7種廣西產(chǎn)甜茶抗氧化活性的比較

潘慧敏，王婉瑩，許利嘉，肖培根

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所國(guó)家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193)

7種廣西產(chǎn)甜茶抗氧化活性的比較

潘慧敏，王婉瑩，許利嘉，肖培根

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所國(guó)家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100193)

通過清除二苯代苦味?；?1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法、鐵離子還原測(cè)定(ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)法、亞鐵離子螯合(ferrous ion-chelating，F(xiàn)IC)法、β-胡蘿卜素-亞油酸法等4種體外抗氧化活性測(cè)定方法，首次比較了3種茶科屬茶葉和7種廣西產(chǎn)甜茶水提物的抗氧化活性，同時(shí)用Folin-Ciocalteus法測(cè)定了其總多酚的含量。研究結(jié)果表明，多穗柯甜茶和藤茶的總多酚含量高于其他供試品。藤茶具有很好的清除DPPH·的能力，高于綠茶及陽性對(duì)照水溶性維生素E(Trolox)和人工合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)。甜葉菊茶和懸鉤甜茶的金屬離子螯合能力均高于綠茶。其中，黃杞和牛白藤兩種植物的抗氧化活性為首次報(bào)道。由此可見，廣西產(chǎn)甜茶均具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，是治療和防治慢性代謝性疾病的重要研究對(duì)象。對(duì)廣西產(chǎn)甜茶的研究對(duì)于了解和搶救某些少數(shù)民族的歷史文化具有重要意義，為別樣茶的抗氧化研究奠定了基礎(chǔ)，值得進(jìn)一步探索和開發(fā)。

抗氧化活性；茶科屬茶葉；總多酚；二苯代苦味酰基

廣西獨(dú)特的自然地理、豐富的生物多樣性及多樣的人文環(huán)境使得廣西茶飲的種類尤為豐富。除了著名的綠茶如桂平茶，白毛茶等，在廣西不少地區(qū)還有多種當(dāng)做茶飲的植物，其中某些口感發(fā)甜的植物，在當(dāng)?shù)亓?xí)慣當(dāng)作甜茶用，屬于別樣茶的范疇。其中，7種廣西產(chǎn)最常見的甜茶(表1)具有降糖降脂作用[1]，功能可能與其抗氧化活性有關(guān)，抗氧化物質(zhì)能有效清除內(nèi)源性和外源性自由基，有效防止自由基所導(dǎo)致的各種疾病如腫瘤、心腦缺血、動(dòng)脈粥樣硬化等[2]。

本研究中，采用4種不同的反應(yīng)機(jī)理(DPPH法、FIC法、FRAP法以及β-胡蘿卜素法)綜合考察了廣西7種甜茶水提物的抗氧化活性，并與茶科屬綠茶、烏龍茶和紅茶比較，同時(shí)用Folin-Ciocalteus法測(cè)定供試茶葉的總多酚含量。該實(shí)驗(yàn)將對(duì)廣西產(chǎn)甜茶的開發(fā)利用具有指導(dǎo)性意義，為了解和搶救某些少數(shù)民族歷史文化提供線索，為別樣茶的抗氧化研究奠定基礎(chǔ)。

表1 7種廣西產(chǎn)甜茶原植物來源

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

綠茶為西湖龍井，烏龍茶為安溪鐵觀音，紅茶為武夷山金駿眉，原植物均為Camelliasinensis(L.)Kuntze，均購(gòu)于當(dāng)?shù)亍?種廣西產(chǎn)甜茶樣品見表1，均采購(gòu)于廣西省。以上樣品均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所肖培根研究員鑒定。

1.1.2 試劑

Folin-Ciocalteus試劑、1,2-二苯基-乙-三硝基苯肼(DPPH)、二丁基羥基甲苯(BHT)、水溶性維生素E(Trolox，6-hydroloxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)、吐溫-40，均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;2，4，6-三吡啶三嗪(TPTZ)、菲洛嗪，瑞士Fluka公司；β-胡蘿卜素和亞油酸，中國(guó)藥品生物制品檢定所；其他試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

MQX200型酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰公司；AL-204 型千分之一電子分析天平，美國(guó)梅特勒-托利多公司；KQ5200E 型超聲儀，昆山超聲儀器廠；UV2550型紫外光譜儀，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品粗提物的制備

準(zhǔn)確稱取粉碎過篩的各供試樣品，用沸水以茶水比1∶10(g/L)于95 ℃水浴中超聲提取30 min，取上清液，剩余殘?jiān)貜?fù)以上操作2次，合并上清液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥得到樣品粗提物。

1.3.2 總多酚含量的測(cè)定

總多酚(TPC)含量測(cè)定采用Folin-Ciocalteus法[3]，略有改進(jìn)。將樣品粗提物配成2.5 mg/mL待測(cè)液，取300 μL待測(cè)液與1.5 mL Folin-Ciocalteus試劑(稀釋10倍)混勻，加入1.2 mL飽和Na2CO3溶液，30 ℃水浴反應(yīng)30 min后冷卻，測(cè)定765 nm波長(zhǎng)處吸收度。樣品中總多酚含量以沒食子酸當(dāng)量(GAE)表示。以吸光值為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線：y=0.011 1x-0.004(R2=0.999 7)。

1.3.3 DPPH·清除能力的測(cè)定

參照Miliauska等[4]的研究方法，略有改進(jìn)。將2 mL的1.28×10-4mol/L的DPPH無水乙醇溶液與2 mL不同質(zhì)量濃度的樣品待測(cè)液混合，搖勻，置于室溫，暗室反應(yīng)30 min。以無水乙醇調(diào)零，以Trolox和BHT為陽性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)517 nm波長(zhǎng)處吸收度(A1)，同時(shí)測(cè)定2 mL樣液與2 mL無水乙醇混合液的吸收度(A2)，2 mL無水乙醇與2 mL DPPH醇溶液混合液的吸收度(A0)，每組平行測(cè)定3次，取平均值計(jì)算樣品對(duì)DPPH·的清除率，計(jì)算公式：清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。依據(jù)公式計(jì)算得到的清除率，用軟件GraphPad Prism計(jì)算得到樣品的EC50值，即DPPH·清除率為50%時(shí)所需樣品的濃度。EC50值越小，表明樣品清除DPPH·的能力越強(qiáng)。

1.3.4 亞鐵離子螯合法(FIC)

參照Singh等[5]的研究方法。將1 mL 0.1 mmol/L的FeSO4溶液和1 mL不同濃度的樣品待測(cè)液混勻，再加入1 mL 0.25 mmol/L的菲洛嗪溶液，反應(yīng)10 min后，以去離子水為空白對(duì)照，以EDTA為陽性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定562 nm波長(zhǎng)處的吸光度。每組平行測(cè)定3次，取平均值計(jì)算樣品的清除率，計(jì)算公式：亞鐵離子螯合率=[(A0-A1)/A0]×100%，A0為空白對(duì)照的吸光度，A1為加有樣品或者陽性對(duì)照后的吸光度。依據(jù)公式計(jì)算得到的清除率，用軟件GraphPad Prism計(jì)算得到樣品的CEC50值，即亞鐵離子螯合率為50%時(shí)所需樣品的濃度。CEC50值越小，表明樣品抗氧化能力越強(qiáng)。

1.3.5 鐵離子還原測(cè)定(FRAP)法

FRAP法的原理是基于具有抗氧化活性的物質(zhì)將Fe3+還原成Fe2+的能力，因Fe2+與三吡啶三嗪(TPTZ)反應(yīng)呈現(xiàn)明顯的藍(lán)色，并在593 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，通過吸光度的大小可以判斷待測(cè)抗氧化能力的強(qiáng)度。樣品的總抗氧化能力以FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度表示，該值越大，表明抗氧化能力越強(qiáng)。

參照Benzie等[6]的研究方法。將新配制的900 μL FRAP溶液在37 ℃下保溫，與90 μL雙蒸水、30 μL樣品待測(cè)液(1 mg/mL)混合，混勻后37 ℃反應(yīng)10 min, 以去離子水為空白對(duì)照，以Trolox和BHT為陽性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定593 nm波長(zhǎng)處的吸收度。每份樣品平行操作3次，取平均值計(jì)算。以吸收度為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.393x+0.109(R2=0.999 5)。結(jié)合樣品質(zhì)量濃度(1 mg/mL)，樣品的總抗氧化能力換算成FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，即mmol/g表示。

1.3.6 對(duì)β-胡蘿卜素-亞油酸氧化體系的抑制實(shí)驗(yàn)

β-胡蘿卜素易被氧化而褪去黃色，在反應(yīng)體系中亞油酸氧化產(chǎn)生的過氧化物使β-胡蘿卜素褪色，當(dāng)反應(yīng)體系中有抗氧化劑時(shí)，褪色速度緩慢，且褪色程度與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)。

參照Velioglu等[7]的研究方法。將β-胡蘿卜素(0.2 mg溶于1 mL氯仿中)、亞油酸(0.02 mL)和吐溫40(0.2 mL)加入到圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40 ℃水浴加熱去除氯仿，再加入50 mL蒸餾水，劇烈振蕩搖勻，成乳狀液。吸取2 mL乳懸液，加入0.2 mL樣品待測(cè)液(0.8 mg/mL)，以去離子水為空白對(duì)照，以Trolox和BHT為陽性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定470 nm波長(zhǎng)處的吸收度。反應(yīng)液在50 ℃水浴中繼續(xù)加熱100 min后，用酶標(biāo)儀再次測(cè)定一次470 nm波長(zhǎng)處的吸收度，每組平行測(cè)定3次，抗氧化活性用下式表示：

β-胡蘿卜素-亞油酸氧化體系褪色抑制率

AA=[1-(A0-A100)/ (A0c-A100c)] ×100%

式中：A0、A100為反應(yīng)開始和100 min后的樣品或陽性對(duì)照的吸光度；A0c、A100c為反應(yīng)開始和100 min后的空白對(duì)照的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 總多酚含量

供試樣品的總多酚含量見表2。由表2可知：多穗柯甜茶(137.16 mg/g)和藤茶(128.37 mg/g)的總多酚含量高于綠茶(126.12 mg/g)、鐵觀音(103.6 mg/g)、金駿眉(69.03 mg/g)及其他樣品?？偠喾雍坑筛叩降鸵来螢椋憾嗨肟绿鸩琛⑻俨?、綠茶、鐵觀音、金駿眉、甜葉菊茶、懸鉤甜茶、黃杞茶、相思藤茶、牛白藤茶。

2.2 DPPH·的清除能力

對(duì)供試樣品清除DPPH·能力的研究結(jié)果見表2。由表2可知：藤茶具有很好地清除DPPH·的活性，活性高于供試的茶科屬茶葉、陽性對(duì)照及其他甜茶。在研究的7種廣西產(chǎn)甜茶中，藤茶(EC50為4.059 μg/mL)表現(xiàn)出最好的清除DPPH·的能力，多穗柯甜茶(17.42 μg/mL)清除DPPH·的能力僅次于綠茶、鐵觀音及陽性對(duì)照品；而相思藤茶和牛白藤茶的活性最差(>500 μg/mL)；樣品及陽性對(duì)照品對(duì)DPPH·的清除能力由高到低排序?yàn)椋禾俨?、綠茶、鐵觀音、Trolox、BHT、多穗柯甜茶、懸鉤甜茶、甜葉菊茶、金駿眉、黃杞茶、相思藤茶及牛白藤茶。

2.3 螯合亞鐵離子能力

對(duì)供試樣品的金屬離子螯合能力的研究結(jié)果見表2。由表2可知：除牛白藤茶(>5 000 μg/mL)外，其余樣品均表現(xiàn)出一定的金屬離子螯合能力。其中，甜葉菊茶的EC50最低(516.6 μg/mL)，表明其金屬離子螯合能力最強(qiáng)，優(yōu)于其他甜茶及供試的茶科屬茶葉，甚至是陽性對(duì)照品EDTA。懸鉤甜茶(796.4 μg/mL)也表現(xiàn)出較綠茶(851.7 μg/mL)強(qiáng)的金屬離子螯合能力，藤茶(903.3 μg/mL)和多穗柯甜茶(921.5 μg/mL)的活性僅次于綠茶。樣品及陽性對(duì)照品的金屬離子螯合能力由高到低排序?yàn)椋禾鹑~菊茶、EDTA、懸鉤甜茶、綠茶、藤茶、多穗柯甜茶、鐵觀音、金駿眉、黃杞茶、相思藤茶、牛白藤茶。

2.4 還原鐵離子的能力測(cè)定

對(duì)供試樣品的還原鐵離子能力的研究結(jié)果見表2。由表2可知：藤茶(0.444 mmol/g)還原鐵離子的能力與陽性對(duì)照品Trolox(0.446 mmol/g)相近，高于綠茶、鐵觀音、金駿眉、其他供試甜茶及陽性對(duì)照品。牛白藤茶及相思藤茶還原鐵離子的能力遠(yuǎn)差于其他樣品及陽性對(duì)照品。

樣品及陽性對(duì)照品的還原鐵離子能力由高到低排序?yàn)椋篢rolox、藤茶、綠茶、金駿眉、多穗柯甜茶、鐵觀音、BHT、懸鉤甜茶、甜葉菊茶、黃杞茶、牛白藤茶、相思藤茶。

2.5 對(duì)β-胡蘿卜素-亞油酸氧化體系的抑制作用

供試樣品對(duì)β-胡蘿卜素-亞油酸氧化體系的抑制作用的研究結(jié)果見表2。由表2可知：綠茶(90.3%)的抑制率最高，藤茶(86.5%)的抑制率僅次于綠茶，其次是鐵觀音(80.5%)、甜葉菊茶(69.7%)。多穗柯甜茶(67.9%)的抑制率與金駿眉相近，相思藤茶(28.4%)的抑制率最低。樣品及對(duì)照品的抑制率由高到低排序?yàn)椋壕G茶、藤茶、BHT、鐵觀音、Trolox、甜葉菊茶、多穗柯甜茶、金駿眉、懸鉤甜茶、黃杞茶、牛白藤茶、相思藤茶。

表2 7種廣西產(chǎn)甜茶及3種茶科屬茶葉的TPC、EC50 (DPPH)、CEC50 (FIC)、FRAP和AA測(cè)定值

注：每個(gè)值均被表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)，同列中相同的小寫字母表示無顯著性差異(P<0.05)。

2.6 不同測(cè)定方法間相關(guān)系數(shù)的研究

每種方法測(cè)定值間的Pearson′s相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，總多酚含量與DPPH·(r=-0.886)、FRAP(r=0.844)、β-胡蘿卜素-亞油酸體系(r=0.826)密切相關(guān)，與FIC(r=-0.592)相關(guān)性較小。同時(shí)有研究表明[8]，金屬離子螯合能力與總多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，取決于酚類化合物的鄰二羥基芳香部分，綜合以上研究表明總多酚含量是決定抗氧化活性高低的重要指標(biāo)。

DPPH·及FRAP不僅與總多酚含量明顯相關(guān)(r=-0.886,r=0.844)，并且2種方法之間也具有很大的相關(guān)性(r=-0.801)，表明茶葉水提取物中的總多酚可能兼具氫供體以及電子供體的功能以發(fā)揮其抗氧化的作用。

表3 不同方法測(cè)定值間的相關(guān)系數(shù)

注：*表明2個(gè)變量之間具有極大的相關(guān)性(p<0.05)。

2.7 對(duì)7種廣西產(chǎn)甜茶抗氧化活性的總體分析

本文比較了7種廣西產(chǎn)甜茶及3種市售茶葉(綠茶、烏龍茶和紅茶)的抗氧化活性。研究表明，多穗柯甜茶及藤茶的總多酚含量高于其他供試品，同時(shí)，藤茶具有很高的清除DPPH·的能力，高于綠茶及陽性對(duì)照Trolox和人工合成抗氧化劑BHT。甜葉菊茶及懸鉤甜茶具有很好的金屬離子螯合作用，高于供試的茶科屬茶葉，其他甜茶的活性均低于綠茶、烏龍茶及紅茶。相關(guān)性分析表明，總多酚是茶葉具有抗氧化活性的關(guān)鍵物質(zhì)。

綠茶、烏龍茶、紅茶為目前世界上產(chǎn)量和應(yīng)用量最大的幾個(gè)茶葉品種，因其口感佳、抗氧化性和生物活性高而被廣泛接受，其卓越的抗氧化活性也在本文中再次得到驗(yàn)證。本研究表明多穗柯甜茶及藤茶，其總多酚含量高于綠茶、鐵觀音和金駿眉，藤茶的DPPH·清除能力和還原鐵離子的能力均高于供試的茶科屬茶葉，甜葉菊茶及懸鉤甜茶的金屬離子螯合作用也明顯高于其他樣品，可以干擾金屬離子在脂質(zhì)氧化過程中的催化作用，抗氧化作用卓越。

牛白藤茶及相思藤茶在4個(gè)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)中，活性遠(yuǎn)低于其他樣品以及陽性對(duì)照品，抗氧化能力較弱。但有報(bào)道表明，牛白藤具有清熱解暑、消炎止痛的功效，同時(shí)具有調(diào)節(jié)免疫、抗誘變、抗腫瘤、抗菌消炎等作用[9]。而相思藤茶提取物能通過誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡而起到生長(zhǎng)抑制的作用，對(duì)于乳腺癌的治療具有潛在價(jià)值[10]。

3 結(jié) 論

廣西產(chǎn)甜茶是一類重要的別樣茶，長(zhǎng)期被多個(gè)少數(shù)民族飲用。但是隨著社會(huì)的發(fā)展，甜茶逐漸被淘汰，具有民族特色的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)逐漸消失。因此，對(duì)廣西產(chǎn)甜茶的研究對(duì)于了解及進(jìn)一步搶救某些少數(shù)民族的歷史文化具有重要意義。由于甜茶中的總多酚類成分，使其或多或少具有抗氧化的活性，為別樣茶的抗氧化研究奠定了基礎(chǔ)，創(chuàng)造了條件。同時(shí)，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明它們?cè)诮笛?、降血脂、降血壓、抗腫瘤等方面有突出表現(xiàn)，長(zhǎng)期飲用能夠?qū)β缘拇x類疾病起到良好的保健預(yù)防作用，是防治和治療慢性代謝性疾病的重要研究對(duì)象，值得進(jìn)一步研究和開發(fā)，從而促進(jìn)我國(guó)茶文化多樣性的發(fā)展，也能為別樣茶在世界范圍內(nèi)更為廣泛的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 周曉薇)

Antioxidants of seven types of sweet teas in Guangxi

PAN Huimin,WANG Wanying,XU Lijia,XIAO Peigen

(Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine,Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College,Beijing 100193,China)

To compare the primary antioxidant activities of seven sweet teas from Guangxi, we studied primary antioxidant activities of those tea based on four different reaction mechanisms,i.e.,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical-scavenging activity, ferric-reducing antioxidant power (FRAP), ferrous ion-chelating (FIC) andβ-carotene-linoleate bleaching assays. In addition, the total polyphenol content of each sample was estimated by Folin-Ciocalteus assay. Results show that the total polyphenol contents of Shilitiancha and Tengcha were higher than the other samples. The DPPH radical scavenging activity of Tengcha was superior to that of Green teas and positive controls Trolox and butylated hydroxytoluene(BHT). The metal chelating capacity of Tianyejucha and Xungou tiancha was exceptionally stronger than that of green teas. Especially, the antioxidant activities of HuangQi and NiuBaiTeng were reported for the first time. The potential application of antioxidant sweet teas needs further to explored.

antioxidants activities;Camelliasinensis;total polyphenol；1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.017

2014-03-18

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81274188)

潘慧敏(1989—)，女，內(nèi)蒙古包頭人，碩士生，研究方向：藥用植物資源化學(xué)；許利嘉(聯(lián)系人)；副研究員，E-mail：xulijia@hotmail.com

R285.5

A

1672-3678(2014)06-0090-06