微柱凝膠檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)茵梔黃口服液中血型物質(zhì)的含量

馬印圖，李莉華，李玉秋，張 靜 ，宋俊貞

茵梔黃口服液為中成藥，治療黃疸和新生兒高膽紅素血癥效果明顯［1-2］，用于治療母嬰血型不合引起的新生兒溶血病(hemolytic disease of the new born，HDN)、減低夫婦血型抗體效價(jià)也取得了很好的效果，主要成分為茵陳、梔子、黃芩苷、金銀花等，具有清熱、解毒、利濕退黃的功效。文獻(xiàn)報(bào)道，茵陳、黃芩含有A(B)血型物質(zhì)，可在胎兒體內(nèi)與紅細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)抗體，對(duì)免疫性IgG抗體及免疫性抗體生成細(xì)胞均有抑制作用，以達(dá)到降低血型抗體效價(jià)、減少溶血對(duì)胎兒的影響來(lái)維持正常妊娠的目的［3-4］，但對(duì)血型物質(zhì)含量的檢測(cè)方法卻未見(jiàn)報(bào)道。微柱凝膠檢測(cè)技術(shù)(microcolumn gel technology assay，MGTA)是一種新的改良抗球蛋白試驗(yàn)技術(shù)，在國(guó)內(nèi)已逐步作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于輸血領(lǐng)域，并取得了很好的效果［5］。筆者所在科室應(yīng)用MGTA檢測(cè)茵梔黃口服液中血型物質(zhì)的含量，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與試藥 37℃孵育器(ID-Incubator 37SⅠ)、恒速專(zhuān)用離心機(jī)(ID-Centifuge 12SⅡ)、微柱凝膠抗人球蛋白卡均為達(dá)亞美公司生產(chǎn)，微量加樣器(芬蘭雷勃公司生產(chǎn))，人抗-A、抗-B血清、1%ABO試劑紅細(xì)胞均為解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院輸血科自制，茵梔黃口服液為北京雙鶴高科天然藥物有限責(zé)任公司生產(chǎn)(批號(hào):272503)。

1.2 檢測(cè)方法 嚴(yán)格按照有關(guān)血型抗體效價(jià)測(cè)定操作規(guī)程進(jìn)行操作［6］:取微柱凝膠抗人球蛋白卡2張，分別標(biāo)記“中和前抗體效價(jià)”和“中和后抗體效價(jià)”，分別取倍比稀釋好的“1．1”項(xiàng)下抗血清25μl滴加到相應(yīng)的標(biāo)記孔內(nèi)，將相應(yīng)的試劑紅細(xì)胞用0.9%氯化鈉注射液洗滌后用低離子強(qiáng)度溶液(Liss液)配成1%的細(xì)胞懸液，取50μl懸液加入標(biāo)記孔中，離心(1000 r/min)15 min，判讀結(jié)果，記為中和前抗體效價(jià);再取抗血清與茵梔黃口服液等量混合，37℃反應(yīng)1 h，判讀結(jié)果，記為中和后抗體效價(jià)。比較中和反應(yīng)前后抗-A、抗-B抗體效價(jià)的變化情況，抗體效價(jià)降低則間接表示茵梔黃口服液中含有血型物質(zhì)，效價(jià)無(wú)變化則表示其中不含血型物質(zhì)。

2 結(jié)果

茵梔黃口服液與抗-A、抗-B血清中和反應(yīng)前后抗-A抗體效價(jià)無(wú)變化，均為128，而抗-B抗體效價(jià)由中和反應(yīng)前的256降為128，證實(shí)茵梔黃口服液中含有B血型物質(zhì)，不含A血型物質(zhì)。

3 討論

血型物質(zhì)是人類(lèi)紅細(xì)胞特異性物質(zhì)，由多糖體和多肽類(lèi)組成，具有免疫反應(yīng)性而不具有免疫原性。采用中和抑制方法，在適當(dāng)溫度下血型物質(zhì)能與抗-A(B)抗體發(fā)生中和反應(yīng)而抑制抗體凝集。ABO血型物質(zhì)不僅存在于紅細(xì)胞內(nèi)，而且在組織細(xì)胞、體液、植物、蔬菜、細(xì)菌中也廣泛分布，某些中藥中也含有水溶性的血型物質(zhì)。細(xì)胞內(nèi)的血型物質(zhì)為脂溶性，可以通過(guò)相關(guān)試驗(yàn)測(cè)得。根據(jù)血型物質(zhì)能特異性地同相應(yīng)抗體結(jié)合的特點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)有無(wú)抗體結(jié)合及其效價(jià)的變化，可以間接判斷其中血型物質(zhì)的含量。傳統(tǒng)檢測(cè)血型物質(zhì)的方法是采用抗球蛋白試管法，即血型物質(zhì)首先與抗血清結(jié)合，阻止抗血清與相應(yīng)紅細(xì)胞的結(jié)合和凝集，根據(jù)抑制凝集的程度來(lái)判定血型物質(zhì)的含量。該操作步驟相對(duì)繁瑣、耗時(shí)，需要對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)洗滌后加入抗球蛋白試劑觀察凝集現(xiàn)象，結(jié)果判斷受人為因素影響較多，重復(fù)性較差;同時(shí)受洗滌過(guò)程的影響，抗體易被洗脫而出現(xiàn)假陰性。MGTA是利用抗原與相應(yīng)抗體的免疫特異反應(yīng)和微柱凝膠的分子篩作用，通過(guò)離心將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細(xì)胞阻滯于凝膠之上，未凝集的紅細(xì)胞通過(guò)凝膠間隙到達(dá)凝膠底部，從而區(qū)分有無(wú)凝集。此法實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰，無(wú)需用顯微鏡觀察，操作簡(jiǎn)單，省去了多次洗滌的繁瑣步驟，并且具有血清用量少、反應(yīng)靈敏度高、結(jié)果可反復(fù)觀察的優(yōu)點(diǎn)，尤其是抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果中各梯度的凝集強(qiáng)度清晰，與傳統(tǒng)的抗球蛋白試管法比較更能準(zhǔn)確檢測(cè)孕婦血液中的免疫性IgG 抗體和效價(jià)［7］。

母嬰血型不合引起的HDN由于缺乏有效的預(yù)防和治療藥物，導(dǎo)致死胎、新生兒膽紅素腦病發(fā)生率較高［8-9］。HDN基本病因是免疫性溶血反應(yīng)，通過(guò)抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)，K細(xì)胞Fc受體與致敏紅細(xì)胞IgG抗體結(jié)合導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂而溶血［10］。HDN的發(fā)生與患兒血型抗原的強(qiáng)弱、母體內(nèi)IgG抗-A(B)效價(jià)的高低、胎盤(pán)的屏障作用以及胎兒體液內(nèi)血型物質(zhì)的含量等因素有關(guān)，因可溶性血型物質(zhì)能中和抗-A(B)抗體，從而保護(hù)胎兒紅細(xì)胞不產(chǎn)生溶血反應(yīng)，起到阻止或緩解ABOHDN發(fā)生的作用。本研究采用MGTA檢測(cè)茵梔黃口服液中血型物質(zhì)的含量，該法敏感性高，特異性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，影響因素少，具有明顯的優(yōu)越性;檢測(cè)到茵梔黃口服液中含有B血型物質(zhì)，為早期干預(yù)治療母嬰血型不合引起的HDN提供了理論依據(jù)。

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