離子液體修飾的SBA-16材料在豬胰脂肪酶固定化中的應(yīng)用

鄒 彬，初旭明，張 洋，胡 燚

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,南京211800)

離子液體修飾的SBA-16材料在豬胰脂肪酶固定化中的應(yīng)用

鄒 彬，初旭明，張 洋，胡 燚

(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,南京211800)

合成了功能化的甲基咪唑類離子液體，并將功能化離子液體修飾介孔材料 SBA-16。以三乙酸甘油酯的水解為探針反應(yīng)，考察離子液體修飾的 SBA-16 固定化豬胰脂肪酶(PPL) 的酶活、最適反應(yīng)條件及重復(fù)穩(wěn)定性等酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：固定化酶對溫度的敏感度降低，酶活力及穩(wěn)定性均顯著提高，比酶活是原粉 SBA-16 固定化酶的1.75 倍，重復(fù)使用6次后仍然保持最初活性的57%；與原粉 SBA-16 固定化酶保留的38%相比，有明顯的提高。同時通過N2吸附-脫附、紅外光譜和熱重等方法分析了離子液體修飾對 SBA-16 結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，離子液體修飾后材料保持了原有的介孔結(jié)構(gòu)，修飾后載體表面性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)導(dǎo)致了PPL酶學(xué)性質(zhì)的變化。

固定化；離子液體；介孔材料；脂肪酶；修飾

固定化酶由于具有容易分離、能夠循環(huán)使用及穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，在食品及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用。通常，固定化酶的催化性能取決于固定化方法和固定化載體[1-4]。酶的固定化方法主要分為吸附、共價、包埋及交聯(lián)等4大類。其中，吸附法是利用靜電作用、氫鍵、疏水相互作用和范德華力作用使酶與水不溶性大分子載體結(jié)合的一種方法。吸附法的顯著優(yōu)勢在于操作簡便、條件溫和、不易破壞酶分子的三維結(jié)構(gòu)而影響活性中心的構(gòu)象；但是該方法的缺點(diǎn)在于酶與載體之間的結(jié)合不牢固，在使用過程中酶容易從載體中溢出[5-6]。因此，固定化酶載體材料的選擇與表面修飾至關(guān)重要[7-9]。無機(jī)介孔材料SBA-16不僅具有固定化載體所需要具備的機(jī)械強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、易于再生及表面易修飾等優(yōu)點(diǎn)，而且還具有允許大分子進(jìn)入的孔徑(2～50 nm)、高的比表面積(1 000 m2/g)、大的吸附容量及三維孔道立體交叉利于物料傳輸?shù)忍匦?。修飾后的載體材料SBA-16獨(dú)特的表面性質(zhì)可直接影響其與酶分子之間的相互作用，從而影響酶的固定化效率以及其體相孔道的變化，改變酶所處微環(huán)境及酶蛋白構(gòu)象，從而影響酶的催化活性及穩(wěn)定性。通過選擇合適的修飾劑對介孔材料進(jìn)行表面改性從而提高固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)已成為近年來的研究熱點(diǎn)[10-12]。

作為一種可以設(shè)計(jì)的綠色溶劑，離子液體(IL)已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域，且脂肪酶在離子液體中往往表現(xiàn)出較高的活性及穩(wěn)定性[13-14]。

筆者擬合成咪唑類離子液體并將其作為酶載體SBA-16的表面修飾劑，將離子液體修飾的載體ILSBA-16對豬胰脂肪酶進(jìn)行固定化，并考察相關(guān)的條件及固定化酶的相關(guān)性質(zhì)，以期解決傳統(tǒng)固定化介質(zhì)固定化酶的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

豬胰脂肪酶(PPL)，購自Sigma公司并在0～4 ℃下保存，酶的蛋白質(zhì)含量為9.3%，而其最佳比酶活為362 U/g(45 ℃、pH 7.5)；1-甲基咪唑(純度為99%)、(3-氯丙基)三甲氧基硅烷(純度為98%)，購自阿拉丁試劑公司；甲苯、四氟硼酸鈉(分析純)，購自國藥試劑公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

試樣的 N2吸附-脫附曲線在ASAP 2020型自動吸附儀(Micromeritics公司)上測定。實(shí)驗(yàn)前于80 ℃ 脫氣12 h，在液氮溫度下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用670 型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR) 儀(Thermo Nicolet公司)分別對修飾前后的載體進(jìn)行分析。掃描范圍400～4 000 cm-1， KBr壓片。采用TGA7型熱重儀(PerkinElmer公司)測定載體上負(fù)載的離子液體含量，加熱范圍為50～700 ℃，升溫速率5 ℃/min， 在20 mL/min N2流中進(jìn)行。

1.3 介孔SBA-16材料的制備與修飾

按文獻(xiàn)[15]方法合成較大孔徑介孔材料SBA-16。按文獻(xiàn)[16]方法通過兩步合成法合成甲基咪唑類四氟硼酸鹽離子液體。取 2 g SBA-16 分散在 60 mL甲苯中，加入甲基咪唑類四氟硼酸鹽離子液體(10 mmol)，N2保護(hù)下，于 95 ℃ 反應(yīng) 26 h，過濾，用乙醇、乙醚洗滌，經(jīng)過24 h二氯甲烷索氏提取后，烘干，得到功能化離子液體修飾的SBA-16，記為ILSBA-16[16]。

1.4 脂肪酶的固定化

取50 mL Tris-HCl 緩沖液(pH 7.0) 置于 100 mL 錐形瓶中,加入 0.2 g PPL,振蕩直至完全溶解，再加入0.6 g 載體(SBA-16 或者 ILSBA-16)，加塞密封并將其置于搖床中，在 30 ℃、150 r/min 下振蕩 3 h之后，將混合物于 5 000 r/min離心10 min，用磷酸緩沖液洗滌沉淀數(shù)次，抽濾，固體置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥 6 h，得到固定化酶。

1.5 蛋白負(fù)載量的測定

按照Bradford的方法，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定固定化后殘液的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)式(1)計(jì)算固定化效率(IY)。

固定化效率=(ρi-ρf)/ρi× 100%

(1)

式中：ρi表示溶液中固定化前酶蛋白的初始質(zhì)量濃度(mg/mL);ρf表示固定化后酶蛋白的最終質(zhì)量濃度(mg/mL)[17]。

1.6 酶活的測定

取10 mL三乙酸甘油酯乳化液(6.83%)于 100 mL錐形瓶中,再加入15 mL磷酸鹽緩沖液,于50 ℃ 預(yù)熱5 min,然后向其中加入0.25 g固定化酶在50 ℃、150 r/min條件下反應(yīng)10 min，取出。立即加入10 mL體積的乙醇終止反應(yīng)。使用NaOH溶液(0.05 mol/L) 滴定，記錄NaOH的消耗量。在一定條件下，每分鐘酶催化三乙酸甘油酯生成1 μmol 乙酸所需要的酶量，定義為一個酶活單位(U)。比酶活(U/g)=固定化PPL的表觀酶活/1 g固定化酶中PPL的含量[18]。

1.7 最適溫度及最適pH

調(diào)節(jié)反應(yīng)液緩沖液pH為7.0,分別在35、40、45、50和55 ℃下水浴反應(yīng)10 min，取出測定酶活。在各自的最優(yōu)化溫度進(jìn)行反應(yīng)，調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH分別為 6.0、6.5、7.0、7.5和8.0于水浴反應(yīng)10 min，取出測定酶活。

1.8 重復(fù)使用性

取0.25 g 固定化酶測定酶活，在各自最優(yōu)化條件反應(yīng)10 min后，取出，抽濾、洗滌，分離所得固定化酶冷凍干燥6 h，用于下一次反應(yīng)，反復(fù)循環(huán)使用6次。濾液加入10 mL乙醇，然后用NaOH溶液(0.05 mol/L)滴定測定酶活。設(shè)定初始酶活為100%。

1.9 動力學(xué)參數(shù)的測定

根據(jù)經(jīng)典的米氏方程分別討論游離酶在固定化前后的最大反應(yīng)速率Km及米氏常數(shù)Vmax2個動力學(xué)參數(shù)的變化情況。選用雙倒數(shù)法求取上述參數(shù)，即根據(jù)不同底物質(zhì)量濃度6、10、16、24和27.2 mg/mL，在最優(yōu)化條件下測定游離酶和固定化酶的催化活力，反應(yīng)時間為3 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 介孔材料SBA-16修飾及固定化酶前后的表征

2.1.1 N2吸附-脫附測試

圖1 載體SBA-16修飾前后的N2吸附-脫附曲線Fig.1 Nitrogen adsorption-desorption isotherms of SBA-16 and ILSBA-16

采用比表面和孔徑吸附測定儀，在液氮溫度下測定離子液體修飾前后載體的等溫N2吸附-脫附曲線，結(jié)果見圖1。由圖1可知：吸附等溫線的吸附曲線由于發(fā)生毛細(xì)凝聚現(xiàn)象而逐漸上升，而脫附曲線在較低的壓力下突然下降，造成吸附等溫線和脫附等溫線不完全重合，這符合介孔材料載體的特性，也說明離子液體修飾后沒有改變其孔道特性[19]。

通過BET(Brunauer-Emmett-Teller)模型計(jì)算載體在離子液體修飾及固定化前后的比表面積，BJH(Barrett-Joyner-Halenda)模型計(jì)算載體在固定化前后的孔徑等結(jié)構(gòu)參數(shù)，由表1可知：經(jīng)離子液體修飾后，載體的比表面積、孔體積及孔徑均有所降低；結(jié)合熱重分析結(jié)果初步表明，離子液體已修飾到載體 SBA-16表面。

表1 載體或固定化酶孔徑、孔容和比表面積測試結(jié)果Table 1 Pore structure parameters of carriers

注：所有試樣都在80 ℃脫氣12 h后再測試。

2.1.2 FT-IR紅外圖譜

圖2 載體SBA-16修飾前后的FT-IR圖譜Fig.2 FT-IR spectra of mesoporous materials SBA-16 and ILSBA-16

圖2為載體以及固定化酶的FT-IR光譜圖。由圖2可知：1 080、780和470 cm-1處的這些明顯的峰是介孔材料中Si—O—Si骨架結(jié)構(gòu)的特征峰[20]。表明經(jīng)過修飾，介孔材料的骨架結(jié)構(gòu)依然存在，離子液體修飾和酶的固定化并沒有改變骨架結(jié)構(gòu)。經(jīng)離子液體修飾后載體在2 953 cm-1處出峰可歸屬為烷基鏈上C—H 鍵的伸縮振動峰；離子液體修飾后的介孔材料具有的峰位：1 653 cm-1處的吸收峰可歸屬為咪唑環(huán)N—H鍵的伸縮振動，進(jìn)一步說明烷基功能化離子液體已成功修飾到 SBA-16上。

2.1.3 熱重TG曲線測定離子液體修飾量

圖3是離子液體ILSBA-16載體負(fù)載量的熱重曲線的分析結(jié)果。由圖3可知：試樣ILSBA-16在250 ℃開始熱裂解，600 ℃分解完畢，根據(jù)質(zhì)量變化，可以推算出離子液體負(fù)載量為19.5 mg/g修飾載體。

圖3 ILSBA-16載體的熱重曲線Fig.3 Thermal analysis of ILSBA-16 to assay loading of ionic liquid.

2.2 脂肪酶的固定化時間優(yōu)化

考察固定化時間對離子液體修飾前后載體對酶負(fù)載量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：酶的負(fù)載量隨固定化時間延長而增加。在3 h達(dá)到最大負(fù)載量，而后保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。這說明在3 h后，載體對脂肪酶處于吸附平衡的狀態(tài)。

2.3 固定化酶的固定化效率及酶活

采用甲基咪唑離子液體修飾的SBA-16材料對

圖4 固定化時間對固定化酶負(fù)載量的影響Fig.4 Effects of immobilization time on loading of PPL

PPL進(jìn)行固定化，表2顯示了PPL-SBA-16及PPL-ILSBA-16固定化效率及酶活。由表2可知：離子液體修飾的SBA-16對PPL 的負(fù)載量較高，固定化效率達(dá)60.3%。原粉載體上 PPL 的負(fù)載量降低明顯，為39.2%。這可能與載體經(jīng)過修飾后，載體表面的疏水性增強(qiáng)，從而有利于載體吸附更多的酶分子有關(guān)。另外，修飾載體的固定化酶的酶活顯著提高，在各自的最優(yōu)化條件下反應(yīng)，PPL-ILSBA-16的相對活力為PPL-SBA-16的1.75 倍。酶活提升很可能因?yàn)?個原因:①離子液體引入SBA-16表面后，提高了載體表面與酶之間的作用力，豬胰脂肪酶受到孔道內(nèi)各種微環(huán)境作用力的影響,更多的活性位被打開；②SBA-16表面上的親/疏水基團(tuán)有利于底物的吸附傳遞,加快了底物的傳質(zhì)速度。

表2 固定化酶的負(fù)載量和活力Table 2 Results of immobilization process of PPL

注：固定化條件是在30 ℃、pH 7.0 Tris-HCl緩沖液中固定 3 h；反應(yīng)條件是在最適反應(yīng)溫度和pH條件下進(jìn)行反 應(yīng)；游離酶比酶活為362 U/g，被定義為相對活性100%。

2.4 固定化酶最優(yōu)溫度和pH

2.4.1 固定化酶最優(yōu)溫度的變化

根據(jù)經(jīng)典酸堿滴定的方法，在不同溫度下考察PPL水解三乙酸甘油酯特性，結(jié)果見圖5。由圖5可知：游離豬胰脂肪酶和固定化酶催化反應(yīng)速率隨溫度的變化均呈先上升后下降的“鐘型”曲線，最適反應(yīng)溫度游離酶為45 ℃左右，而修飾載體固定化酶為50 ℃,相對較高。并且游離酶對溫度變化比較敏感，這可能是由于酶經(jīng)固定化后，在固定化載體孔道形成了一個良好的微環(huán)境，與溶液體系溫度存在溫度差，因而溫度的耐受性有所提高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化減小。經(jīng)過表面修飾后的載體固定化酶(PPL-ILSBA-16)對溫度耐受性曲線相對未修飾的載體固定化酶(PPL-SBA)在高溫區(qū)域更加趨于平緩，該點(diǎn)證明材料的表面離子液體修飾有助于改善酶的最佳反應(yīng)溫度。

圖5 反應(yīng)溫度對酶活的影響Fig.5 Effects of temperature on the activity

2.4.2 固定化酶的最優(yōu)pH變化

酶在溶液中會發(fā)生解離作用，酶的解離狀態(tài)和行為都會受到體系中pH的影響，因而體系中pH變化會對酶轉(zhuǎn)化的效果產(chǎn)生很大的影響。根據(jù)酸堿滴定的方法，在不同pH條件下考察豬胰脂肪酶的三乙酸甘油酯水解特性，結(jié)果見圖6。由圖6可知：固定化酶PPL-ILSBA-16及PPL-SBA-16的最適反應(yīng)pH均為7.0左右，并且酶活在7.0～8.0之間變化較小，游離酶最佳pH為7.5，酶活對低方向pH的變化更為敏感。

圖6 反應(yīng)pH對酶活的影響Fig.6 Effects of pH on the activity

2.5 脂肪酶重復(fù)穩(wěn)定性的測試

PPL-SBA-16和PPL-ILSBA-16重復(fù)使用性結(jié)果見圖7。由圖7可知：隨著脂肪酶不斷重復(fù)使用，固定化酶的酶活均明顯下降。其中PPL-SBA-16 第一次重復(fù)使用后固定化酶活力降低的幅度最大，分別為73%和79%；重復(fù)使用 4 次后,活性損失趨于穩(wěn)定，其相對活力為初始活力的45%和61%；且每一次重復(fù)使用時，PPL-ILSBA-16相對活力均大于PPL-SBA-16。由此可見,離子液體修飾后的載體固定化酶PPL-ILSBA-16的重復(fù)使用性能明顯提高。這可能由于離子液體引入到SBA-16載體表面后，增強(qiáng)了酶與載體之間的相互作用力，從而降低了酶從載體孔道的溢出量。

圖7 重復(fù)使用次數(shù)Fig.7 Variation in activity with repeated use

2.6 脂肪酶動力學(xué)常數(shù)

選用雙倒數(shù)法求取游離酶及固定化酶的Km及Vmax2個動力學(xué)參數(shù)，在不同底物濃度下，測定游離酶和固定化酶的催化活力，分別對底物濃度和酶活力求倒數(shù)，如圖8所示。

圖8 動力學(xué)參數(shù)曲線Fig.8 Kinetics curves of immobilized and free PPL

由圖8可知：游離酶PPL和固定化酶PPL-SBA-16及PPL-ILSBA-16的Km及Vmax可以根據(jù)米氏方程推算出。Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，當(dāng)Km值越大，表明酶和底物之間的親和能力越弱[21]。表3為游離酶和固定化酶的動力學(xué)參數(shù)。由表3可知：固定化酶的Km相對游離PPL降低，表明經(jīng)過固定化過程后，PPL對底物的親和力變大。主要原因可能是離子液體修飾載體表面有助于PPL活性中心蓋子被打開，使反應(yīng)物更容易進(jìn)入PPL的活性中心。結(jié)合實(shí)驗(yàn)測得的最大比活力可以證明上述觀點(diǎn)，PPL-ILSBA-16的Vmax達(dá)到了PPL的1.83倍。

表3 游離酶和固定化酶的動力學(xué)參數(shù)Table 3 Kinetics Km and Vmax of immobilized and free PPL

3 結(jié) 論

采用功能化離子液體對載體SBA-16進(jìn)行修飾,并將其應(yīng)用于PPL脂肪酶的固定化。實(shí)驗(yàn)證明，離子液體修飾后的SBA-16載體固定化 PPL 的比活力顯著提高，為原粉SBA-16固定化酶的1.75 倍；PPL-ILSBA-16對溫度變化、較低pH的敏感度降低，重復(fù)使用性大幅度提高。經(jīng)過動力學(xué)常數(shù)測定表明，離子液體修飾的SBA-16固定化酶對底物的親和力明顯增強(qiáng)，脂肪酶活性構(gòu)象被激活，催化效果大大提升。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Immobilization of porcine pancreatic lipase on ionic liquidmodified mesoporous silica SBA-16

ZOU Bin,CHU Xuming,ZHANG Yang,HU Yi

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

Ionic liquid was synthesized and grafted on the surface hydroxyl of mesoporous silica SBA-16(ILSBA-16).Porcine pancreatic lipase(PPL) was immobilization on the ionic liquid modified SBA-16 material by physical adsorption(PPL-ILSBA-16).The enzymatic properties,including optimum temperature,pH and reusability of PPL-ILSBA-16,were investigated in the triacetin hydrolysis reaction.Compared with parent SBA-16 immobilized lipase(PPL-SBA-16),the enzymatic properties were dramatically improved,especially the optimized activity increased from 261 to 456 U/g PPL after modification.Characterizations with N2adsorption,FT-IR and TG revealed that introduction of IL influenced the catalytic behaviors significantly by changing structure and surface properties of the carriers.

immobilization;ionic liquid;mesoporous material;lipase;modification

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.02.002

2012-11-13

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(2011CB710800)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2011AA02A209)；國家自然科學(xué)基金青年基金(20906049)；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20936002)；南京工業(yè)大學(xué)自然科學(xué)基金;南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(KL10-13)

鄒 彬(1986—)，男，湖北荊州人，博士，講師，研究方向：生物催化；胡 燚(聯(lián)系人)，副教授，E-mail：huyi@njtech.edu.cn

O643.32

A

1672-3678(2014)02-0006-06