高效液相體積排阻色譜法分析黃秋葵多糖的單糖組成

裘雅漁, 李巧玲, 程和勇

(1. 浙江大學(xué) 化學(xué)系， 浙江 杭州 310027； 2. 杭州師范大學(xué) 材料系， 浙江 杭州 310058)

0 引 言

黃秋葵單糖是從黃秋葵粗多糖酸水解后得到單糖組分,而黃秋葵粗多糖又是從黃秋葵嫩莢果中提取的水溶性成分。藥理學(xué)研究表明,這種由水溶性纖維果膠、半乳聚糖和阿拉伯樹膠等組成的黃秋葵粗多糖，具有保護腸胃、肝臟和皮膚粘膜作用[1～3]，并能刺激中樞神經(jīng)，加速血液循環(huán)及促進新陳代謝和全身血管活化[4]，可防治因血管供血不足造成的心臟病、中風(fēng)、骨質(zhì)疏松及老年癡呆等疾病[5]，因此對黃秋葵粗多糖的成分研究很有必要。由于粗多糖由各種基本的中性單糖組成的，因此對單糖組成測定是控制多糖質(zhì)量標準和提供多糖基本信息的最重要環(huán)節(jié)之一[6-8]。而單糖存在互變異構(gòu)體、差向異構(gòu)體、結(jié)構(gòu)相似等特征[9]，且往往同一待測樣品，如多糖、寡糖、糖肽、糖蛋白等可能含有許多類型的單糖[10-11]，所以單糖分析有其自身的特點，必須具有高效的分離技術(shù)，方可實現(xiàn)系列單糖的有效分離。羅利攀等用GC-MS方法[12]對不同產(chǎn)地的紅景天多糖進行單糖組分分析，雖然MS檢測器靈敏度很高，但需要對單糖進行衍生化處理，過程繁瑣且衍生化是否充分大大影響測定結(jié)果；王松柏等用毛細管電泳法[13]測定防風(fēng)粗多糖的單糖組分研究同樣存在柱前衍生的缺點；其他諸如用HPLC反相柱方法測定[14]絞股藍粗多糖的單糖組成存在分離度較差且流動相需用到大量乙腈等有毒試劑的明顯缺點。

本研究采用高效液相滲透色譜方法，用示差折光質(zhì)量型檢測器和磺化的聚苯乙烯二乙烯基苯陽離子交換樹脂(Pb2+)柱(交聯(lián)度為6%)，用去離子水做流動相建立適于黃秋葵多糖單糖組成測定的HPSEC新方法，達到靈敏度適宜、安全、快速、準確度高、操作簡單和可在線大批量分析的目標。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

WATERS 2690液相色譜儀(美國WATERS 公司)；PRE-PACKED COLUMN RT POLYSPHER CH PB 分析糖柱(德國MERCK公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；EZ-DRY冷凍干燥機(美國Filter公司)。三氟乙酸(TFA，Merck公司)；甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑)；乙腈(TEDIA公司)；葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖(FRU)，丙三醇(Gly)均購自Sigma公司,其他試劑均為分析純。黃秋葵多糖由本教研室制備。

1.2 黃秋葵多糖水解

精確稱取黃秋葵多糖樣品20.0 mg于安瓿中，分別加入2 mol/L TFA、2 mol/L H2SO4以及其混酸溶液2.0 mL，充氮氣封管，110 ℃油浴分別水解2、4、6、8和10 h。冷卻至室溫，反應(yīng)混合物1 000 r/min離心5 min，取上清液用0.3 mol/L NaOH溶液中和到約pH 7.0。

1.3 HPLC分析方法

采用WATERS 2690色譜系統(tǒng),WATERS 2410 示差折光檢測器，檢測器溫度40 ℃；柱溫80 ℃；色譜柱為Polyspher CH PB (7.8 mm× 300 mm,made in Germany)；流速0.6 mL/min；流動相為去離子水；進樣體積50 μL 。

1.4 分析原理與方法

1.4.1定量校正因子

以Gly(丙三醇)為內(nèi)標，測定7種單糖的定量較正因子(fVs)。精密稱取各標準單糖,并配制成2 mmol/L的母液，用時稀釋為5個不同濃度的單糖溶液，并進行HPLC分析 (線性范圍1～10 mmol)。

1.4.2相關(guān)系數(shù)與回歸方程

以單糖的濃度X(Wi/Ws)與峰面積Y(Ai/As)作圖，得回歸方程與相關(guān)系數(shù)。求出各單糖的斜率b，即定量較正因子,

f0fVs=(Wi/Ws)/(Ai/As)

式中，Ai、As分別為Gly(丙三醇)和標準單糖的HPLC峰面積。

1.4.3摩爾比的計算

以Gly為內(nèi)標，得到各單糖的峰面積與內(nèi)標的峰面積比，乘以f/m(m為單糖的相對分子質(zhì)量)，所得的值之比為摩爾比，即：

RVs=fVs(Ai/As)/m

2 結(jié)果與討論

2.1 單糖對照品的HPLC分離

為實現(xiàn)黃秋葵粗多糖各組成單糖的高效分離，本實驗對黃秋葵粗多糖可能包含的葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、木糖 (Xy1)、果糖(FRU))7種標準單糖及內(nèi)標Gly的高效液相色譜分離條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，在2.5 mmol/L 醋酸水溶液，5 mmol/L醋酸水溶液 和 去離子水三者之間選擇，去離子水中的分辨率高，分離效率最好，且樣品容量大，因此去離子水為分離此7種單糖的較理想色譜分離條件。色譜峰的各峰保留時間依次為內(nèi)標Gly,葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)、甘露糖(Man)、半乳糖(Ga1)、鼠李糖(Rha)、果糖(FRU)以及木糖 (Xy1)。其中，內(nèi)標Gly與其他單糖有很好的分離，其作為內(nèi)標是合適的。

2.2 多糖水解樣品制備條件優(yōu)化

多糖水解樣品的制備通常要經(jīng)復(fù)雜的干燥過程，方可進行下一步的分析。本樣品制備方法省略干燥過程，而將多糖水解液直接用NaOH中和(約中性)，這對于發(fā)展多糖的定性定量在線分析技術(shù)有重要的實際意義。該制備方法的特點是：① 簡化工藝，避免干燥損失。② 該多糖水解樣品制備過程對多糖的組成測定無影響。圖1是黃秋葵多糖經(jīng)TFA水解后，水解液經(jīng)傳統(tǒng)的干燥過程和未經(jīng)干燥過程的HPLC圖，圖中未發(fā)現(xiàn)有明顯吸收峰改變。③ 對多糖的含量、單糖組成等定量分析更有意義，因此過程幾乎無糖損失，多糖水解液可直接進行在線大批量分析監(jiān)測。

2.3 黃秋葵多糖樣品的單糖組成分析

2.3.1多糖水解時間對分析結(jié)果的影響

考察了TFA的不同水解時間對黃秋葵多糖的組成測定結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2所示。黃秋葵多糖隨水解時間的延長，測定的單糖摩爾比率增加，而在110 ℃用2 mmol/L TFA水解8 h后，水解已完全?？梢?，黃秋葵多糖經(jīng)TFA水解8 h為其合適的水解時間。

(a) 干燥

(b) 無干燥

圖2 黃秋葵多糖經(jīng)TFA水解的時間對各組成單糖的測定影響

2.3.2不同酸水解對黃秋葵多糖的單糖組成測定的影響

選擇用于水解多糖的合適種類的酸對準確測定單糖組成非常重要。本研究考察了常用的TFA、H2SO4及其混酸等不同酸水解方法對黃秋葵多糖的組成測定結(jié)果的影響(見圖3)。結(jié)果表明，TFA和H2SO4對黃秋葵多糖的水解效果無明顯影響，但TFA和H2SO4混酸水解該多糖時，單糖測定結(jié)果有一定的變化，其原因尚不清楚。所以，本實驗選用TFA水解8 h為黃秋葵多糖的合適水解時間。

(a) 單糖標準品+丙三醇

(c) H2SO4

1-葡萄糖， 2-阿拉伯糖， 3-甘露糖， 4-半乳糖， 5-鼠李糖， 6-果糖， 7-木糖

圖3 黃秋葵多糖的不同酸水解樣品的色譜圖

2.3.3黃秋葵多糖的單糖組成測定結(jié)果

由HPSEC-RID分析和摩爾比計算結(jié)果可知，黃秋葵多糖由木糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、半乳糖及阿拉伯糖7種單糖組成，其摩爾比為0.57∶1.00∶0.53∶3.50∶1.75∶1.25∶1.70，單糖測定的精密度(RSD，n=3)均低于4.5% ，測定結(jié)果重復(fù)性良好(見表1)。

3 結(jié) 語

本研究通過凝膠滲透HPSEC法，實現(xiàn)在普通實驗室常用示差折光檢測器和聚苯乙烯二乙烯基苯陽離子交換樹脂(Pb2+)糖柱分離分析黃秋葵多糖的單糖組成，并可望推廣用于其他多糖的單糖組成測定；同時，建立了黃秋葵多糖水解樣品的制備優(yōu)化工藝，避免了傳統(tǒng)多糖水解產(chǎn)物的復(fù)雜干燥過程和進行繁瑣的衍生化反應(yīng)[15]；此外，該技術(shù)的完善，將在食品糖含量控制、大輸液葡萄糖監(jiān)測等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，并為發(fā)展黃秋葵多糖以及其他多糖的在線定性定量HPSEC-RID方法奠定基礎(chǔ)。

表1 黃秋葵多糖的組成測定結(jié)果

[1] Katsutoshi H，Keiichiro E, Koji H. A convenient synthesis of lepidimoide fromokramucilage and its growth-promoting activity inhypocotyls[J]．Carbohydrate Research，2004，339：9-19．

[2] ROM ANCHIK-CERPOVICE J E，TILMON R W ，BALDREE K A. Moisture remnfion and consumer acceptability of chocolate bar cookiesprepared with okra gum as a fat ingredient substitute[J]．Journal of the Aencan Dietetic Assoeiation，2002，102(9)：1301- 1303．

[3] 李建華，陳 珊．黃秋葵水提液抗疲勞的藥效學(xué)觀察[J]．中國運動醫(yī)藥學(xué)雜志 , 2004，23(2)：196-197．

Li Jian-hua, Chen Shan . pharmacodynamics of okra extract anti fatigue [J]． Chinese Journal of Sports Medicine，2004，23(2)：196-197．

[4] 李學(xué)智．黃秋葵嫩莢的食用品質(zhì)及貯藏的生理研究[D]．杭州：浙江大學(xué),2003．

[5] Sedat C，Musa O Z C，Haydar H M,etal．A study on somephysico—chemi cal properties of Turkey okra(Hibiscus esculentaL．) seeds[J]．Journal of Food Engineering，2005，68： 73-78.

[6] 楊興斌，趙 燕，周四元,等． 柱前衍生化高效液相色譜法分析當歸多糖的單糖組成[J]. 分析化學(xué)，2005,33(9)：1287-1290.

Yang Xing-bin, Zhao Yan, Zhou Si-yuan,etal. Analysis of monosaccharide composition in Angelica polysaccharides by precolumn Derivatization High Performance Liquid Chromatography. [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry，2005,33(9)：1287-1290.

[7] 龔慶芳，周 浩，王新桂,等．7種石斛多糖質(zhì)量分數(shù)的測定及單糖組成[J]. 食品科技，2013，3(8)：172-175.

Gong Qing-fang, Zhou Hao, Wang Xin-gui,etal. Determination of the content and monosaccharide composition of 7 species of Dendrobium polysaccharide[J]. Food Science and Technology，2013，3(8)：172-175.

[8] 程小喬，李 科，陳雪梅,等． 若干雙子葉與單子葉植物細胞壁果膠結(jié)構(gòu)單糖組成研究[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012,34(5):47-52.

Cheng Xiao-qiao, Li Ke, Chen Xue-meietal. Comparison of Pectin structural monosaccharides in cell wall of dicotyledon and monocotyledon [J]. Journal of Beijing Forestory University，2012,34(5):47-52.

[9] 胡 坪，喬晚芳，沈駿文,等. 麥冬多糖單糖組成的分析方法研究[J]. 藥物分析學(xué)報，2013,33(1)：50-56.

Hu ping,Qiao WAN-fang ,Shen Jun-wen,etal.Study on the analysis method of monosaccharide composition in Ophiopogon japonicas polusaccharides [J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis，2013,33(1)：50-56.

[10] 郝蕾蕾，張典瑞，趙忠熙,等． 柱前衍生化HPLC法測定黃河灘棗多糖的單糖組成[J]. 中國生化藥物雜志，2012,33(6)：57-59.

Hao Lei-lei, Zhang Dian-rui, Zhao Zhong-xi,etal. Determination of monosaccharide components of Huanghe jujube polysaccharides by pre-column derivatization HPLC method [J] .Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics，2012,33(6)：57-59.

[11] 顏 軍，易 勇，鄒曉勇,等．黃芪多糖的相對分子量測定及單糖組成分析[J]．食品科技，2012,12(2):33-35.

Yan jun,Yi Yong, Zou Xiao-yong,etal. Determination and monosaccharide composition analysis of relative molecular weight of Astragalus Polysaccharides [J]． Food Science and Technology，2012,12(2):33-35.

[12] 羅利攀，鐘國輝，田發(fā)益,等． 不同產(chǎn)地大花紅景天多糖的單糖組成分析[J] ．食品與發(fā)酵工業(yè)，2013,39(4)：26-28.

Row ley- pan, Zhong Guo-hui, Tian FA- Yi ,etal. Monosaccharide composition analysis of polysaccharides in Rhodiola crenulata from different habitats [J] ． Sichuan Food and Fermentation，2013,39(4)：26-28.

[13] 王松柏，秦雪梅．毛細管電泳法測定防風(fēng)多糖中單糖的含量[J]．光譜實驗室，2013,30(3)：56-58.

Wang Song-bai, Qin Xue-mei. Detection of Monosaccharide Constituents in Saposhnikovia divaricata(Turcs.)Schichk Polysaccharides by HPCE [J]. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2013, 30(3)：56-58.

[14] 王 峰，嚴 東， 侯 杰,等． 絞股藍多糖的單糖組成分析及其抗氧化活性研究[J] ．食品科技，2013(3)：183-187.

Wang Feng, Yan Dong, Hou Jie,etal. Constituents and antioxidant activity of polysaccharides in Gynostemm [J]. Food Science and Technology，2013(3)：36-40.

[15] 王鳳麗，汪鳳梅，習(xí)玲玲,等. 納米銅∕石墨烯修飾電極用于離子交換色譜測定五種單糖[J].分析化學(xué)，2013,41(10):1601-1605.

WANG Feng-li, WANG Feng-mei, XI Ling-ling,etal. Ion-exchange Chromatography with Electrochemical Detection Using Copper Nanoparticles∕Graphene Composite Film Modified Electrode for Determination pf Monosaccharide [J].Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013,41(10):1601-1605.