藤梨根含藥血清對雞胚尿囊膜微血管生長的影響?

吳秋玲,劉竺華,李朝喧,周曉麗

(1．山西中醫(yī)學院，太原 030024； 2.山西省中醫(yī)院，太原 030001)

長期以來,腫瘤一直是危害人類健康的重要殺手，而其中大多數(shù)患者均死于腫瘤的浸潤和轉移。臨床上如何防止腫瘤的浸潤轉移，是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)。“腫瘤生長依賴血管生成”假說的提出，使抗血管生成的研究得到廣泛關注，目前國內(nèi)外眾多學者把研究的重點轉移到從中藥中篩選抑制腫瘤新生血管的藥物。藤梨根為獼猴桃科獼猴桃，屬軟棗獼猴桃的根，性酸、澀、涼，具有清熱解毒、消腫疥、祛風除濕、利尿止血的功效，臨床廣泛用于抗腫瘤治療，常與野葡萄藤、半枝蓮、半邊蓮、白茅根等配伍使用于各種癌癥,尤對消化道腫瘤胃癌、腸癌等療效顯著。

本實驗采用雞胚絨毛尿囊膜(CAM)技術和計算機圖像分析技術，觀察中藥藤梨根含藥血清對雞胚絨毛尿囊膜血管新生的影響，以衡量中藥藤梨根抑制或誘生新血管生成的能力，探討藤梨根抗腫瘤的作用機制，為臨床中藥治療腫瘤并防止腫瘤轉移提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新鮮白皮種蛋，表面清潔,每枚重50 g～60 g， 蛋殼均質，受精率>95%，購自山西農(nóng)科院養(yǎng)殖場。8周齡Wistar大鼠12只，雌雄各半，體質量(190±20) g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 實驗儀器 電熱恒溫孵育箱，DHP-9162上海-恒科技有限公司；超凈工作臺， 上海巴艾貝斯；倒置熒光顯微鏡圖像采集處理系統(tǒng)；醫(yī)用圖像分析儀，Image-Pro，美國；解剖顯微鏡，德國Leica公司；眼科剪、眼科鑷，上海醫(yī)療器械公司。

1.1.3 主要實驗藥品 藤梨根由山西省中醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)專家鑒定質量符合實驗要求。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清的制備 (1)藤梨根濃縮液的制備：取藤梨根120 g，按常規(guī)中草藥煎煮方法，煎煮提取濃縮至60 ml，得含相當于藤梨根生藥2 g/ml的濃縮液，冷卻保存?zhèn)溆茫?2)動物選擇與分組：清潔級Wistar大鼠12只，雌雄各半，隨機數(shù)字表法分為高劑量組、低劑量組、血清組(陰性對照組)，每組4只；(3)給藥方法：藤梨根制成水煎濃縮液，劑量參考李振光報道的給藥劑量[1]。高劑量為臨床成人(體質量60 kg)劑量的20倍，低劑量為臨床成人(體質量60 kg)劑量的10倍，換算得出大鼠每100 g體質量每天給藤梨根高劑量為3.125 ml藤梨根濃縮液(即6.25 g)，低劑量組減半。血清組給予每天2 ml生理鹽水。大鼠每天2次灌胃給藥,連續(xù)給藥1周；(4)含藥血清的制備：第7天于灌胃給藥2 h后，以10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血5 ml離心，吸取透明上清液，分離血清、滅活、除菌,試管分裝，-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CAM模型的制備 (1)種蛋表面依次以溫水(30～38 ℃)和1∶1000新潔爾滅液溶液消毒后開始孵育。種蛋孵育于有通氣孔且溫度設置為38.4 ℃的培養(yǎng)箱中(濕度在65～75%)，4 d后溫度設置為38.2 ℃。每天轉蛋4～5次，并檢查胚胎發(fā)育情況，及時淘汰發(fā)育不良的種蛋；(2)于第2～10天在照卵燈指示下尋找胚頭，確定雞胚絨毛尿囊膜位置。酒精消毒開窗位置，用牙科鉆在氣室頂端打1 mm～2 mm小孔并穿透氣室殼膜，在距胚頭前0.5 cm，兩條卵黃靜脈之間的卵殼投影部位用筆標記出面積2 cm×1.5 cm區(qū)域,用牙科鉆在表面輕輕磨切出凹痕,無菌生理鹽水消毒，用眼科鑷平行向上輕揭凹陷處蛋皮，輕撕內(nèi)殼膜暴露CAM，制成假氣室。以滅菌透明膠膜封閉假氣室，形成透明觀察窗。解剖顯微鏡下觀察并原位攝影。

1.2.3 藤梨根對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的影響 (1)于孵育第6天，在檢卵燈下觀測并標記氣室及雞胚位置，同上述方法制成假氣室。顯微鏡下觀察并記錄；(2)給藥方法:制備假氣室之后，用眼科鑷將無菌明膠海綿小塊(3 mm×3 mm×3 mm)置于藤梨根含藥血清中，充分飽和后，放置于距離胚頭0.5 cm處兩條卵黃靜脈之間的相對少血管區(qū)，無菌透明膠膜封貼，38.2 ℃孵育48 h；(3)觀察方法:孵育48 h后剝離假氣室周圍的蛋殼，使尿囊膜充分暴露，解剖顯微鏡下記錄血管圖像；(4)檢測指標:將錄制好的圖像調(diào)入圖像分析軟件，參考文獻計數(shù)方法，以明膠海綿為中心選取相同面積的4個區(qū)域，應用醫(yī)用圖像處理軟件測出所選區(qū)域的血管數(shù)量和血管面積。

2 結果

2.1 藤梨根高低劑量組對CAM血管生成數(shù)量的影響

表1顯示,我們之前的實驗結果提示，4至6 d雞胚對于研究觀察血管生成情況最理想，但4～5 d的雞胚生命力弱、死亡率較高。 6 d雞胚血管網(wǎng)初步形成，可觀察到數(shù)量較多的小血管及分支，較適宜觀察藥物對血管生成影響的研究，因此選擇6 d雞胚進行觀察研究。實驗結果顯示，藤梨根高劑量組與空白組、血清組相比較，有較明顯的抑制新血管生成能力，藤梨根低劑量組與空白組比較有一定的抑制作用但不顯著(P<0.01)。

2.2 藤梨根高低劑量組對CAM血管面積影響

表1顯示，藤梨根高低劑量組具有一定抑制血管生成面積的作用，但差異無統(tǒng)計學意義，血清組和空白組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

惡性腫瘤被古代醫(yī)家歸屬于為積聚、石瘕、癥瘕等范疇?！吨T病源候論》指出:“積聚者由于陰陽不和，臟腑虛弱，受之于風邪，搏于臟腑之氣所謂也?！?《中藏經(jīng)》中指出，癌瘤等“之所作也，皆五臟六腑蓄毒不流則生矣，非獨因榮衛(wèi)壅塞而發(fā)者也”。認為臟腑“蓄毒不流”是這類難治性疾病的病機本質，而瘀血留于局部，即惡血，日久可腐變或潰爛成毒，故又有“瘀毒”之說?！妒備洝分杏小岸緹醿?nèi)壅，則變?yōu)轲鲅钡恼f法。清代醫(yī)家王清任進一步分析：“蘊毒在內(nèi)，燒煉其血，血受煉燒，其血必凝”，遂成毒瘀?！度数S直指附遺方》指出：“癌者，上高下深，巖穴之狀，顆粒累垂，毒根深藏。”同樣提出了“毒根深藏”是癌瘤難治的關鍵。有學者認為這“深藏”的毒根，就是存在于腫瘤內(nèi)生長迅速的功能性血管，而這些血管供應著豐富的血液，促使腫瘤快速增殖。故目前許多專家認為，腫瘤治療當采用清熱解毒、活血化瘀等方法。藤梨根具有清熱解毒、祛風除濕的功效，臨床廣泛用于抗腫瘤治療，尤對消化道腫瘤如胃癌、腸癌等療效顯著。在前期小鼠體內(nèi)抗腫瘤轉移的預實驗中我們發(fā)現(xiàn)，藤梨根作用后瘤體縮小，顯微鏡下觀察瘤體內(nèi)血管減少，由此推測抑制血管生成可能是其抗腫瘤的機制之一，因此我們通過觀察藤梨根對CAM血管形成的影響，進一步探討藤梨根抑制腫瘤的機理。

表1 藤梨根含藥血清對CAM血管生成的影響

注：與空白組比較:*P<0.05，**P<0.01，與血清組比較:△P<0.05，△△P<0.01，用藥組等劑量比較：▲▲P<0.01

血管生成模型的建立是腫瘤抗血管生成研究必須的關鍵性步驟。自Folkman[2]提出抗血管生成理論至今,對腫瘤血管形成的機制和抗血管生成藥物篩選等方面的研究已取得較大進展。大量的血管生成模型已建立,體外模型如內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和小管形成以及組織模型；體內(nèi)模型如動物角膜或虹膜內(nèi)腫瘤移植模型、皮下氣囊模型、顱窗軟腦膜血管模型、兔耳廓和皮膚內(nèi)移植模型等。雞胚絨毛尿囊膜模型相比其他模型具有一定的優(yōu)勢,如雞胚發(fā)育初期血管與腫瘤細胞的新生血管相似, 均表現(xiàn)為內(nèi)皮細胞胞漿少，線粒體豐富，毛細血管缺少外周細胞；而且作為一種天然的免疫缺陷宿主，雞胚可接受癌細胞接種和組織的移植；CAM技術較簡便，能耐受一定范圍的溫度變化，且價格低廉,故被廣泛采用。本實驗結果為中藥藤梨根臨床抗腫瘤提供實驗依據(jù)，值得在此基礎上進一步深入研究，如對腫瘤血管內(nèi)皮細胞凋亡情況和VEGF的表達情況等進行研究，揭示中藥抗腫瘤的機理，為臨床治療腫瘤尋找副作用小的高效中藥。

[1] 李振光,王凈凈.關于中藥血清藥理學方法的思考[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2002,9(2):5.

[2] Folkman J.Tumor angiogenesis, therapeutic implications[J]. N Engl J Med,1971,285(21):1182-1186.