聚類分析法對不同產(chǎn)地半夏藥材質(zhì)量的綜合評價

甫志錦，黃 濤，陳后江，鄭小磊，楊永壽

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

聚類分析法對不同產(chǎn)地半夏藥材質(zhì)量的綜合評價

甫志錦，黃 濤，陳后江，鄭小磊，楊永壽*

（大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：綜合比較、評價不同產(chǎn)地半夏藥材的質(zhì)量。方法：采用電位滴定法、紫外分光光度法、硫酸-蒽酮法和酸性染料比色法對不同產(chǎn)地半夏藥材中的總有機(jī)酸、氨基酸、多糖和生物堿含量進(jìn)行測定，并采用聚類分析法對測定結(jié)果進(jìn)行綜合評價。結(jié)果：不同產(chǎn)地的半夏藥材中總有機(jī)酸、氨基酸、多糖和生物堿的含量差異較大。結(jié)論：半夏藥材的質(zhì)量受產(chǎn)地影響較大，經(jīng)聚類分析可將39份來源不同的半夏藥材分為Ⅲ類，第Ⅰ類產(chǎn)地主要為云南、貴州地區(qū)，這類藥材中總有機(jī)酸、氨基酸、多糖和生物堿的含量普遍偏低，綜合質(zhì)量較差；第Ⅱ類產(chǎn)地為甘肅，質(zhì)量居中；第Ⅲ類產(chǎn)地為四川，這類藥材中各主要成分的含量較高，綜合質(zhì)量較好。

半夏藥材；不同產(chǎn)地；聚類分析

半夏是天南星科植物三葉半夏Pinellia ternate（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，是臨床上最常用的有毒中藥材，在我國大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于四川、湖北、河南、貴州、安徽、云南等省。其味辛、性溫、有毒，歸脾、胃、肺經(jīng)，具有燥濕化痰、消痞散結(jié)、降逆止嘔的功效〔1〕。據(jù)研究報道，半夏主要含有有機(jī)酸、生物堿、半夏蛋白、揮發(fā)油、氨基酸和多糖等成分。半夏藥材中的有機(jī)酸為鎮(zhèn)咳、抗腫瘤的有效成分之一〔2〕，氨基酸中的天門冬氨酸具有鎮(zhèn)咳祛痰的功效〔3〕，多糖也為半夏主要活性成分〔4〕。而生物堿具有降壓、降脂作用，同時對體外腫瘤細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用〔5〕，但中國藥典2010年版收載的“半夏藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”，只對藥材中的有機(jī)酸含量進(jìn)行控制〔6〕，不能客觀反映藥材的質(zhì)量，而中藥材的藥效作用往往是藥材中多成分共同作用的結(jié)果，加上中藥材由于產(chǎn)地不同、炮制方法不同，質(zhì)量亦有差異〔7〕，為客觀評價半夏藥材的質(zhì)量，本研究在半夏藥材各主要成分含量測定的基礎(chǔ)上，擬采用聚類分析法對39份不同產(chǎn)地半夏藥材的質(zhì)量進(jìn)行綜合評價，目的在于建立一種能客觀評價半夏藥材質(zhì)量的方法。

1 儀器與材料

1.1儀器pHS-25數(shù)顯pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；UV2500雙光束紫外可見分光光度計（日本島津）；DHG-9420A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；AE240電子分析天平（瑞士梅特勒）；SB2200超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（上海金橋科析儀器廠）。

1.2材料半夏藥材由大理州食品藥品檢驗(yàn)所中藥室鑒定為：天南星科植物三葉半夏Pinellia ternate（Thunb.）Breit.的干燥塊莖，并免費(fèi)提供給課題組作為研究使用（共39份）；纈氨酸對照品（上海伯奧生物科技有限公司，批號：050202）；葡萄糖對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110742-200517）；鹽酸麻黃堿對照品（貴州迪大生物科技有限公司，批號：GZDD-0675）；其它試劑均為分析純。

2 溶液的配制

2.1 2%茚三酮溶液的配制稱取茚三酮1.0 g加無水乙醇溶解成50 mL，即得2.0%茚三酮溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用〔8〕。

2.2 pH 6.80磷酸鹽緩沖液的配制取0.2 mol∕L磷酸二氫鉀溶液250 mL，加0.2 mol∕L的NaOH溶液118 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得，pH值為6.80的磷酸鹽緩沖液〔8〕。

2.3纈氨酸對照品溶液的配制精密稱取纈氨酸對照品50 mg，用蒸餾水溶解，定容至500 mL，即得0.1 mg∕mL纈氨酸對照品溶液〔8〕。

2.4 5%苯酚溶液的配制取苯酚100 g，加鋁片1 g和碳酸氫鈉0.1 g，蒸餾，收集182℃餾分。稱取精制苯酚10 g，加水溶解，于200 mL棕色量瓶中定容〔9-10〕。

2.5葡萄糖對照品溶液的配制精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖10.0 mg，于50 mL量瓶中加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻即可〔11〕。

2.6醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的配制取醋酸鈉54.6 g加1 mol∕L醋酸溶液20 mL溶解后，加水稀釋至500 mL，即得，pH值為6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液〔6〕。

2.7溴麝香草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制取溴麝香草酚藍(lán)0.1 g，加0.05 mol∕L的NaOH溶液3.2 mL使溶解，再加水稀釋至200 mL，即得溴麝香草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液〔6〕。

2.8鹽酸麻黃堿對照品溶液的配制取鹽酸麻黃堿對照品10 mg，精密稱定，至50 mL的容量瓶中，用氯仿溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得0.2 mg∕mL鹽酸麻黃堿對照品溶液〔5〕。

2.9總有機(jī)酸含量測定用樣品溶液的配制取半夏藥材適量，粉碎，過20目篩。精密稱取5.0 g藥材粉末，加70%乙醇50 mL，加熱回流1 h，重復(fù)提取2次，放冷，過濾，合并濾液，蒸干。精密移取0.1 mol∕L的NaOH 10.0 mL加入殘渣中，超聲處理（500 W，40 kHz）30 min，使其殘渣完全溶解，轉(zhuǎn)移至500 mL量瓶中，加入新煮沸冷卻的蒸餾水至刻度，搖勻，即得〔6〕。

2.10氨基酸含量測定用樣品溶液的配制精密稱取干燥、粉碎過20目篩的半夏粉末1.0 g，加50%的乙醇20 mL，在70℃的恒溫水浴鍋中回流30 min，重復(fù)提取2次，放冷，過濾，合并濾液，蒸干。殘渣加少量蒸餾水，超聲處理（500 W，40 kHz）至完全溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，定容，即得〔12〕。

2.11多糖含量測定用樣品溶液的配制精密稱取干燥、粉碎過20目篩的半夏粉末1.0 g，加6倍量的水浸泡過夜，煎煮3次，每次2 h，合并水提液，冷卻，離心去除不溶性雜質(zhì)，合并離心液，用0.1 mol∕L的NaOH調(diào)溶液的pH至中性，減壓濃縮，加3倍量體積的95%的乙醇溶液沉淀，靜置過夜使沉淀完全，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，待有機(jī)溶劑揮盡，加蒸餾水溶解，定容至50 mL，搖勻即得〔11〕。

2.12生物堿含量測定用樣品溶液的配制精密稱取干燥、粉碎過20目篩的半夏粉末1.0 g，置于50 mL三角瓶中，加濃氨水0.5 mL，濕潤后，加氯仿10 mL，冷浸3 h，超聲30 min，過濾，殘渣以10 mL氯仿分3次洗滌，合并濾液與洗液，回收氯仿至干，加入10 mL氯仿使溶解，定容至50 mL，即得〔5〕。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1總有機(jī)酸的含量測定精密量取“2.9”項(xiàng)下制備的樣品溶液25.00 mL，照電位滴定法用0.1 mol∕L的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定剩余的NaOH溶液，并用空白試驗(yàn)校正，每1 mL 0.1 mol∕L的NaOH溶液相當(dāng)于5.904 mg的琥珀酸〔6〕。

3.2氨基酸的含量測定精密移取“2.3”項(xiàng)配制的纈氨酸對照品溶液1 mL，“2.10”項(xiàng)配制的供試品溶液2 mL，分別置25 mL量瓶中，分別加0.5 mL茚三酮溶液、1 mL pH 6.80的磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，置沸水浴中加熱15 min，取出，冷卻，加蒸餾水稀釋至25 mL，搖勻，同法制備空白溶液。在568 nm下分別測定吸光度值，照下列公式計算半夏中總氨基酸的含量：總氨基酸含量（mg／g）=（C×D×1.024）∕W。W為供試品含量（g）；C氨基酸含量（μg）；D為稀釋倍數(shù)；轉(zhuǎn)換系數(shù)1.024是氨基酸的平均分子量120除以纈氨酸的分子量117.15所得〔8，13〕。

3.3多糖的含量測定精密移取“2.5”項(xiàng)配制的葡萄糖對照品溶液1 mL，“2.11”項(xiàng)配制的供試品溶液1 mL，分別置25 mL量瓶中，分別加入1 mL 5%的精制苯酚溶液、5 mL濃硫酸。搖勻，置水浴中加熱25 min，取出冷卻，加水定容至25 mL，搖勻，同法制備空白溶液，在625 nm下分別測定其吸光度值〔11〕。

3.4生物堿的含量測定精密移取“2.8”項(xiàng)下配制的鹽酸麻黃堿對照品溶液1 mL，“2.12”項(xiàng)下配制的供試品溶液1 mL，分別置25 mL量瓶中，分別加入10 mL pH 6.0的緩沖液和1 mL溴麝香草酚藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液，充分振搖后，靜置30 min，分取氯仿層，水層再用氯仿同法萃取2次，每次10 mL。合并氯仿層，回收至干，殘留物用氯仿溶解，置于10 mL量瓶中，并用氯仿稀釋到刻度，搖勻，同法制備空白溶液，在416 nm下分別測定其吸光度值〔5〕。

3.5結(jié)果與分析

3.5.1 半夏藥材中三種主要成分的測定結(jié)果 按“3.1”、“3.2”、“3.3”、“3.4”項(xiàng)下方法測定來源不同的39份半夏藥材中總有機(jī)酸、氨基酸、多糖和生物堿的含量。見表1。3.5.2 半夏藥材中主要成分的聚類分析 采用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件對測定結(jié)果進(jìn)行處理，并采用Euclidean distance系數(shù)對不同產(chǎn)地半夏藥材質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。當(dāng)閾值為10時，39個不同產(chǎn)地半夏藥材樣品被聚為3組：1、2、3、5、7、8、9、10、12、13、14、15、16、20、22、24、25、27、28、29、30、32、33、34、35、36、37、39聚為Ⅰ組；11聚為Ⅱ組；4、6、17、18、19、21、23、26、31、38聚為Ⅲ組。結(jié)合表1分析可以看出，第Ⅰ組除1、22、27、28、36、37號外其余都為云南、貴州地區(qū)，總有機(jī)酸含量多在0.401%～0.756%范圍，且生物堿含量多數(shù)低于0.400%，第Ⅱ組產(chǎn)地為甘肅地區(qū)，氨基酸與多糖的含量較高，且氨基酸含量最高可達(dá)1.646%，第Ⅲ組除4號外產(chǎn)地都為四川地區(qū)，總有機(jī)酸和生物堿含量較高，總有機(jī)酸含量主要集中在1.841%～2.680%范圍，生物堿含量主要集中在0.477%～0.706%范圍。見圖1。

表1 半夏藥材中總有機(jī)酸、氨基酸、多糖和生物堿的含量測定結(jié)果（n=3）

續(xù)表

4 討論

從表1可以看出：不同產(chǎn)地半夏中總有機(jī)酸的含量差異顯著，最低為0.118%，最高達(dá)2.680%?！吨袊幍洹?010年版一部〔6〕收載的“半夏藥材”中總有機(jī)酸含量規(guī)定為不得低于0.250%，所測的39份樣品中有4份樣品中有機(jī)酸的含量不合格，且這四份樣品均產(chǎn)自云南，這是否與生長的環(huán)境因素有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

半夏藥材中氨基酸的含量差異性不及總有機(jī)酸的含量，最高為1.650%，最低為0.037%，但多數(shù)樣本的氨基酸含量集中在0.108%～0.698%之間，表明產(chǎn)地對半夏中氨基酸含量的影響相對有機(jī)酸的影響小。與此同時，不同產(chǎn)地半夏藥材中多糖的含量也具有明顯的差異，最高含量可達(dá)1.533%，最低則為0.028%，但主要集中在0.103%～0.706%之間。而不同產(chǎn)地半夏藥材中生物堿的含量在0.071%～0.706%之間，產(chǎn)地對生物堿含量影響較以上3個化學(xué)成分小。

圖1 39個不同產(chǎn)地半夏藥材樣品中主要成分的聚類分析

運(yùn)用聚類分析對39個不同產(chǎn)地的半夏藥材進(jìn)行分析評價，結(jié)果表明不同產(chǎn)地半夏中總有機(jī)酸、氨基酸、多糖和生物堿含量有明顯差異，以總有機(jī)酸來看，除3號、25號、29號、34號4個云南產(chǎn)的樣品低于《中國藥典》2010版一部規(guī)定的0.25%外，其余樣品均符合要求。半夏喜溫和、濕潤氣候，怕干旱，本文對半夏藥材中的4種主要成分進(jìn)行聚類分析，結(jié)果可知四川產(chǎn)的半夏藥材綜合質(zhì)量最好，云南、貴州地區(qū)較四川質(zhì)量較差。四川大部分地區(qū)屬亞熱帶濕潤氣候，常年溫暖濕潤，半夏藥材的分布較為集中，藥材品質(zhì)也較好，是我國半夏藥材的主產(chǎn)區(qū)之一〔14〕，這與本文的分析結(jié)果一致。

此外，半夏藥材現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的【含量測定】項(xiàng)只測定總有機(jī)酸的含量，未規(guī)定氨基酸、多糖和生物堿的含量，而氨基酸、多糖和生物堿都為半夏藥材的主要活性成分〔14〕，建議將其納入半夏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

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*通信作者：楊永壽，高級實(shí)驗(yàn)師.

（責(zé)任編輯 李 楊）

Comprehensive Quality Evaluation of Rhizoma Pinelliae from Different Origin by Clustering Analysis Method

FU Zhijin,HUANG Tao,CHEN Houjiang,ZHENG Xiaolei,YANG Yongshou*
（College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000，China）

Objective:To comprehensively compare and evaluate the quality of Pinellia ternate from different origin.Methods:Electrometric titration,UV spectrophotometry and sulfuric acid-anthrone method were applied to determine the organic acids,amino acids and polysaccharides.The results of the above were conducted cluster analysis for comprehensive evaluation.Results:The content of total organicacid,polysaccharide and amino acidsdiffered greatly in Pinellias ternate from different origins.Apart from No.3,No.25, No.29 and No.34 samples of Yunnan origin,the remaining samples passed the requirements of medicinal.Conclusion:The quality of Pinellia ternata was greatly influenced by the place of production.The cluster analysis could divide 39different Pinellia ternata into 3 categories.Type I were most from Yunnan and Guizhou areas,which showed lower total content of organic acids,amino acids and polysaccharides,as well as poorer comprehensive quality.Type III were from Sichuanarea,which showed higher content of total organic acidbettercomprehensivequality.

Pinelliaternate;different origin;clusteranalysis

R284

A

1672-2345（2014）02-0015-05

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.02.006

大理學(xué)院教學(xué)改革重點(diǎn)資助項(xiàng)目（JG200506）

2013-11-08

2013-12-10

甫志錦，藥學(xué)專業(yè)2010級本科生.