半夏藥材紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析

黃 濤，甫志錦，陳后江，藺 苗，楊永壽

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

半夏藥材紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析

黃 濤，甫志錦，陳后江，藺 苗，楊永壽*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：采用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法分析不同產(chǎn)地半夏藥材紫外指紋圖譜。方法：以石油醚、氯仿、無(wú)水乙醇、水4種溶劑分別提取半夏藥材不同極性區(qū)間成分，測(cè)定其紫外指紋圖譜，研究各樣品之間的異同。結(jié)果：采用該方法可以對(duì)不同產(chǎn)地半夏藥材進(jìn)行區(qū)分。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用范圍廣，為半夏藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了簡(jiǎn)便的方法。

半夏；紫外指紋圖譜；共有峰率；變異峰率；雙指標(biāo)序列分析法

半夏藥材來(lái)源于天南星科植物半夏Pinellia ternate（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，性味辛溫，有毒，有燥濕化痰，降逆止嘔，消痞散結(jié)功效〔1〕。半夏中主要含有生物堿、有機(jī)酸、半夏蛋白、揮發(fā)油、氨基酸、淀粉等，其中淀粉含量達(dá)75%〔2〕。在我國(guó)半夏的臨床應(yīng)用已有近千年的歷史，取得了良好的臨床療效〔3〕。我國(guó)半夏資源分布十分廣泛，主要集中在云南、貴州、四川、湖北、安徽、山東、甘肅等省區(qū)〔4〕，其中以四川產(chǎn)量大、質(zhì)量好〔5〕。半夏藥材除中醫(yī)藥房作為飲片使用外主要用于中藥制劑和中成藥的生產(chǎn)，每年的市場(chǎng)需求量在500～600萬(wàn)千克，市場(chǎng)缺口很大〔6〕，所以就出現(xiàn)了以水半夏〔7〕、麗江山慈姑〔8〕等來(lái)冒充半夏的現(xiàn)象。中國(guó)藥典2010年版“半夏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”中僅采用薄層色譜法對(duì)藥材進(jìn)行鑒別，采用滴定法對(duì)藥材中總有機(jī)酸的含量進(jìn)行測(cè)定〔1〕，這不能全面反映出半夏的質(zhì)量，特別是現(xiàn)在有些不法商販為了使半夏藥材的外觀白凈，有機(jī)酸的含量高，用硫磺對(duì)藥材進(jìn)行熏蒸。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，對(duì)半夏的質(zhì)量監(jiān)控具有十分重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法分析不同產(chǎn)地半夏藥材4種溶劑提取液的紫外指紋圖譜，可以系統(tǒng)地反映不同來(lái)源半夏藥材之間的差異。

1 儀器與試藥

1.1儀器UV2500雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（島津儀器有限責(zé)任公司）；SB25-12D超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；AE240電子分析天平（瑞士梅特勒）。

1.2試劑與藥材石油醚、氯仿、無(wú)水乙醇均為分析純；水為超純水；19個(gè)藥材樣品均由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥教研室楊月娥老師鑒定。見(jiàn)表1。

表1 半夏藥材樣品來(lái)源

1.3供試品溶液的制備

1.3.1 石油醚提取液的制備 將藥材樣品干燥、粉碎過(guò)60目篩，精密稱(chēng)取1.0 g藥材粉末，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL石油醚，稱(chēng)重，超聲提取1 h，補(bǔ)重，過(guò)濾，得石油醚提取液，密封保存待測(cè)。

1.3.2 氯仿、無(wú)水乙醇提取液的制備 精密稱(chēng)取干燥、粉碎過(guò)60目篩的半夏藥材粉末1.0 g，置50 mL具塞錐形瓶中，同“1.3.1”項(xiàng)操作，得氯仿、無(wú)水乙醇提取液，密封保存待測(cè)。

1.3.3 水提取液的制備 精密稱(chēng)取藥材粉末1.0 g，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL水，稱(chēng)重，超聲提取1 h，補(bǔ)重，離心10 min（3 000 r∕min），過(guò)濾，得水提取液。取水提液適量，加水于量瓶中稀釋30倍，得待測(cè)液。

2 方法與結(jié)果

2.1紫外光譜條件測(cè)定波長(zhǎng)190～400 nm，狹縫寬1.0 nm，采樣間隔0.2 nm，掃描方式：?jiǎn)未螔呙?，掃描速度：中速，以?duì)應(yīng)的提取溶劑作空白進(jìn)行掃描。

2.2穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將“1.3”項(xiàng)制備得到的待測(cè)液保存在0～4℃，取待測(cè)液，按“2.1”項(xiàng)光譜條件每間隔30 min掃描一次，連續(xù)測(cè)定3 h，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，計(jì)算相似度，得各提取液紫外光譜的相似度分別為：石油醚0.93，氯仿0.91，無(wú)水乙醇0.95，水1.03，表明各提取液在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3不同產(chǎn)地半夏藥材紫外指紋圖譜的測(cè)定按“1.3”項(xiàng)方法分別制備表1中各樣品的測(cè)定液，并按“2.1”項(xiàng)光譜條件進(jìn)行掃描。見(jiàn)封三圖1-4。

2.4紫外指紋圖譜共有峰的識(shí)別共有峰的定義：在相同實(shí)驗(yàn)條件，兩個(gè)或多個(gè)同種指紋圖譜中的某些指紋峰具有相同、相近的保留時(shí)間或吸收峰波長(zhǎng)，它們符合正態(tài)分布，稱(chēng)這組指紋峰是共有峰〔9〕。對(duì)于紫外光譜指紋圖譜，同一吸收峰在不同的圖譜中最大吸收波長(zhǎng)一般沒(méi)有一個(gè)固定的變化范圍，有些峰的變化范圍較大，可采用中藥指紋圖譜共有峰的理論識(shí)別方法W正態(tài)分布檢驗(yàn)判別法，對(duì)各種共有峰進(jìn)行識(shí)別〔10〕。見(jiàn)表2。

2.5紫外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析結(jié)果共性鑒別指標(biāo)：①共有峰率P=（共有峰數(shù)Ng∕兩個(gè)UV圖中的獨(dú)立峰數(shù)Nd）×100%；②共有峰數(shù)Ng：指在比較的兩個(gè)UV圖中都出現(xiàn)的吸收峰的個(gè)數(shù)；③獨(dú)立峰：紫外指紋圖譜中不同的吸收峰；na：指紋圖譜a中相對(duì)與其共有峰的非共有峰數(shù)，稱(chēng)為a的變異峰數(shù)；nb：指紋圖譜b中相對(duì)與其共有峰的非共有峰數(shù)，稱(chēng)為b的變異峰數(shù)；④獨(dú)立峰數(shù)Nd：相互比較的兩個(gè)UV圖中的獨(dú)立峰總數(shù)，Nd=Ng+ na+nb〔11-12〕。

變異鑒別指標(biāo)：①變異峰率Pv：一個(gè)指紋圖譜的變異峰率Pv是該UV圖中相對(duì)于共有峰的變異峰數(shù)與其共有峰數(shù)的比值；Pva=（na∕Ng）×100%，Pva：指紋圖譜a的變異峰率；Pvb=（nb∕Ng）×100%，Pvb：指紋圖譜b的變異峰率；②na=Ng+na，na：指紋圖譜a的總峰數(shù)；nb=Ng+nb，nb：指紋圖譜b的總峰數(shù)。

共有峰率越高說(shuō)明兩個(gè)指紋圖譜的共性越大，變異峰率差異越大，說(shuō)明兩個(gè)藥材樣品的差異越大。19個(gè)半夏藥材樣品雙指標(biāo)序列分析結(jié)果如下：

Y1：Y7（85.71%（16.67，0.00）），Y2Y3（75.00%（16.67，16.67）），Y9Y10Y17Y19（66.67%（16.67，33.33）），Y5Y13Y14Y18（62.50%（40.00，20.00）），Y8Y15（60.00%（16.67，50.00）），Y4（55.56%（40.00，40.00）），Y11Y16（50.00%（40.00，60.00）），Y6Y12（44.44%（75.00，50.00））。

Y2：Y9Y17（87.50%（0.00，14.29）），Y5Y7Y13Y18（85.71%（16.67，0.00）），Y1Y3Y4（75.00%（16.67，16.67）），Y11Y16（66.67%（16.67，33.33）），Y6Y12Y14（62.50%（40.00，20.00）），Y15（60.00%（16.67，50.00）），Y10Y19（50.00%（40.00，60.00）），Y8（45.45%（40.00，80.00））。

Y3：Y9Y17（87.50%（0.00，14.29），Y7（85.71%（16.67，0.00）），Y1Y2（75.00%（16.67，16.67）），Y11Y16（66.67%（16.67，33.33）），Y5Y13Y14Y18（62.50%（40.00，20.00）），Y8Y15（60.00%（16.67，50.00）），Y4（55.56%（40.00，40.00）），Y10Y19（50.00%（40.00，60.00）），Y6Y12（44.44%（75.00，50.00））。

Y4：Y11Y16（87.50%（0.00，14.29）），Y6Y12Y14（85.71%（16.67，0.00）），Y15（77.78%（0.00，28.57）），Y2（75.00%（16.67，16.67）），Y9Y17（66.67%（16.67，33.33）），Y5Y7Y13Y18（62.50%（40.00，20.00）），Y8（60.00%（16.67，50.00）），Y1Y3（55.56%（40.00，40.00）），Y10Y19（36.36%（75.00，100.00））。

Y5：Y13Y18（100.00%（0.00，0.00）），Y2（85.71%（0.00，16.67）），Y9Y17（75.00%（0.00，33.33）），Y6Y7Y12（71.43%（20.00，20.00）），Y1Y3Y4（62.50%（20.00，40.00）），Y11Y16Y19（55.56%（20.00，60.00）），Y14（50.00%（50.00，50.00）），Y15（50.00%（20.00，80.00）），Y10（40.00%（50.00，100.00）），Y8（36.36%（50.00，125.00））。

Y6：Y12（100.00%（0.00，0.00）），Y4（85.71%（0.00，16.67）），Y11Y16（75.00%（0.00，33.33）），Y5Y13Y14Y18（71.43%（20.00，20.00）），Y15（66.67%（0.00，50.00）），Y2（62.50%（20.00，40.00）），Y9Y17（55.56%（20.00，60.00）），Y7（50.00%（50.00，50.00）），Y8（50.00%（20.00，80.00）），Y1Y3（44.44%（50.00，75.00）），Y19（40.00%（50.00，100.00）），Y10（27.27%（100.00，166.67））。

Y7：Y1Y2Y3（85.71%（0.00，16.67）），Y9Y17（75.00%（0.00，33.33）），Y5Y13Y14Y18（71.43%（20.00，20.00）），Y4（62.50%（20.00，40.00）），Y10Y11Y16Y19（55.56%（20.00，60.00）），Y6Y12（50.00%（50.00，50.00）），Y8Y15（50.00%（20.00，80.00））。

Y8：Y15（80.00%（12.50，12.50）），Y11Y16（70.00%（25.87，14.29）），Y14（66.67%（50.00，0.00）），Y1Y3Y4（60.00%（50.00，16.67）），Y9Y10Y17Y19（54.54%（50.00，33.33）），Y6Y7Y12（50.00%（80.00，20.00）），Y2（45.45%（80.00，40.00）），Y5Y13Y18（36.36%（125.00，50.00））。

Y9：Y17（100.00%（0.00，0.00）），Y2Y3（87.50%（14.29，0.00）），Y11Y16（77.78%（14.29，14.29）），Y5Y7Y13Y18（75.00%（33.33，0.00）），Y15（70.00%（14.29，28.57）），Y1Y4（66.67%（33.33，16.67）），Y6Y12Y14（55.56%（60.00，20.00）），Y8（54.54%（33.33，50.00）），Y10Y19（45.45%（60.00，60.00））。

Y10：Y1（66.67%（33.33，16.67）），Y19（60.00%（33.33，33.33）），Y7（55.56%（60.00，20.00）），Y8（54.54%（33.33，50.00）），Y2Y3（50.00%（60.00，40.00）），Y9Y17（45.45%（60.00，60.00）），Y15（41.67%（60.00，80.00）），Y5Y13Y14Y18（40.00%（100.00，50.00）），Y4（36.36%（100.00，75.00）），Y11Y16（33.33%（100.00，100.00）），Y6Y12（27.27%（166.67，100.00））。

Y11：Y16（100.00%（0.00，0.00）），Y15（88.89%（0.00，12.50）），Y4（87.50%（14.29，0.00）），Y9Y17（77.78%（14.29，14.29）），Y6Y12Y14（75.00%（33.33，0.00）），Y8（70.00%（14.29，28.57）），Y2Y3（66.67%（33.33，16.67）），Y5Y7Y13Y18（55.56%（60.00，20.00）），Y1（50.00%（60.00，40.00）），Y10Y19（33.33%（100.00，100.00））。

Y12：Y6（100.00%（0.00，0.00）），Y4（85.71%（0.00，16.67）），Y11Y16（75.00%（0.00，33.33）），Y5Y13Y14Y18（71.43%（20.00，20.00）），Y15（66.67%（0.00，50.00）），Y2（62.50%（20.00，40.00）），Y9Y17（55.56%（20.00，60.00）），Y7（50.00%（50.00，50.00）），Y8（50.00%（20.00，80.00）），Y1Y3（44.44%（50.00，75.00）），Y19（40.00%（50.00，100.00）），Y10（27.27%（100.00，166.67））。

Y13：Y5Y18（100.00%（0.00，0.00）），Y2（85.71%（0.00，16.67）），Y9Y17（75.00%（0.00，33.33）），Y6Y7Y12（71.43%（20.00，20.00）），Y1Y3Y4（62.50%（20.00，40.00）），Y11Y16Y19（55.56%（20.00，60.00）），Y14（50.00%（50.00，50.00）），Y15（50.00%（20.00，80.00）），Y10（40.00%（50.00，100.00）），Y8（36.36%（50.00，125.00））。

Y14：Y4（85.71%（0.00，16.67）），Y11Y16（75.00%（0.00，33.33）），Y6Y7Y12（71.43%（20.00，20.00）），Y8Y15（66.67%（0.00，50.00）），Y1Y2Y3（62.50%（20.00，40.00）），Y9Y17（55.56%（20.00，60.00）），Y5Y13Y18（50.00%（50.00，50.00）），Y10Y19（40.00%（50.00，100.00））。

Y15：Y11Y16（88.89%（12.50，0.00）），Y8（80.00%（12.50，12.50）），Y4（77.78%（28.57，0.00）），Y9Y17（70.00%（28.57，14.29）），Y6Y12Y14（66.67%（50.00，0.00）），Y1Y2Y3（60.00%（50.00，16.67）），Y5Y7Y13Y18（50.00%（80.00，20.00）），Y10Y19（41.67%（80.00，60.00））。

Y16：Y11（100.00%（0.00，0.00）），Y15（88.89%（0.00，12.50）），Y4（87.50%（14.29，0.00）），Y9Y17（77.78%（14.29，14.29）），Y6Y12Y14（75.00%（33.33，0.00）），Y8（70.00%（14.29，28.57）），Y2Y3（66.67%（33.33，16.67）），Y5Y7Y13Y18（55.56%（60.00，20.00）），Y1（50.00%（60.00，40.00）），Y10Y19（33.33%（100.00，100.00））。

Y17：Y9（100.00%（0.00，0.00）），Y2Y3（87.50%（14.29，0.00）），Y11Y16（77.78%（14.29，14.29）），Y5Y7Y13Y18（75.00%（33.33，0.00）），Y15（70.00%（14.29，28.57）），Y1Y4（66.67%（33.33，16.67）），Y6Y12Y14（55.56%（60.00，20.00）），Y8（54.54%（33.33，50.00）），Y10Y19（45.45%（60.00，60.00））。

Y18：Y5Y13（100.00%（0.00，0.00）），Y2（85.71%（0.00，16.67）），Y9Y17（75.00%（0.00，33.33）），Y6Y7Y12（71.43%（20.00，20.00）），Y1Y3Y4（62.50%（20.00，40.00）），Y11Y16Y19（55.56%（20.00，60.00）），Y14（50.00%（50.00，50.00）），Y15（50.00%（20.00，80.00）），Y10（40.00%（50.00，100.00）），Y8（36.36%（50.00，125.00））。

Y19：Y1（66.67%（33.33，16.67）），Y10（60.00%（33.33，33.33）），Y5Y7Y13Y18（55.56%（60.00，20.00）），Y8（54.54%（33.33，50.00）），Y2Y3（50.00%（60.00，40.00）），Y9Y17（45.45%（60.00，60.00）），Y15（41.67%（60.00，80.00）），Y6Y12Y14（40.00%（100.00，50.00）），Y4（36.36%（100.00，75.00）），Y11Y16（33.33%（100.00，100.00））。

*Y1：Y7（85.71%（16.67，0.00））表示該序列以樣品Y1為參考，樣品Y1與樣品Y7的共有峰率是85.71%，Y1的變異峰率是16.67%，Y7的變異峰率是0.00%，Y1：Y2Y3（75.00%（16.67，16.67））表示Y2Y3與Y1的共有峰率相等，為75.00%，Y2Y3與Y1具有相同的變異峰率16.67%。

利用該多維雙指標(biāo)序列空間，可以方便地找出不同樣品的最相似樣品，從而可以避免在單一序列空間中比較不同的樣品，根據(jù)共有峰率將它們分為如下幾組：

A組：Y5：Y13Y18（100.00%（0.00，0.00）），Y6：Y12（100.00%（0.00，0.00）），Y9：Y17（100.00%（0.00，0.00）），Y11：Y16（100.00%（0.00，0.00）），Y12：Y6（100.00%（0.00，0.00）），Y13：Y5Y18（100.00%（0.00，0.00）），Y16：Y11（100.00%（0.00，0.00）），Y17：Y9（100.00%（0.00，0.00）），Y18：Y5Y13（100.00%（0.00，0.00））。

B組：Y15：Y11Y16（88.89%（12.50，0.00）），Y2：Y9Y17（87.50%（0.00，14.29）），Y3：Y9Y17（87.50%（0.00，14.29）），Y4：Y11Y16（87.50%（0.00，14.29）），Y1：Y7（85.71%（16.67，0.00）），Y7：Y1Y2Y3（85.71%（0.00，16.67）），Y14：Y4（85.71%（0.00，16.67）），Y8：Y15（80.00%（12.50，12.50））。

C組：Y10：Y1（66.67%（33.33，16.67）），Y19：Y1（66.67%（33.33，16.67））。

在19個(gè)藥材樣品中，以A組中相對(duì)比的幾個(gè)樣品最相似，共有峰率都為100%，并且相對(duì)比的幾個(gè)樣品來(lái)源于同一產(chǎn)地；B組共有峰率＞80.00%，樣品相似性較高，相對(duì)比的幾個(gè)樣品來(lái)源于同一產(chǎn)地或產(chǎn)地接近；C組Y10Y19兩個(gè)樣品與樣品Y1比較，共有峰率都為66.67%，且變異峰率＞30.00%，樣品相似性較差，樣品來(lái)源不同。而且，Y10Y19兩個(gè)樣品在與其它樣品進(jìn)行對(duì)比時(shí)，多處于序列后段。

從變異峰率看，同一產(chǎn)地樣品的變異峰率為0.00%或＜17.00%，如：Y6：Y12（100.00%（0.00，0.00）），Y1：Y7（85.71%（16.67，0.00））。不同產(chǎn)地樣品的變異峰率最大為166.67%，如：Y6：Y10（27.27%（100.00，166.67））；最小為12.50%，如：Y8：Y15（80.00%（12.50，12.50））。

上述分析表明，同一產(chǎn)地半夏藥材之間相似性極高，不同產(chǎn)地半夏藥材之間存在著明顯的差異，但差異隨著產(chǎn)地的接近而減小，產(chǎn)地越接近，其所得結(jié)果相似性越高?？梢圆捎霉灿蟹迓屎妥儺惙迓孰p指標(biāo)序列分析法對(duì)不同產(chǎn)地半夏藥材進(jìn)行區(qū)分。

3 討論

本文以石油醚、氯仿、無(wú)水乙醇和水為溶劑分別提取不同產(chǎn)地的半夏藥材，測(cè)定其紫外指紋圖譜，利用共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)序列分析法對(duì)4種溶劑提取物進(jìn)行分析，可以從共性和差異兩個(gè)方面全面刻畫(huà)指紋圖譜，所得結(jié)果專(zhuān)屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品之間相似程度與藥材產(chǎn)地接近程度相聯(lián)系，這可能是受地理位置、氣候等生態(tài)因素影響，這說(shuō)明該方法具有一定的科學(xué)性和合理性，對(duì)半夏藥材的生產(chǎn)應(yīng)用和栽培技術(shù)研究具有一定的指導(dǎo)意義。

〔1〕國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部〔S〕.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：110.

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*通信作者：楊永壽，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師.

（責(zé)任編輯 李 楊）

The Common and Variation Peak Ratio Dual Index Sequence Analysis on UV Fingerprint Spectra of Pinellia ternate Breit.

HUANG Tao,FU Zhijin,CHEN Houjiang,LIN Miao,YANG Yongshou*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China）

Objective:To analyze the UV fingerprint spectra of Pinellia ternate Breit.by common and variation peak ratio dual index sequence analysis.Methods:Chemical constituents of Pinellia ternate Breit.were extracted by petroleum ether,chloroform,ethanol and water from different medicinal ingredient polarities,and the differences among those samples were analyzed by the way of UV fingerprint spectra.Results:This method could distinguish Pinellias ternate Breit.from different origin.Conclusion:The method was simple and withwiderangeofapplication,it provided aconvenient method to estimate the quality of Pinelliaternate Breit..

Pinelliaternate Breit.;UVfingerprint spectra;common peak ratio;variationpeakratio;dualindexsequenceanalysis

R284

A

1672-2345（2014）02-0020-06

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.02.007

大理學(xué)院教學(xué)改革重點(diǎn)資助項(xiàng)目（JG200506）

2013-10-24

2013-12-13

黃濤，藥學(xué)專(zhuān)業(yè)2010級(jí)本科生.