免費(fèi)軟件在藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

李衛(wèi)華， 劉桂霞， 程家高， 唐 赟

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海 200237)

0 引 言

新藥的研發(fā)是一項耗資巨大且周期漫長的系統(tǒng)工程。為減少藥物研發(fā)的盲目性和提高研發(fā)的效率，綜合運(yùn)用物理、化學(xué)、生物學(xué)和計算機(jī)等多學(xué)科的技術(shù)方法進(jìn)行合理藥物設(shè)計成為當(dāng)前藥物研發(fā)的主要模式，其發(fā)現(xiàn)新藥的成功率相對隨機(jī)篩選有了顯著提高。尤其是隨著高性能計算機(jī)的發(fā)展和各種計算算法的完善，以計算機(jī)為工具，依據(jù)已有的藥物靶標(biāo)或已知化合物信息，進(jìn)行藥物的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計已成為藥物研發(fā)的一種主要方法[1-3]。利用計算機(jī)輔助藥物設(shè)計技術(shù)，可以有效降低藥物研發(fā)的成本，縮短研發(fā)周期。隨著合理藥物設(shè)計發(fā)展起來的一門新興學(xué)科——藥物設(shè)計學(xué)也隨之誕生[4-6]。

近年來，藥學(xué)類高校相繼開設(shè)了藥物設(shè)計類的課程。華東理工大學(xué)藥學(xué)院于2006年開始開設(shè)面向本科生的“藥物設(shè)計學(xué)”課程，該課程是上海市教委重點(diǎn)建設(shè)課程，也是我學(xué)院的專業(yè)核心課程之一[7]?！八幬镌O(shè)計學(xué)”課程的內(nèi)容涉及新藥研究過程中藥物設(shè)計的基本原理和方法。和其他高校不同的是，我們的藥物設(shè)計學(xué)課程主要以介紹計算機(jī)輔助藥物設(shè)計方法及其應(yīng)用的相關(guān)知識為主[8]。計算機(jī)輔助藥物設(shè)計是一門新興的交叉學(xué)科，涉及多門學(xué)科的基礎(chǔ)理論知識，特別是需要掌握一定的數(shù)學(xué)和物理基礎(chǔ)知識。純理論的課堂教學(xué)往往會使學(xué)生產(chǎn)生厭學(xué)情趣，從而影響整個課程的教學(xué)效果。為培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、加深理解，并初步掌握計算機(jī)輔助藥物設(shè)計的內(nèi)涵，還開設(shè)了一門32個學(xué)時的“藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)”課程來配合理論課教學(xué)[9]。該實(shí)驗(yàn)課程突出計算模擬方法在藥物研究中的指導(dǎo)作用，強(qiáng)調(diào)從小分子與靶標(biāo)相關(guān)作用機(jī)理入手進(jìn)行創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)和設(shè)計。通過實(shí)驗(yàn)課程，學(xué)生不但能鞏固課堂所學(xué)理論，還能自己動手開展簡單的藥物設(shè)計研究，為今后獨(dú)立開展相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

目前學(xué)術(shù)界和一些大制藥企業(yè)使用的計算機(jī)輔助藥物設(shè)計平臺都是基于一些大型的商業(yè)軟件，如：Schr?dinger、Discovery Studio、MOE、Sybyl等等。這些軟件功能強(qiáng)大，但也很昂貴、對硬件的要求較高，不適用于面向本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)任務(wù)。所幸的是，學(xué)術(shù)界有很多免費(fèi)的分子模擬軟件以及一些免費(fèi)的學(xué)術(shù)版商業(yè)軟件可以完成我們的實(shí)驗(yàn)教學(xué)功能。在過去幾年里，我們嘗試將一些能免費(fèi)獲取的軟件代替商業(yè)軟件應(yīng)用于我們的實(shí)驗(yàn)課教學(xué)，取得了不錯的效果。本文將就這些免費(fèi)軟件在 “藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)”課程中的應(yīng)用展開介紹。

1 課程內(nèi)容及軟件

綜合計算機(jī)輔助藥物設(shè)計的國內(nèi)外發(fā)展趨勢和我們多年從事本領(lǐng)域科研工作的經(jīng)驗(yàn)，并結(jié)合藥學(xué)專業(yè)背景本科生的知識水平，我們的“藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)”共開設(shè)了8個實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，包括5個基礎(chǔ)型、2個綜合型和1個設(shè)計型實(shí)驗(yàn)，具體包括：Unix/Linux系統(tǒng)的基本操作、氨基酸序列比對、蛋白質(zhì)同源模建、小分子構(gòu)建和結(jié)構(gòu)優(yōu)化、藥效團(tuán)模型構(gòu)建、分子對接、虛擬篩選、以及學(xué)生自主設(shè)計研究方案的設(shè)計實(shí)驗(yàn)(見表1)。這些實(shí)驗(yàn)內(nèi)容基本覆蓋了計算機(jī)輔助藥物設(shè)計所使用到的常規(guī)方法和操作。整個實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計配合理論課教學(xué)，由易到難，循序漸進(jìn)，以便學(xué)生能較好掌握。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，我們精心挑選了不同的軟件對學(xué)生進(jìn)行操作技能的訓(xùn)練，以使學(xué)生掌握更多的操作技巧，也可以比較不同軟件的優(yōu)缺點(diǎn)。

表1 藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容和使用的軟件

2 應(yīng)用實(shí)踐

2.1 Unix/Linux系統(tǒng)的基本操作

由于計算機(jī)輔助藥物設(shè)計軟件大都基于Linux操作系統(tǒng)，而藥學(xué)背景的學(xué)生幾乎都沒有Linux系統(tǒng)的使用經(jīng)驗(yàn)，因此在“藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)”中我們首先設(shè)置了一個內(nèi)容——Unix/Linux系統(tǒng)的基本操作，讓學(xué)生熟悉Linux系統(tǒng)基本命令的操作，如建立自己的工作目錄(mkdir)、復(fù)制文件(cp)、移動文件(mv)等等。為后續(xù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的需要，還要求學(xué)生熟練掌握軟件vi的操作技巧。vi是Linux系統(tǒng)自帶的一款優(yōu)秀的文本編輯器，可以方便快速地實(shí)現(xiàn)對文本的輸入、添加、修改、替換、查找等等功能。我們將實(shí)驗(yàn)課程必需的一些參數(shù)放到一個公共目錄下，讓學(xué)生通過學(xué)到的Linux系統(tǒng)命令去獲取這些文件，并通過vi修改其中的某些文件以便自己所需。

2.2 氨基酸序列比對

氨基酸序列比對，即將目標(biāo)序列同已知參考蛋白序列進(jìn)行比較分析，是生物信息學(xué)及分子生物學(xué)強(qiáng)有力的研究手段，它不僅可以用來確定序列保守區(qū)域，同時也為兩個或更多序列的殘基之間的相互關(guān)系提供了一個非常明確的圖譜。氨基酸序列比對是研究同源蛋白質(zhì)之間結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的一種重要方法，也是利用同源模建方法構(gòu)建蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。我們選用ClustalX來進(jìn)行序列比對的操作。ClustalX是一款應(yīng)用最為廣泛的用于蛋白質(zhì)氨基酸序列比對的免費(fèi)軟件[10]，其操作界面簡潔，功能簡單易學(xué)。首先通過“File”菜單欄里的“Load sequence”和“Append sequence”選項，依次讀入目標(biāo)和模板蛋白的氨基酸序列；再通過“Alignment”菜單欄里的“Do complete alignment”選項就可以根據(jù)選好的參數(shù)進(jìn)行兩兩序列或多序列之間的比對；比對好的序列可以保存為多種格式供其它軟件使用，也可以通過“Write alignment as postscript”選項，作為圖片格式進(jìn)行瀏覽或保存。

2.3 蛋白質(zhì)同源模建

同源模建是根據(jù)氨基酸序列同源性分析，基于同源的已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來預(yù)測目標(biāo)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。同源模建是目前蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測中較為成熟的方法，在蛋白質(zhì)的功能研究和藥物設(shè)計中得到了廣泛的應(yīng)用。目前有許多軟件可以進(jìn)行蛋白質(zhì)同源模建的工作，其中Modeller是應(yīng)用最廣的免費(fèi)軟件。Modeller是美國加州大學(xué)舊金山分校的Andrej Sali教授研究組開發(fā)的一款用于同源模建的軟件[11]。它能根據(jù)用戶提供的序列比對結(jié)果，自動進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。此外，Modeller還可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)環(huán)區(qū)(loop區(qū))的從頭模建；依據(jù)特定的勢函數(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化；序列比對等等功能。在我們的實(shí)驗(yàn)中，以上一個實(shí)驗(yàn)得到的序列比對結(jié)果作為Modeller的輸入文件，用Modeller的內(nèi)部函數(shù)“automodel”可以一步獲得目標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。根據(jù)需要，還可以選擇輸出多個結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較分析。Modeller構(gòu)建的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的質(zhì)量可以用另一免費(fèi)軟件Procheck進(jìn)行評估。Procheck主要從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的立體化學(xué)特征方面評價模型的好壞，用其產(chǎn)生的拉式圖(Ramachandran plot)可以判斷哪些殘基需要進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。

2.4 小分子構(gòu)建與結(jié)構(gòu)優(yōu)化

小分子的構(gòu)建與結(jié)構(gòu)優(yōu)化是從事藥物設(shè)計與分子模擬研究需要掌握的基本技能。在本節(jié)實(shí)驗(yàn)中，主要讓學(xué)生掌握如何構(gòu)建小分子化合物的二維和三維結(jié)構(gòu)，并對其三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子力學(xué)優(yōu)化。有很多軟件可以實(shí)現(xiàn)小分子化合物結(jié)構(gòu)的構(gòu)建與優(yōu)化操作，為了配合后面實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的需要，我們選擇了免費(fèi)教學(xué)版的軟件Maestro。Maestro是一款功能強(qiáng)大的分子圖形顯示和分析軟件，通過組合不同的功能模塊，可以實(shí)現(xiàn)計算機(jī)輔助藥物設(shè)計中絕大多數(shù)方法的應(yīng)用。

Maestro軟件“Build”面板中的Fragment選項內(nèi)置了一個分子碎片庫，通過選擇不同碎片的組合就可以方便快速地構(gòu)建一個完整的小分子二維結(jié)構(gòu)。配合“Build”面板上的其它功能按鈕，可以對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鍵長、鍵角、二面角、鍵級的調(diào)整；設(shè)置可電離基團(tuán)的形式電荷；原子或基團(tuán)的移動；改變手性中心的手性等等操作。小分子結(jié)構(gòu)構(gòu)建完成后，可以利用“Build”面板上的“clean up geometry”進(jìn)行簡單的結(jié)構(gòu)修正。也可以通過Maestro的“LigPrep”模塊對結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子力學(xué)的優(yōu)化?！癓igPrep”模塊提供了MMFF和OPLS_2005兩種分子力場選擇來進(jìn)行小分子的優(yōu)化。優(yōu)化好的小分子可以保存為多種格式供其它軟件使用，如常用的mol2、pdb、sdf格式等。

2.5 藥效團(tuán)模型構(gòu)建

藥效團(tuán)模建是基于一組結(jié)構(gòu)多樣性的已知活性的小分子，尋找其共同的藥效團(tuán)特征，從而發(fā)現(xiàn)影響其生物活性的關(guān)鍵因素。藥效團(tuán)模建是基于配體的藥物設(shè)計方法中的一種主要方法，可以用于新型藥物先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)以及研究配體和受體之間的相互作用。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們利用免費(fèi)教學(xué)版的Phase[12]來構(gòu)建小分子的三維藥效團(tuán)模型。先將用于藥效團(tuán)模建的小分子的三維結(jié)構(gòu)優(yōu)化好，保存為sdf格式，導(dǎo)入分子顯示界面maestro中添加活性數(shù)據(jù)。通過Phase的“Develop pharmacophore model”選項，依據(jù)活性數(shù)據(jù)值，將小分子分為活性組和非活性組，并計算每個小分子的特征元素。然后用“Find common pharmacophore”命令確定它們共同的藥效團(tuán)，依據(jù)活性組的小分子特征調(diào)整特征元素組合；對產(chǎn)生的可能藥效團(tuán)假設(shè)進(jìn)行打分，依據(jù)打分的高低排序藥效團(tuán)。最后依據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇一個最優(yōu)的藥效團(tuán)模型，利用Maestro界面可以查看活性組和非活性組的小分子和最優(yōu)藥效團(tuán)模型的匹配情況，以驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度。

2.6 分子對接

分子對接已經(jīng)成為計算機(jī)輔助藥物設(shè)計領(lǐng)域一個非常重要也非常有效的方法。通過分子對接，可以研究藥物分子和其靶標(biāo)之間的詳細(xì)相互作用，也可以用來發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化新的藥物先導(dǎo)物。能進(jìn)行分子對接的軟件有很多，有用于小分子配體-受體進(jìn)行對接的軟件，也有用來進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子對接的軟件。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了AutoDock來進(jìn)行小分子配體和受體之間的分子對接模擬。AutoDock是由Scripps研究所Arthur J. Olson教授研究組開發(fā)的一款免費(fèi)分子對接軟件[13]。它采用遺傳算法和模擬退火來尋找配體小分子在受體結(jié)合口袋的最佳結(jié)合位置，用半經(jīng)驗(yàn)的自由能評價配體和受體之間的結(jié)合親和力。最新的版本不僅能考慮小分子配體的柔性，還可以考慮受體部分殘基的柔性。

在進(jìn)行分子對接之前，要準(zhǔn)備配體小分子和受體大分子的三維結(jié)構(gòu)坐標(biāo)文件。這部分的準(zhǔn)備文件使用免費(fèi)軟件ADT來完成。通過ADT里面的“Edit”和“Grid”菜單給受體大分子加上氫原子和電荷及溶劑化參數(shù)；通過“Ligand”菜單給配體小分子加氫和電荷。分子對接的結(jié)合口袋的定義可以通過“Grid”菜單完成。在“Grid”菜單里可以根據(jù)需要，選擇某個原子、某組原子或者小分子配體為結(jié)合口袋的中心，也可以根據(jù)需要定義結(jié)合口袋的半徑大小。分子對接需要的配置參數(shù)通過“Docking”菜單完成。一旦所有的參數(shù)文件和坐標(biāo)文件準(zhǔn)備好以后，就可以用AutoDock軟件里的“Autogrid4”和“Autodock4”命令進(jìn)行網(wǎng)格文件的生成和對接工作。對接結(jié)果的分析可以通過ADT的“Analysis”菜單完成，里面可以顯示對接后配體的所有構(gòu)象，并列出了各個構(gòu)象的能量、RMSd、排名等信息。一般根據(jù)結(jié)合能量值和RMSd值來綜合選擇最優(yōu)的對接結(jié)果。

2.7 虛擬篩選

虛擬篩選就是以計算機(jī)為工具，對虛擬化合物庫中的化合物與藥物靶標(biāo)的結(jié)合匹配程度進(jìn)行評估打分，挑選出打分高的化合物進(jìn)行后續(xù)的活性測試。虛擬篩選技術(shù)可以加速藥物發(fā)現(xiàn)的過程，降低研發(fā)成本，現(xiàn)已成為藥物設(shè)計領(lǐng)域的一種常規(guī)方法。虛擬篩選可以分為基于藥物靶標(biāo)的篩選和基于配體小分子的篩選。如果已知靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)，可以用基于分子對接的方法進(jìn)行虛擬篩選；如果靶標(biāo)三維結(jié)構(gòu)未知，可以用基于配體小分子的方法進(jìn)行虛擬篩選。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們選用基于分子對接的虛擬篩選方法，分子對接采用免費(fèi)的DOCK6程序[14]。DOCK是美國加州大學(xué)舊金山分校的Irwin Kuntz教授研究組開發(fā)的分子對接程序，是開發(fā)最早的分子對接程序。DOCK程序被廣泛應(yīng)用于基于受體結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計中，在多個藥物靶標(biāo)中都有成功的應(yīng)用。

虛擬篩選的第一步是要準(zhǔn)備供篩選的小分子化合物庫和靶標(biāo)蛋白的三維結(jié)構(gòu)。由于受課堂教學(xué)時間限制，我們事先準(zhǔn)備好了一個含50個小分子化合物的庫供篩選使用，該分子庫的加氫、加電荷等預(yù)處理工作均事先完成。靶標(biāo)分子的三維結(jié)構(gòu)的加氫、加電荷等預(yù)處理工作由軟件Chimera完成。Chimera是一款優(yōu)秀的顯示和分析分子結(jié)構(gòu)的免費(fèi)軟件[15]，能顯示和分析密度圖、超分子組裝、分子對接結(jié)果、動力學(xué)軌跡和構(gòu)象系綜等多方面的功能。通過Chimera的“Structure Editing”菜單下的“Dock Prep”選項，方便地給靶標(biāo)大分子加氫、加電荷和定義電離化殘基的質(zhì)子化狀態(tài)。

準(zhǔn)備好小分子庫和靶標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)文件后，就需要產(chǎn)生小分子結(jié)合口袋的球集文件。這一步依次需要用到三個命令：dms命令生成分子表面；sphgen命令產(chǎn)生球集；sphere_selector命令選擇球集。在這一步中，還需要學(xué)生用到第一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容學(xué)到的vi編輯器建立各種輸入文件。

利用生成的球集文件，再用命令showbox和grid產(chǎn)生對接所需的網(wǎng)格文件。利用vi編輯器建立一個分子對接的參數(shù)配置文件，最后利用dock6命令完成虛擬篩選工作。篩選的結(jié)果可以利用Chimera軟件中“surface/binding analysis”菜單中的“viewDock”選項進(jìn)行顯示和分析。

3 實(shí)踐效果

計算機(jī)輔助藥物設(shè)計是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的學(xué)科，要反復(fù)練習(xí)軟件的使用才能掌握其技巧。免費(fèi)軟件的使用不僅適合實(shí)驗(yàn)室教學(xué)，還可以讓學(xué)生安裝在自己的手提電腦，方便在課后進(jìn)行自由練習(xí)。我們這種理論結(jié)合實(shí)踐的教學(xué)模式獲得了一定成效。由我們教學(xué)團(tuán)隊指導(dǎo)的本科生先后獲得10余項“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)實(shí)驗(yàn)計劃”的國家級、市級和校級的立項。由唐赟老師指導(dǎo)的本科生先后獲得第三屆“全國大學(xué)生藥苑論壇”的優(yōu)秀論文獎，第四屆的創(chuàng)新成果三等獎，以及第三屆“上海市大學(xué)生創(chuàng)新論壇”的優(yōu)秀報告獎。這些軟件都是藥物設(shè)計領(lǐng)域的主流軟件，在學(xué)術(shù)界和制藥工業(yè)界有著廣泛的應(yīng)用。熟練掌握這些軟件的使用方法和操作技巧，對學(xué)生今后從事本領(lǐng)域的工作也能奠定良好的基礎(chǔ)。我們教學(xué)團(tuán)隊培養(yǎng)的學(xué)生在國內(nèi)讀研或出國深造的比例超過90%，其中繼續(xù)從事藥物設(shè)計研究的占50%以上。

4 結(jié) 語

藥物設(shè)計學(xué)特別是計算機(jī)輔助藥物設(shè)計在新藥的研發(fā)過程中發(fā)揮著越來越重要的作用。這門新興學(xué)科理論性強(qiáng)，對實(shí)踐操作要求高，與國際前沿發(fā)展趨勢結(jié)合緊密。面向本科生開設(shè)以計算機(jī)輔助藥物設(shè)計為主要內(nèi)容的“藥物設(shè)計實(shí)驗(yàn)”課程，是我們學(xué)院的一個學(xué)科特色。通過能免費(fèi)得到的分子模擬軟件的操作練習(xí)，一方面可以節(jié)約教學(xué)的成本，另一方面可以鞏固理論課的課堂教學(xué)，加強(qiáng)學(xué)生的實(shí)踐動手能力，培養(yǎng)他們的研究興趣。現(xiàn)在越來越多的藥學(xué)類高校開始重視藥物設(shè)計學(xué)課程的教學(xué)，也希望我們的這些經(jīng)驗(yàn)?zāi)転橥刑峁┮欢ǖ慕梃b作用。

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