DNA模板2μl;上、下游引物各2μl(10 pmol);滅菌去離子水19μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5 min;94℃、30 s，56℃、45 s，72℃、1 min，共45 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，4℃冷卻5 min。滅菌去離子水代替模板作為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京金唯智生物科技有限公司純化并測(cè)序，有突變的標(biāo)本再行反向測(cè)序證實(shí)，確定基因突變類型。

2 結(jié)果

2.1 c-kit基因突變分析 93例GIST中共64例(68.82%)檢測(cè)到c-kit突變，均為CD117陽性，其中87.50%(56/64)為11號(hào)外顯子突變;6.25%(4/64)為9號(hào)外顯子突變;4.69%(3/64)為13號(hào)外顯子突變，其中1例與11號(hào)外顯子共突變;1.56%(1/64)為17號(hào)外顯子的突變，為與11號(hào)外顯子共突變。在 CD117陽性的病例中，c-kit突變比例達(dá)75.29%(64/85)。11號(hào)外顯子的突變中91.07%為雜合性突變(51/56)，僅8.93%(5/56)為純合性突變。檢測(cè)到的11號(hào)外顯子突變形式有:55.36%(31/56)缺失突變、26.79%(15/56)點(diǎn)突變、14.29%(8/56)插入突變(串聯(lián)重復(fù))和3.57%(2/56)伴有點(diǎn)突變的缺失突變(圖1)。62.50%(35/56)的突變集中在5＇端累及密碼子550～560的熱點(diǎn)區(qū)。最常見的形式為5＇端第557～558個(gè)密碼子WK(Trp-Lys)的缺失突變，占12.50%(7/56);其次為第559個(gè)密碼子V(Val)的缺失突變和Val突變?yōu)锳la的點(diǎn)突變(V575A)，均為7.14%(4/56)。14.29%(8/56)的GIST存在11號(hào)外顯子插入2～14個(gè)氨基酸的現(xiàn)象，包括5例3＇端的串聯(lián)重復(fù)序列(internal tandem duplications，ITD)和 3 例 5＇端的ITD，5例3＇端ITD患者中有2例為女性。6.25%(4/64)的GIST中檢出了c-kit 9號(hào)外顯子的突變，均為第502和503個(gè)密碼子編碼丙氨酸和酪氨酸(Ala-Tyr)的6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)插入(圖2)，其中3例為雜合性突變;3例位于十二指腸，1例位于胃部。僅4.69%(3/64)的GIST檢出了13號(hào)外顯子突變，3例均為第642個(gè)密碼子Lys突變?yōu)锳rg的點(diǎn)突變(K642R，圖3)。僅1.56%(1/64)的GIST中檢出了17號(hào)外顯子突變，此例為與11號(hào)外顯子第551～554個(gè)密碼子KPMY(Lys-Pro-Met-Tyr)的缺失突變共存的雙突變，即第820個(gè)密碼子由Asp突變?yōu)門yr的點(diǎn)突變(D820Y，圖4)。

2.2 PDGFRA基因突變分析 29例無c-kit突變的GIST中共檢測(cè)到4例PDGFRA突變，占總病例數(shù)的4.30%(4/93)和無c-kit突變病例的13.79%(4/29)，其中1例為伴c-kit突變11號(hào)外顯子第576個(gè)密碼子Leu突變?yōu)镻ro(L576P)的雙突變共存型，為18號(hào)外顯子第824個(gè)密碼子Val內(nèi)部GTC＞GTT堿基的同義點(diǎn)突變(圖5)。其余3例也均為18號(hào)外顯子突變，突變位點(diǎn)為第842個(gè)密碼子Asp突變?yōu)閂al的點(diǎn)突變(D842V)。4例除雙突變共存型外，其余3例均為CD117陰性病例。

3 討論

c-kit原癌基因定位于人染色體4號(hào)長(zhǎng)臂1區(qū)2和3帶(4q12-13)，其產(chǎn)物是Ⅲ型酪氨酸激酶生長(zhǎng)因子受體，編碼145 kD的跨膜糖蛋白酪氨酸激酶受體。c-kit基因具有21個(gè)外顯子，正常情況下c-kit的活化依賴配體干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)的觸發(fā)，使底物蛋白磷酸化激發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終激發(fā)重要的細(xì)胞功能，如增生、凋亡等，而突變后的c-kit基因可以不依賴配體而自動(dòng)磷酸化，細(xì)胞增生不可控，最終可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究者指出c-kit的基因功能獲得性突變(gain-of-function mutation)可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的核心事件［14］。其中在c-kit基因胞內(nèi)近膜結(jié)構(gòu)域的11號(hào)外顯子突變最為常見，由于各研究組用于提取DNA的組織、實(shí)驗(yàn)方法、病例構(gòu)成等不同，因而其突變率報(bào)道差異很大，為21% ～92%［13，15-18］。國外 3 組大樣本量的研究顯示，11號(hào)外顯子突變率分別為69.32%(296/427)、72.36%(233/322)和 51.50%(103/200)［15，19-20］。本研究為 60.22%(56/93)，與上述研究基本一致。

c-kit基因突變的第1個(gè)熱點(diǎn)是11號(hào)外顯子5＇端的點(diǎn)突變和框內(nèi)缺失，第2個(gè)熱點(diǎn)位于11號(hào)外顯子的3＇端，為框內(nèi)ITD。本組僅4例(4.30%)檢出了c-kit胞外結(jié)構(gòu)域的9號(hào)外顯子突變，與Lasota等［20］報(bào)道較大樣本突變率(3.00%，6/200)相近，但略低于 Corless 等［19］、Antonescu 等［21］和 Wozniak等［17］報(bào)道的7.26% ～10.84%。c-kit磷酸轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的17號(hào)外顯子突變非常少見，本組發(fā)現(xiàn)1例與11號(hào)外顯子共存的雙突變，突變位點(diǎn)為新發(fā)現(xiàn)的D820Y點(diǎn)突變。近來，對(duì)CD117陰性GIST的診斷較為困難，基因突變檢測(cè)是重要診斷手段之一，但檢測(cè)情況報(bào)道不一［22-23］。本資料中8例CD117陰性GIST中3例檢測(cè)出c-kit11號(hào)外顯子突變。

PDGFRA基因和c-kit基因位于人4號(hào)染色體的相鄰位置上，兩者的氨基酸序列有很高的同源性。PDGFRA總體突變率與來自中國臺(tái)灣、韓國的數(shù)據(jù)相近［17-18］，但低于西方患者數(shù)據(jù)［19］。Heinrich 等［4］發(fā)現(xiàn)，在無c-kit基因突變的GIST中存在PDGFRA基因的活化突變，也可能是GIST形成的機(jī)制之一。PDGFRA的信號(hào)傳導(dǎo)通路與c-kit基因相似，包含23個(gè)外顯子，其表型以上皮細(xì)胞型為主，其突變也可以產(chǎn)生自動(dòng)磷酸化，促發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)通路的瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得細(xì)胞生長(zhǎng)失控?zé)o序。本組4.30%(4/93)檢出了PDGFRA突變，其中1例為第824個(gè)密碼子Val內(nèi)部GTC＞GTT堿基的點(diǎn)突變，為與c-kit基因11號(hào)外顯子的共突變，其余3例為18號(hào)外顯子的點(diǎn)突變，占無c-kit表達(dá)病例的10.34%(3/29)，占CD117陰性病例的37.50%(3/8)。Tu等［24］曾報(bào)道過1例腎移植受者的胃腸道外間質(zhì)瘤PDGFRA第824個(gè)密碼子Val內(nèi)部GTC＞GTT堿基的同義點(diǎn)突變，但未見c-kit外顯子點(diǎn)突變。此研究為第2例報(bào)道PDGFRA第824個(gè)密碼子Val內(nèi)部GTC＞GTT堿基的同義點(diǎn)突變且為伴11號(hào)外顯子第576個(gè)密碼子Leu突變?yōu)镻ro(L576P)的雙突變共存型。

圖2 胃腸道間質(zhì)瘤c-kit 9號(hào)外顯子第502和503個(gè)密碼子編碼丙氨酸和酪氨酸的6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)插入(箭頭所示)

圖3 胃腸道間質(zhì)瘤c-kit 13號(hào)外顯子第642個(gè)密碼子Lys突變?yōu)锳rg的點(diǎn)突變(箭頭所示)

圖4 胃腸道間質(zhì)瘤c-kit 17號(hào)外顯子第820個(gè)密碼子由Asp突變?yōu)門yr的點(diǎn)突變(箭頭所示)

圖5 胃腸道間質(zhì)瘤PDGFRA 18號(hào)外顯子第824個(gè)密碼子Val內(nèi)部GTC＞GTT堿基的點(diǎn)突變(箭頭所示)

伊馬替尼是一種選擇性抑制BCR-ABL、PDGFRA和c-kit酪氨酸激酶活性的小分子制劑，臨床治療GIST很有效［25］?；蛲蛔兊奈恢煤托再|(zhì)能影響GIST對(duì)伊馬替尼的反應(yīng)［26］。研究發(fā)現(xiàn)c-kit 11號(hào)外顯子突變的GIST患者對(duì)伊馬替尼呈現(xiàn)良好的反應(yīng)，而9號(hào)外顯子突變者對(duì)伊馬替尼的反應(yīng)略差［27］。另一些體外和臨床研究已初步提示抑制劑對(duì)突變?cè)诩っ肝稽c(diǎn)的病例療效不明顯［28］，如c-kit 17號(hào)外顯子和PDGFRA 18號(hào)外顯子突變。但仍有30%PDGFRA突變的病例對(duì)伊馬替尼敏感的報(bào)道［28］。提示臨床應(yīng)重視 CD117陰性 GIST的診斷問題，以及應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)基因突變檢測(cè)判斷是否適用于伊馬替尼治療。另外，年齡較小的患者中可能有部分為兒童性GIST，其基因突變類型多為野生型，對(duì)伊馬替尼敏感性稍差［29］。

本研究對(duì)GIST患者進(jìn)行c-kit和PDGFRA基因突變的檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，c-kit突變主要集中于11號(hào)外顯子經(jīng)典熱點(diǎn)和3＇端熱點(diǎn)，PDGFRA基因突變主要見于CD117陰性GIST，并首次在國內(nèi)外報(bào)道了17號(hào)外顯子與11號(hào)外顯子原發(fā)同基因雙突變、ckit和PDGFRA基因雙突變共存型各1例。異基因雙突變共存型中PDGFRA 18號(hào)外顯子第824個(gè)密碼子Val內(nèi)部GTC＞GTT堿基的同義點(diǎn)突變目前也僅在國內(nèi)報(bào)道過1例。總之，大部分GIST均存在ckit或PDGFRA基因突變，其基因突變分型能指導(dǎo)伊馬替尼的腫瘤靶向治療。

［1］ Rubin B P，Heinrich M C，Corless C L.Gastrointestinal stromal tumour［J］.Lancet，2007，369(9574):1731-1741.

［2］ 錢鋒，胡新，劉佳佳，等.539例胃腸道間質(zhì)瘤的臨床分析［J］.中華消化外科雜志，2013，12(4):272-275.

［3］ Kwon JG，Hwang SJ，Hennig G W，et al.Changes in the structure and function of ICC networks in ICC hyperplasia and gastrointestinal stromal tumors［J］.Gastroenterology，2009，136(2):630-639.

［4］ Heinrich M C，Corless C L，Duensing A，et al.PDGFRA activating mutations in gastrointestinal stromal tumors［J］.Science，2003，299(5607):708-710.

［5］ Nedeljkovic SS，Wasan A，Jamison R N.Assessment of efficacy of long-term opioid therapy in pain patients with substance abusepotential［J］.Clin J Pain，2002，18(4 Suppl):S39-S51.

［6］ Joensuu H，Kindblom L G.Gastrointestinal stromal tumors——a review ［J］.Acta Orthop Scand Suppl，2004，75(311):62-71.

［7］ Heinrich M C，Rubin B P，Longley B J，et al.Biology and genetic aspects of gastrointestinal stromal tumors:KIT activation and cytogeneticalterations［J］.Hum Pathol，2002，33(5):484-495.

［8］ Lasota J，Jasinski M，Sarlomo Rikala M，et al.Mutations in exon 11 of c-Kit occur preferentially in malignant versus benign gastrointestinal stromal tumors and do not occur in leiomyomas or leiomyosarcomas［J］.Am J Pathol，1999，154(1):53-60.

［9］ Kim T W，Lee H，Kang Y K，et al.Prognostic significance of c-kit mutation in localized gastrointestinal stromal tumors［J］.Clin Cancer Res，2004，10(9):3076-3081.

［10］Corless C L，McGreevey L，Haley A，et al.KIT mutations are common in incidental gastrointestinal stromal tumors one centimeter or lessin size［J］.Am J Pathol，2002，160(5):1567-1572.

［11］賀慧穎，方偉崗，鐘鎬鎬，等.165例胃腸道間質(zhì)瘤中ckit和PDGFRA基因突變的檢測(cè)和臨床診斷意義［J］.中華病理學(xué)雜志，2006，35(5):262-266.

［12］Debiec Rychter M，Dumez H，Judson I，et al.Use of c-KIT/PDGFRA mutational analysis to predict the clinical response to imatinib in patientswith advanced gastrointestinal stromal tumours entered on phaseⅠandⅡstudies of the EORTC Soft Tissue and Bone Sarcoma Group［J］.Eur JCancer，2004，40(5):689-695.

［13］ Miettinen M，Lasota J.Gastrointestinal stromal tumors:review on morphology，molecular pathology，prognosis，anddifferential diagnosis［J］.Arch Pathol Lab Med，2006，130(10):1466-1478.

［14］ Fletcher CD，Berman J J，Corless C，et al.Diagnosis of gastrointestinal stromal tumors:A consensus approach［J］.Hum Pathol，2002，33(5):459-465.

［15］侯英勇，朱雄增.胃腸道間質(zhì)瘤的分子生物學(xué)研究［J］.腫瘤研究與臨床，2006，18(8):507-512.

［16］ Battochio A，Mohammed S，Winthrop D，et al.Detection of c-KIT and PDGFRA gene mutations in gastrointestinal stromal tumors:comparisonof DHPLC and DNA sequencing methods using a single population-based cohort［J］.Am JClin Pathol，2010，133(1):149-155.

［17］Wozniak A，Rutkowski P，Piskorz A，et al.Prognostic value of KIT/PDGFRA mutations in gastrointestinal stromal tumours(GIST):Polish Clinical GIST Registry experience［J］.Ann Oncol，2012，23(2):353-360.

［18］黨運(yùn)芝，高靜，李健，等.胃腸間質(zhì)瘤臨床病理特征與基因分型(附660例分析)［J］.中國實(shí)用外科雜志，2013，33(1):61-65.

［19］ Corless CL，F(xiàn)letcher JA，Heinrich M C.Biology of gastrointestinal stromal tumors［J］.J Clin Oncol，2004，22(18):3813-3825.

［20］ Lasota J，Wozniak A，Sarlomo Rikala M，et al.Mutations in exons 9 and 13 of KIT gene are rare events in gastrointestinal stromal tumors.Astudy of 200 cases［J］.Am JPathol，2000，157(4):1091-1095.

［21］Antonescu CR，Sommer G，Sarran L，et al.Association of KIT exon 9 mutations with nongastric primary site and aggressive behavior:KIT mutation analysis and clinical correlates of 120 gastrointestinal stromal tumors［J］.Clin Cancer Res，2003，9(9):3329-3337.

［22］ Medeiros F，Corless C L，Duensing A，et al.KIT-negative gastrointestinal stromal tumors:proof of concept and therapeutic implications［J］.Am J Surg Pathol，2004，28(7):889-894.

［23］ Tzen CY，Mau B L.Analysis of CD117-negative gastrointestinal stromal tumors［J］.World J Gastroenterol，2005，11(7):1052-1055.

［24］ Tu H，Li Q，Cai J，et al.Extragastrointestinal stromal tumor in a kidney transplant recipient［J］.Clin Exp Nephrol，2012，16(2):350-353.

［25］李健.胃腸道間質(zhì)瘤的分子靶向治療［J］.中華消化外科雜志，2013，12(4):253-256.

［26］ Nickl N J.Gastrointestinal stromal tumors:new progress，new questions［J］.Curr Opin Gastroenterol，2004，20(5):482-487.

［27］陳慧娟.c-kit和PDGFRA基因?qū)ξ改c間質(zhì)瘤的影響［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2009(8):697-701.

［28］賀慧穎，項(xiàng)一寧，李燕，等.胃腸道間質(zhì)瘤60例中c-kit和PDGFRA基因突變的檢測(cè)［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005，37(3):320-324.

［29］Kim SY，Janeway K，Pappo A.Pediatric and wild-type gastrointestinal stromal tumor:new therapeutic approaches［J］.Curr Opin Oncol，2010，22(4):347-350.