里氏木霉與米根霉混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

吳 昊，宋向陽(yáng)，吳文浩，歐陽(yáng)嘉，勇 強(qiáng)

(南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210037)

里氏木霉與米根霉混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

吳 昊，宋向陽(yáng)，吳文浩，歐陽(yáng)嘉，勇 強(qiáng)

(南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210037)

以里氏木霉及米根霉單菌固態(tài)發(fā)酵為對(duì)象，考察不同混合發(fā)酵形式對(duì)里氏木霉與米根霉混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響。結(jié)果表明：同時(shí)接種里氏木霉與米根霉，試驗(yàn)考察的兩菌種接種量比1∶ 1(以孢子個(gè)數(shù)計(jì))及5∶ 1條件下，兩菌未產(chǎn)生明顯協(xié)同產(chǎn)酶作用。米根霉延時(shí)(24 h)接種且菌種量比5∶ 1以及米根霉延時(shí)(48 h)接種且菌種量比1∶ 1，2種發(fā)酵形式產(chǎn)酶情況類似，濾紙酶活(FPA)及羧甲基纖維素酶(CMCase)酶活相對(duì)米根霉單菌發(fā)酵有所提高，而β-葡萄糖苷酶(β-GA)酶活相對(duì)里氏木霉單菌固態(tài)發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別增加4.66及4.40倍，可以發(fā)現(xiàn)兩菌產(chǎn)生一定協(xié)同作用。在米根霉延時(shí)(48 h)接種且菌種量比5∶ 1的發(fā)酵形式下，F(xiàn)PA及CMCase在發(fā)酵第7天酶活分別達(dá)到44.04 IU/g、627.14 U/g(以1 g干曲計(jì))，分別是里氏木霉固態(tài)單菌發(fā)酵產(chǎn)酶達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)酶活的1.36和1.63倍，兩菌產(chǎn)生了有效的協(xié)同作用。

里氏木霉；米根霉；混合固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶

纖維素酶的制備技術(shù)是全球性的研究熱點(diǎn)之一，提高纖維素酶產(chǎn)量和活性一直是核心問(wèn)題所在。采用單菌產(chǎn)纖維素酶再用酶降解纖維素的工藝，由于存在酶系不完整和個(gè)別酶活不高的缺陷，在實(shí)踐中被證明有很大的局限性。纖維素的降解需要3種酶系協(xié)同作用。因此，利用混合菌發(fā)酵技術(shù)提高纖維素酶酶活的研究日益成為一個(gè)重要的發(fā)展方向。產(chǎn)纖維素酶真菌混合發(fā)酵的微生態(tài)原理主要有3點(diǎn)[1-3]：①減弱酶的反饋抑制作用；②酶系互補(bǔ)；③互利共生。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)混合發(fā)酵菌種研究較多的是木霉、青霉和曲霉[4-9]。根霉(Rhizopus)是一類廣泛分布于自然界中的真菌，有多種活性強(qiáng)大的酶系[10]。張帥等[11]研究發(fā)現(xiàn)米根霉可作為纖維素酶生產(chǎn)的優(yōu)良菌種，但國(guó)內(nèi)外對(duì)米根霉用于混合菌發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究較少。

里氏木霉RUT C-30被認(rèn)為是目前公認(rèn)纖維素酶最好的生產(chǎn)菌株之一，為進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶效率，筆者以農(nóng)林廢棄物玉米秸稈及麩皮為底物，首次將相對(duì)高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶(β-GA)的菌種米根霉AS3.819與里氏木霉RUT C-30進(jìn)行混合培養(yǎng)，參考已有對(duì)里氏木霉與黑曲霉混合發(fā)酵形式的研究[12]，選取里氏木霉與米根霉接種量比(以孢子個(gè)數(shù)計(jì))為1∶ 1及5∶ 1，研究米根霉延遲接種時(shí)間及不同混合發(fā)酵形式對(duì)混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響，以期為高效產(chǎn)纖維素提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

里氏木霉RUT C-30、米根霉AS3.819，由南京林業(yè)大學(xué)生物化工研究所保藏。

1.1.2 原料

玉米秸稈產(chǎn)自內(nèi)蒙古呼和浩特、麩皮產(chǎn)自江蘇東臺(tái)，風(fēng)干儲(chǔ)存。原料粉碎后過(guò)0.63 mm篩。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種保藏斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：絕干玉米秸稈7.5 g，絕干麩皮7.5 g，(NH4)2SO45%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)，KH2PO40.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl20.05%，Mandels微量元素溶液0.05 mL，吐溫80 1滴，含水率70%，初始pH 5.0。

1.1.4 主要試劑

3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS)、Na2HPO4緩沖液、檸檬酸-NaOH緩沖液、吐溫80、對(duì)硝基苯酚β-D-葡萄糖苷溶液(pNPG)、1 mol/L Na2CO3溶液、羧甲基纖維素(CMC)懸浮液，國(guó)產(chǎn)市售分析純。

1.2 培養(yǎng)方法

以無(wú)菌蒸餾水沖洗斜面培養(yǎng)基制成孢子懸浮液，控制里氏木霉與米根霉孢子懸浮液濃度，使總孢子接入量為1×108個(gè)，將孢子懸浮液按照不同接種量及不同接種時(shí)間接入500 mL錐形瓶，攪拌至其與固態(tài)培養(yǎng)基混合均勻，置于30 ℃恒溫箱培養(yǎng)168 h，每隔24 h拌曲1次。

1.3 粗酶液提取方法

稱取5 g固體曲，按照1∶ 10(g/mL)加入50 mL pH 4.8的檸檬酸-NaOH緩沖液，1滴吐溫80，30 ℃靜置浸提1 h后,4 ℃、4 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液即為粗酶液。

1.4 分析方法

1.4.1 濾紙酶(FPA)和β-GA測(cè)定方法

采用國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)(IUPAC)推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法[13]測(cè)定。

1個(gè)濾紙酶(FPA)活力的國(guó)際單位(IU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。1個(gè)β-葡萄糖苷酶活力國(guó)際單位(IU)定義為標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。

1.4.2 CMC酶活測(cè)定方法

在25 mL試管中加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液和2 g/L羧甲基纖維素懸浮液1.0 mL。于恒溫水浴器中振幅80 r/min、溫度50 ℃下保溫30 min后立即取出再加入3 mL DNS試劑，在100 ℃沸水中煮沸5 min，冷卻到室溫后，加水定容至25 mL，充分搖勻后于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。反應(yīng)生成的葡萄糖的量根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。1個(gè)CMC酶活力單位(U)定義為每分鐘生成1 μmol葡萄糖所需的酶量。

1.4.3 里氏木霉、米根霉孢子接種量的測(cè)定方法

采用血球計(jì)數(shù)板及OLMPUS CX40型顯微鏡(奧林巴斯公司)觀測(cè)計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

2.1.1 里氏木霉單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

圖1(a)為里氏木霉單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶歷程。由圖1(a)可知：發(fā)酵前4天FPA及CMCase酶活快速增長(zhǎng)，趨勢(shì)明顯，酶活分別在第4天達(dá)到32.49 IU/g及384.12 U/g(以1 g干曲計(jì))。繼續(xù)發(fā)酵，F(xiàn)PA酶活變化不大，開(kāi)始呈穩(wěn)定趨勢(shì)，CMCase酶活增長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵第6天的比酶活比第4天的只增長(zhǎng)1.1%。β-GA酶活始終呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但漲勢(shì)相對(duì)平緩，在第6天酶活達(dá)到18.64 IU/g。從培養(yǎng)狀態(tài)觀察，發(fā)酵第2天，培養(yǎng)基開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)塊現(xiàn)象，這是由于霉菌孢子落在適宜的基質(zhì)上后發(fā)芽并產(chǎn)生菌絲[14]，導(dǎo)致培養(yǎng)基凝結(jié)成塊。培養(yǎng)基結(jié)塊狀態(tài)于第4天開(kāi)始緩解，至第5天培養(yǎng)基完全松散，并開(kāi)始出現(xiàn)大量里氏木霉孢子，說(shuō)明里氏木霉菌絲體大量衰亡。在此情況下，F(xiàn)PA及CMCase酶活分別在第4天達(dá)到32.49 IU/g、384.12 U/g后酶活基本保持穩(wěn)定。

2.1.2 米根霉單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶

圖1(b)為米根霉單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶歷程。由圖1(b)可知：發(fā)酵前2天FPA及CMCase酶活增長(zhǎng)明顯，發(fā)酵第2天酶活分別達(dá)到4.76 IU/g、51.54 U/g，之后一直到發(fā)酵第6天結(jié)束，酶活均無(wú)太大增長(zhǎng)，基本保持穩(wěn)定。β-GA酶活始終呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，在第6天酶活達(dá)到148.74 IU/g。從培養(yǎng)狀態(tài)觀察，培養(yǎng)基從發(fā)酵第2天開(kāi)始產(chǎn)生大量白色菌絲，結(jié)塊現(xiàn)象嚴(yán)重，培養(yǎng)至第4天白色菌絲體明顯減少，培養(yǎng)基結(jié)塊現(xiàn)象緩解，至第5天白色菌絲完全消失，培養(yǎng)基松散。與里氏木霉單菌發(fā)酵相比，米根霉單菌發(fā)酵產(chǎn)FPA及CMCase能力大大低于里氏木霉，但其產(chǎn)β-GA能力遠(yuǎn)高于里氏木霉。

圖1 里氏木霉及米根霉單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶歷程Fig.2 Time courses of cellulase production by mono-culture of Trichoderma reesei (a) and Rhizopus oryzae (b)

2.2 不同混合發(fā)酵形式對(duì)混合菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.1 不同孢子接種比情況下同時(shí)接種混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶歷程

主要考察在里氏木霉與米根霉孢子接種量比(以孢子個(gè)數(shù)計(jì))分別為1∶ 1及5∶ 1時(shí)，同時(shí)接種混合菌的產(chǎn)酶情況，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2(a)可知：FPA酶活在發(fā)酵第3天達(dá)到5.83 IU/g，繼續(xù)發(fā)酵酶活變化不大；CMCase酶活在發(fā)酵第4天達(dá)到最大值(76.45 U/g)，其后隨著菌絲體的衰亡，酶活有所下降并在發(fā)酵后期保持基本穩(wěn)定；β-GA酶活自第2天開(kāi)始持續(xù)增長(zhǎng)，在第7天酶活達(dá)到151.60 IU/g。由圖2(b)可知：FPA酶活在第3天達(dá)到4.90 IU/g后，繼續(xù)發(fā)酵酶活變化不大；CMCase酶活自第4天達(dá)到51.58 U/g后，繼續(xù)發(fā)酵酶活基本保持不變；β-GA酶活同樣自發(fā)酵第2天開(kāi)始快速增長(zhǎng)，發(fā)酵第7天酶活達(dá)到153.96 IU/g。比較這兩種不同接種比發(fā)酵形式，可以發(fā)現(xiàn)，兩者產(chǎn)酶情況類似，并都與米根霉單菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶情況基本一致，說(shuō)明在同時(shí)接種混合菌，在接種量比1∶ 1及5∶ 1的情況下，米根霉都在發(fā)酵中占據(jù)種群優(yōu)勢(shì)，導(dǎo)致里氏木霉無(wú)法正常生長(zhǎng)并主導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)FPA，發(fā)酵過(guò)程中以產(chǎn)β-GA為主，并且相對(duì)米根霉單菌發(fā)酵并無(wú)優(yōu)勢(shì)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明這2種發(fā)酵形式下，里氏木霉與米根霉并沒(méi)有形成有效的協(xié)同作用。

2.2.2 不同孢子接種比情況下米根霉延時(shí)接種24 h混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶歷程

主要考察在里氏木霉與米根霉孢子接種量比分別為1∶ 1及5∶ 1時(shí)，米根霉延時(shí)接種24 h的產(chǎn)酶情況，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3(a)可知：當(dāng)接種量比為1∶ 1時(shí)，F(xiàn)PA和CMCase比酶活分別在第3天達(dá)到4.89、47.89 U/g，繼續(xù)發(fā)酵酶活基本保持穩(wěn)定；β-GA酶活于第2天隨著米根霉的接入開(kāi)始持續(xù)增長(zhǎng)，在第7天酶活達(dá)到142.28 IU/g。與米根霉單菌發(fā)酵相比，F(xiàn)PA及CMCase酶活均沒(méi)有明顯增長(zhǎng)，而β-GA酶活有了明顯下降，說(shuō)明此發(fā)酵形式下，里氏木霉的存在對(duì)米根霉產(chǎn)β-GA造成一定負(fù)面影響，兩菌仍未達(dá)到有效的協(xié)同作用效果。由圖3(b)可知，當(dāng)接種量比為5∶ 1時(shí)，F(xiàn)PA及CMCase酶活在前4 d快速增長(zhǎng)，分別達(dá)到10.10 IU/g、122.73 U/g；β-GA酶活在發(fā)酵第3天開(kāi)始快速增長(zhǎng)，到第5天酶活達(dá)到99.38 IU/g后增長(zhǎng)減緩，在第7天達(dá)到105.53 IU/g。在此發(fā)酵形式下FPA及CMCase酶活雖然遠(yuǎn)低于里氏木霉單菌發(fā)酵，但β-GA相對(duì)于里氏木霉單菌發(fā)酵酶活增長(zhǎng)約4.66倍。同樣，與米根霉單菌發(fā)酵相比，β-GA酶活雖然有所降低，但FPA及CMCase酶活均有較大提高。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在此發(fā)酵形式下以產(chǎn)β-GA為主，產(chǎn)FPA及CMCase為輔，里氏木霉與米根霉產(chǎn)生了一定協(xié)同作用。

圖2 同時(shí)接種，里氏木霉與米根霉的接種量比分別為1∶ 1和5∶ 1時(shí)混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶歷程Fig.2 Time courses of cellulase production by mixed-culture at the inoculum ratios of 1∶ 1 (a) and 5∶ 1 (b),inoculated at the same time

圖3 米根霉延時(shí)接種24 h，里氏木霉與米根霉接種量比分別為1∶ 1與5∶ 1時(shí)混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶歷程Fig.3 Time courses of cellulase production by mixed-culture at the inoculum ratios of 1∶ 1 (a) and 5∶ 1 (b),delayed inoculation of Rhizopus oryzae for 24 h

2.2.3 不同孢子接種比情況下米根霉延時(shí)接種48 h混合菌發(fā)酵產(chǎn)酶歷程

主要考察在里氏木霉與米根霉孢子接種量比分別為1∶ 1及5∶ 1時(shí)，米根霉延時(shí)接種48 h的產(chǎn)酶情況，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4(a)可知：當(dāng)接種量比為1∶ 1時(shí)，F(xiàn)PA和CMCase酶活分別在第4天達(dá)到8.34 IU/g和81.21 U/g，繼續(xù)發(fā)酵酶活基本保持穩(wěn)定；β-GA酶活隨著米根霉的接入于第3天開(kāi)始持續(xù)增長(zhǎng)，在第6天酶活達(dá)到100.59 IU/g后有所下降。此結(jié)果與接種量比5∶ 1，米根霉延遲時(shí)接種24 h發(fā)酵形式下產(chǎn)酶結(jié)果類似，說(shuō)明在此發(fā)酵形式下仍以產(chǎn)β-GA為主，產(chǎn)FPA及CMCase為輔，里氏木霉與米根霉產(chǎn)生了一定協(xié)同作用。由圖4(b)可知：當(dāng)接種量比為5∶ 1時(shí)， FPA、CMCase以及β-GA自發(fā)酵開(kāi)始持續(xù)增長(zhǎng)，產(chǎn)酶速度在第6天減緩，在第7天酶活分別達(dá)到44.04 IU/g、627.14 U/g 和17.14 IU/g。此結(jié)果與里氏木霉單菌發(fā)酵相比，產(chǎn)酶達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間由于米根霉的延遲接入而延長(zhǎng)，但FPA與CMCase均有了顯著提高，β-GA酶活基本與里氏木霉單菌發(fā)酵相同。此結(jié)果說(shuō)明在這種發(fā)酵形式下，里氏木霉與米根霉形成有效的協(xié)同作用，互利共生，米根霉的存在促進(jìn)了里氏木霉產(chǎn)纖維素酶。

圖4 米根霉延時(shí)接種48 h，里氏木霉與米根霉接種量比分別為1∶ 1與5∶ 1時(shí)混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶歷程Fig.4 Time courses of cellulase production by mixed-culture at the inoculum ratios of 1∶ 1 (a) and 5∶ 1 (b),delayed inoculation of Rhizopus oryzae for 24 h

3 結(jié) 論

1)在同時(shí)接種里氏木霉與米根霉的發(fā)酵形式下，實(shí)驗(yàn)考察的2種菌種量比1∶ 1及5∶ 1均以米根霉主導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)β-GA為主，發(fā)酵情況與米根霉單菌固態(tài)發(fā)酵基本一致，里氏木霉與米根霉未產(chǎn)生明顯協(xié)同產(chǎn)酶作用。

2)米根霉延時(shí)接種24 h且菌種接種量比5∶ 1以及米根霉延時(shí)接種48 h且菌種接種量比1∶ 1 2種發(fā)酵形式產(chǎn)酶情況類似，F(xiàn)PA及CMCase酶活相對(duì)米根霉單菌發(fā)酵有所提高，而β-GA酶活相對(duì)里氏木霉單菌固態(tài)發(fā)酵結(jié)束時(shí)分別增加4.66及4.40倍，里氏木霉與米根霉產(chǎn)生協(xié)同作用，但仍以米根霉產(chǎn)β-GA為主，里氏木霉產(chǎn)纖維素酶為輔。

3)在米根霉延時(shí)接種48 h且菌種接種量比5∶ 1的發(fā)酵形式下，F(xiàn)PA及CMCase在發(fā)酵第7天酶活分別達(dá)到44.04 IU/g、627.14 U/g，分別是里氏木霉固態(tài)單菌發(fā)酵產(chǎn)酶達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)酶活的1.36和1.63倍。說(shuō)明在此發(fā)酵形式下，里氏木霉與米根霉產(chǎn)生了有效的協(xié)同作用，米根霉的存在促進(jìn)了里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果表明，里氏木霉與米根霉混合固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶是可行的，通過(guò)對(duì)接種時(shí)間及接種比等發(fā)酵形式的調(diào)整可使混合菌產(chǎn)生有效的協(xié)同作用，促進(jìn)纖維素酶的生產(chǎn)，從而更好地應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶的工業(yè)發(fā)展中。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Production of cellulase in mixed-culture of Trichoderma reesei and Rhizopus oryzae by solid-state fermentation

WU Hao，SONG Xiangyang，WU Wenhao，OUYANG Jia，YONG Qiang

(Key Laboratory of Forest Genetics & Biotechnology,Ministry of Education,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

We studied the effect of mixed-culture ofTrichodermareeseiandRhizopusoryzaeon cellulose production in solid-state fermentation. Parameters studied include delayed inoculation ofR.oryzaeand different inoculum ratios of the fungi (spore counting). Cellulase production by mono-culture ofT.reeseiorR.oryzaewas used as the control. No obvious synergy of the two fungi was observed when inoculating the mixed fungi at ratios of 1∶ 1 (spores) and 5∶ 1 at the same time. The result of delayed inoculation ofR.oryzaefor 24 h at inoculum ratio of 5∶ 1 was much similar with the result of delaying inoculation ofRhizopusoryzaefor 48 h at inoculum ratio of 1∶ 1. The activities of filter paper activity (FPA) and CMCase were higher than those of mono-culture fermentation ofR.oryzae. The activity ofβ-glucosidase (β-GA) raised about 4.66 and 4.40 times respectively compared with mono-culture fermentation ofT.reesei. Therefore, the synergy was generated between the mixed fungi with a delayed inoculation ofR.oryzae. When delayed inoculation ofR.oryzaefor 48 h at inoculum ratio of 5∶ 1, FPA and CMCase accounted for 44.04 IU/gram dry substrate, 627.14 U/g respectively, which were 1.36 and 1.63 times as those of mono-culture fementation ofT.reesei, respectively, also higher than that of the mono-culture ofR.oryzae.

Trichodermareesei;Rhizopusoryzae;mixed-culture solid-state fermentation;cellulase

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.001

2013-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金(30871992)；江蘇省科技支撐計(jì)劃(BE2010732)；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

吳 昊(1987—)，女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：生物燃料乙醇；宋向陽(yáng)(聯(lián)系人)，教授，E-mail:xiangyangsong@hotmail.com

TS201.3

A

1672-3678(2014)06-0001-05