核磁共振法無(wú)損傷測(cè)定五峰綠茶中咖啡因含量

陳連清， 陳 玉， 周忠強(qiáng)， 曾 雄

(中南民族大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430074)

0 引 言

茶葉中含有多種生物堿，其主要成分為咖啡因，咖啡因含量是衡量茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[1]。少量咖啡因能使身心處于一種興奮狀態(tài)，刺激機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，誘發(fā)腎上腺素釋放入血，增高機(jī)體血糖水平，提高注意力。過(guò)量的咖啡因使人精神疲倦、身體發(fā)顫、難以入睡、刺激胃粘膜。目前測(cè)定茶葉中咖啡因含量的方法有碘滴定法、紫外分光光度法、薄層色譜法和高效液相色譜法等。碘量法中，Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性較差，容易受水中的CO2、微生物等作用而被氧化，滴定要求高、操作復(fù)雜，極易造成誤差，測(cè)定準(zhǔn)確性低[2]；紫外分光光度法前處理過(guò)程復(fù)雜，由于是利用咖啡因結(jié)構(gòu)上的嘌呤環(huán)有共軛雙鍵體系，具有獨(dú)特吸收波長(zhǎng)274 nm來(lái)測(cè)定，其測(cè)量值是茶葉中嘌呤堿的總量，測(cè)定結(jié)果往往偏高[3]；薄層色譜法的展開(kāi)劑選擇過(guò)程繁瑣煩，分離效果直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)誤差較大[4]；高效液相色譜法是目前測(cè)定咖啡因含量的國(guó)際通用方法，但由于儀器昂貴，普通實(shí)驗(yàn)室條件無(wú)法滿足，在測(cè)定前，樣品需要用幾種有機(jī)溶劑反復(fù)萃取、回收溶劑，操作繁瑣，樣品微量成分會(huì)損失，測(cè)定結(jié)果偏低[5-9]。上述方法共同的缺點(diǎn)是必須損壞樣品才能進(jìn)行測(cè)定。如何無(wú)損傷且快速準(zhǔn)確地測(cè)定各種茶葉中的咖啡因含量并嘗試建立一種衡量茶葉品質(zhì)的指標(biāo)是擺在科學(xué)家面前的一大難題。

核磁共振法(NMR)是一種現(xiàn)代儀器分析方法。NMR 技術(shù)最初只應(yīng)用于物理學(xué)領(lǐng)域，隨著超導(dǎo)技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)和脈沖傅里葉變換波譜儀的迅速發(fā)展，NMR已成為當(dāng)今鑒定化合物結(jié)構(gòu)和研究化學(xué)動(dòng)力學(xué)等極為重要的方法，其在有機(jī)化學(xué)、食品科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，特別是無(wú)損傷測(cè)定樣品中某一成分含量技術(shù)越來(lái)越受到人們青睞[10-13]。NMR能檢測(cè)的化合物并不要求有揮發(fā)性或生色團(tuán)，其測(cè)定樣品是非破壞性的，這意味著樣品在測(cè)定后還可以用于其他方法分析。更重要的是，只要很少的樣品預(yù)處理，就可以獲得提取物的結(jié)構(gòu)信息。

本文采用微型實(shí)驗(yàn)裝置對(duì)茶葉中咖啡因的提取方法進(jìn)行了探討，并通過(guò)NMR建立咖啡因含量和核磁氫譜積分面積標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，從而通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線求解五峰綠茶咖啡因含量。該方法操作簡(jiǎn)便、試劑用量少、無(wú)損傷，重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試劑

傅里葉紅外光譜儀(KBr壓片, Nexus 470 FTIR型，日本島津)、核磁共振儀(Bruker AVANCE 400 MHz型，德國(guó))、微型電熱套、XT-4顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀、Mettler Toledo AG204電子天平、UV-9100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、DL-101-2B烘箱(天津中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐公司)、KQ-250DB型超聲波清洗器、LGJ-10冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展公司)，TDZ4-WS臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器公司)，真空干燥箱。蒸餾水、甲醇、DMSO-d6(99.9 %, TMS, Cambridge Isotope公司)，95 %乙醇，生石灰等均為市售分析純，使用前沒(méi)有進(jìn)一步純化。五峰綠茶由湖北五峰翠碧春茶葉專業(yè)合作社提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 咖啡因提取

茶葉中提取咖啡因是有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中天然產(chǎn)物提取的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)一般采用常量法，以乙醇為溶劑，采用Soxhlet提取器連續(xù)提取，對(duì)提取液脫色，蒸發(fā)溶劑得到咖啡因粗品，用生石灰除去水分及丹寧酸等雜質(zhì)，再通過(guò)升華提純獲得純品。實(shí)驗(yàn)溶劑用量較大，耗時(shí)較長(zhǎng)，學(xué)生不易操作Soxhlet提取器，尤其是對(duì)升華操作中溫度的控制難以掌握。針對(duì)上述難題，本文提出針對(duì)性改進(jìn)意見(jiàn)：采用微型實(shí)驗(yàn)裝置；用恒壓滴液漏斗代替索氏提取器；改進(jìn)升華裝置；用過(guò)量氧化鈣中和殘夜里酸性物質(zhì)，使實(shí)驗(yàn)裝置更簡(jiǎn)便，易操作，實(shí)現(xiàn)了平衡狀態(tài)下的連續(xù)萃取，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了咖啡因的產(chǎn)率和純度[14]。

圖1 提取裝置圖2 電熱套升華裝置

具體操作：在25 mL圓底燒瓶中加2粒沸石，稱取1.0 g茶葉，研細(xì)拌勻，用濾紙包好放入恒壓漏斗中，按圖1所示搭好提取裝置。加入15 mL乙醇，回流，乙醇蒸汽從恒壓漏斗側(cè)管上升，冷凝后滴到茶葉上，當(dāng)溶劑能浸泡茶葉時(shí)，調(diào)節(jié)恒壓漏斗活塞，使冷凝液滴入速度與放液速度一致，熱溶劑重復(fù)使用，茶葉每一次都接觸到新溶劑，提取0.5 h。改為常壓蒸餾裝置，濃縮提取液至2.0 mL。將殘液轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中，不斷攪拌下，加入1.5 g 氧化鈣，邊蒸邊碾，至固體變?yōu)榧?xì)小粉末，再利用電熱套的余熱焙炒片刻，除盡水分。冷卻后，將塞有棉花的三角漏斗倒扣上面，放在電熱套上加熱升華 (見(jiàn)圖2)，當(dāng)濾紙上出現(xiàn)少許毛狀結(jié)晶時(shí)，暫停加熱，冷卻，收集白色針狀晶體，產(chǎn)量為13.4 mg。

2.2 咖啡因標(biāo)樣的制備

咖啡因晶體55℃真空干燥2 h，于蒸發(fā)皿中再次升華得到咖啡因標(biāo)樣，測(cè)其熔點(diǎn)，溴化鉀壓片測(cè)定紅外光譜,如圖3所示。標(biāo)樣用XT-4顯微熔點(diǎn)儀測(cè)定熔點(diǎn)為234.34～235.67 ℃，與國(guó)家藥典報(bào)道值一致[15]，紅外光譜經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后與咖啡因圖譜一致。

2.3 NMS測(cè)定咖啡因含量

2.3.1樣品前處理

經(jīng)過(guò)2次升華后得到的咖啡因晶體作為標(biāo)樣。待測(cè)五峰綠茶充分研磨過(guò)60目篩，55℃真空干燥2 h。準(zhǔn)確稱取(0.500±0.001) g待測(cè)干燥茶葉粉末置于50 mL錐形瓶，加入10 mL 70%的甲醇水溶液，稱重后超聲提取30 min，冷卻后補(bǔ)重，以3 000 r/min離心10 min，準(zhǔn)確量取0.48 mL上清液，在真空干燥器中揮發(fā)干甲醇后，加入適量蒸餾水，混勻后冷凍干燥。冷凍干燥后獲取的提取粉末，置于干燥器中，作為待測(cè)樣品避光保存。

2.3.2核磁測(cè)試條件[16]

將標(biāo)樣或充分干燥的五峰綠茶提取物用0.48 mL DMSO-d6( 99.9%+0.03%V/V TMS) 溶解后，轉(zhuǎn)移入核磁樣品管進(jìn)行NMR測(cè)定。NMR測(cè)試條件: DMSO-d6作為內(nèi)鎖，299.5 K，掃描128次，產(chǎn)生37 268個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，譜寬為8 223.685 Hz，采樣時(shí)間2.0 s，脈沖間隔1.00 s，使用預(yù)飽和壓制序列在δ3.315處壓制水峰。通過(guò)核磁自帶軟件Topspin 進(jìn)行傅里葉變換，將TMS峰定位為D0.00，手動(dòng)調(diào)節(jié)相位，通過(guò)MestRe-C軟件調(diào)基線后，以0.01為最小間隔積分，計(jì)算峰面積(見(jiàn)圖4)。

圖4 咖啡因標(biāo)樣的核磁氫譜標(biāo)準(zhǔn)圖

2.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取0.003、0.006、0.009、0.012、0.015、(0.018±0.001) g咖啡因標(biāo)樣，用0.48 mL DMSO-d6溶解后，轉(zhuǎn)移入樣品管進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)核磁共振法得到6個(gè)不同濃度的咖啡因氫譜圖，利用δ8.05(s, 1H)處質(zhì)子峰積分面積建立咖啡因含量與氫譜積分面積標(biāo)準(zhǔn)曲線：以核磁氫譜積分面積(y)為縱坐標(biāo)，咖啡因標(biāo)樣含量(x)為橫坐標(biāo)，建立咖啡因標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖5)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=100.428 57x+0.125 39，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。表明咖啡因在0.125 4～2.234 3 mg時(shí)，核磁氫譜積分面積與咖啡因含量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖5 咖啡因含量與核磁氫譜積分值標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.4精密度

稱取0.012 g標(biāo)準(zhǔn)樣品，用0.48 mLDMSO-d6溶解后，轉(zhuǎn)移入樣品管重復(fù)測(cè)試6次。結(jié)果表明，δ8.05(s, 1H)處質(zhì)子峰積分面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)為0.9 %，小于2 %，說(shuō)明核磁共振儀的精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性

稱取0.012 g標(biāo)準(zhǔn)樣品，用0.48 mLDMSO-d6溶解后，分別于樣品制備好后0、2、4、6及8 h進(jìn)行測(cè)試，測(cè)定質(zhì)子峰積分面積。結(jié)果表明，咖啡因積分面積的RSD為1.56%，說(shuō)明標(biāo)樣溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6重現(xiàn)性

對(duì)同一批標(biāo)準(zhǔn)樣品用0.48 mL DMSO-d6溶解后，轉(zhuǎn)移入樣品管測(cè)定質(zhì)子峰積分面積并計(jì)算咖啡因含量，其RSD為1.23%。表明同批樣品經(jīng)多次測(cè)定，重現(xiàn)性良好。

2.3.7回收率

取經(jīng)過(guò)測(cè)定，咖啡因含量為0.252 4 mg五峰綠茶待測(cè)DMSO-d6溶液6份，各0.48 mL，分別加入咖啡因標(biāo)準(zhǔn)樣品約0.2 mg，測(cè)定其核磁氫譜，結(jié)果見(jiàn)表1。平均回收率為99.8 %，說(shuō)明加標(biāo)回收率良好。

表1 加標(biāo)回收率測(cè)定(n = 6)

2.4 五峰綠茶樣品測(cè)定

將充分干燥的綠茶提取物用0.48 mL DMSO-d6溶解后，轉(zhuǎn)移入樣品管進(jìn)行NMR測(cè)定。同一樣品平行測(cè)試3次。通過(guò)MestRe-C軟件調(diào)基線后，對(duì)待測(cè)樣品δ 8.05(s, 1H)質(zhì)子峰進(jìn)行積分，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)求取對(duì)應(yīng)樣品中咖啡因含量(見(jiàn)圖6)，結(jié)果見(jiàn)表2。研究表明，不同等級(jí)的五峰綠茶咖啡因含量差異較大，特級(jí)茶中咖啡因含量在10 %以上，一、二、三級(jí)五峰綠茶中咖啡因含量在6%～8%之間，而炒青茶屬于采收末期的茶葉，咖啡因含量小于5%?？梢?jiàn)咖啡因含量是五峰綠茶等級(jí)的一個(gè)客觀評(píng)判指標(biāo)。

圖6 某待測(cè)五峰綠茶的核磁氫譜圖

茶葉等級(jí)咖啡因含量/%相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差/%特級(jí)12．560．49一級(jí)10．150．36二級(jí)8．730．62三級(jí)7．350．59炒青5．120．48

3 結(jié) 語(yǔ)

與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法相比較，采用微型實(shí)驗(yàn)裝置，符合綠色化學(xué)要求，減少溶劑用量；利用恒壓分液漏斗替代Soxhlet提取器，儀器不易損壞，實(shí)現(xiàn)平衡狀態(tài)下連續(xù)提取，大大縮短時(shí)間；增加氧化鈣用量，可完全中和丹寧酸，減少色素和雜質(zhì)，產(chǎn)率提高；利用電熱套升華裝置，通過(guò)鐵圈調(diào)節(jié)蒸發(fā)皿的高度，調(diào)節(jié)電熱套電壓的大小來(lái)控制加熱溫度，使升華溫度精確控制，避免樣品碳化和變焦，為得到高純度、高產(chǎn)率的咖啡因提供了重要的保證[17]。

本文首次利用核磁共振法譜圖積分功能，建立咖啡因含量與特定氫原子積分面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用甲醇提取冷凍干燥技術(shù)制樣，測(cè)定不同等級(jí)的五峰綠茶咖啡因的含量，創(chuàng)造性建立了快速準(zhǔn)確、無(wú)損傷，預(yù)處理簡(jiǎn)便的茶葉中咖啡因含量測(cè)定方法。該方法并不要求樣品有揮發(fā)性或生色團(tuán)，樣品是非破壞性的，樣品在測(cè)定后還可以用于其他方法分析，其靈敏度也非常高，操作簡(jiǎn)單、快速準(zhǔn)確，測(cè)定結(jié)果可作為評(píng)價(jià)不同等級(jí)五峰綠茶質(zhì)量的重要評(píng)判指標(biāo)。本文建立的“核磁共振法無(wú)損害茶葉中咖啡因含量”的檢測(cè)方法還可以應(yīng)用到其他食品的檢測(cè)，如測(cè)定地溝油、摻假成品油中油料含量，測(cè)定摻水牛奶中的造假程度(水的含量)等。

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