脂肪乳對內(nèi)毒素誘導(dǎo)急性肺損傷大鼠肺組織白介素6分泌及肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響

石計朋，黃麗密，尚 云

急性肺損傷(ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)指由心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭，已成為醫(yī)院患者死亡的重要原因之一。雖然抗生素能有效殺滅細(xì)菌，但不能阻止已經(jīng)被激活的全身炎性反應(yīng)。白介素6(IL-6)是急性炎性反應(yīng)中的一種多功能細(xì)胞因子，具有廣泛的生物活性和免疫調(diào)節(jié)作用，近年來，其在ALI/ARDS發(fā)病過程中的作用一直為學(xué)者們所關(guān)注。IL-6主要由腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)刺激巨噬細(xì)胞分泌，與TNF-α、IL-1β一起被稱作“前炎性細(xì)胞因子”。

脂肪乳已普遍應(yīng)用于危重癥患者的腸外營養(yǎng)，多不飽和脂肪酸(PUFAs)是免疫營養(yǎng)的重要組成部分，可以通過多種分子機制調(diào)控機體炎癥和免疫功能，在多種感染疾病的治療中具有良好的前景。目前臨床上常用的脂肪乳有：(1)ω-3魚油脂肪乳注射液(尤文)，屬于ω-3系列，主要有α-亞麻酸、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等；(2)脂肪乳注射液(C14～24)(英脫利匹特)，屬于ω-6系列，主要包括亞油酸、γ-亞麻酸和花生四烯酸(AA)；(3)長鏈脂肪乳注射液(OO)(克林諾)，含橄欖油80%、豆油20%，特點是富含ω-9單不飽和脂肪酸(ω-9MUFAs)、低飽和脂肪酸、天然抗氧化劑維生素E等。本研究以ALI大鼠為模型，比較英脫利匹特、克林諾和尤文3種脂肪乳對肺組織IL-6分泌及肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響，以期為臨床合理使用脂肪乳提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只，體質(zhì)量在160～180 g，由上海斯萊克動物有限責(zé)任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2003-0003。大鼠于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心清潔級實驗室內(nèi)飼養(yǎng)，晝夜照明12 h/12 h，相對濕度70%，飼養(yǎng)溫度25 ℃。

1.1.2 脂肪乳 英脫利匹特和尤文均購自上海華瑞制藥有限公司，克林諾購自美國Baxter公司。

1.1.3 主要試劑和儀器 原位細(xì)胞凋亡試劑盒(德國Roche公司)，蘇木素染色液(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，脂多糖(LPS，大腸埃希菌O111：B4，美國Sigma-Aldrich 公司)，總RNA提取試劑(Trizol，上海英駿生物技術(shù)有限公司)，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒〔大連寶生物(TaKaRa)公司〕，瓊脂糖(上海生工生物工程有限公司)；LKB-V2088型超薄切片機(瑞典GERMAN)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)，Wellscan MK3全自動多功能酶標(biāo)儀(芬蘭Thermo公司)，PCR儀(德國Biometra公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及動物模型制備 將100只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為5組，每組20只：對照組、模型組、英脫利匹特組、克林諾組和尤文組。采用靜脈留置針在大鼠尾靜脈穿刺并固定，連續(xù)7 d分別向?qū)φ战M和模型組大鼠注射0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水)、英脫利匹特組注射英脫利匹特、克林諾組注射20%克林諾、尤文組注射尤文，劑量均為30 ml·kg-1·d-1。在取血和支氣管肺泡灌洗之前8 h，對照組大鼠氣管內(nèi)滴入生理鹽水0.25 ml/kg，后4組大鼠均噴灑LPS溶液制備ALI大鼠模型，劑量均為0.5 mg/kg。模型制備成功與否主要根據(jù)大鼠有無肺損傷的表現(xiàn)，并通過肺系數(shù)和ALI評分來判斷。

1.2.2 標(biāo)本制備 大鼠氣管內(nèi)滴入LPS溶液8 h后，將大鼠麻醉，然后打開胸腔。收集肺泡灌洗液(BALF)于EP管中，于-80 ℃保存待行ELISA。左肺：標(biāo)本離體后，于Eppendorf管內(nèi)-80 ℃冰箱保存，待測IL-6 mRNA表達(dá)水平；右肺：標(biāo)本置于4%甲醛液中保存，待常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色及脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測。

1.2.3 觀察指標(biāo) (1)采用HE染色在光鏡下觀察肺組織上皮細(xì)胞的病理變化；(2)RT-PCR法檢測肺組織IL-6 mRNA的表達(dá)；(3)采用ELISA法檢測各組BALF中IL-6水平；(4)采用TUNEL檢測細(xì)胞凋亡，并計算凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)，AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 ALI大鼠模型制備結(jié)果 應(yīng)用脂肪乳靜脈營養(yǎng)期間，英脫利匹特組、克林諾組和尤文組各死亡2只，對照組死亡1只。氣管內(nèi)噴灑LPS溶液后，大鼠均出現(xiàn)呼吸急促，精神較差，蜷縮成團，毛發(fā)豎起、蓬亂，少數(shù)伴有頭部顫動，拒食，2 h左右模型組和英脫利匹特組各死亡3只，克林諾組和尤文組各死亡2只。存活大鼠狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，活動可，攝食、飲水，毛發(fā)光亮整齊。

各組大鼠光鏡下肺組織的病理變化：除了對照組，其余4組大鼠氣管內(nèi)噴灑LPS溶液后肺組織均可見明顯的炎性反應(yīng)。大鼠肺泡結(jié)構(gòu)被破壞；肺泡隔變厚；肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤；肺泡腔內(nèi)有較多滲出液，部分肺泡塌陷、不張，甚至有透明膜形成(見圖1)。模型制備后各組大鼠肺系數(shù)及ALI評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、英脫利匹特組、克林諾組和尤文組大鼠的肺系數(shù)和ALI評分均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表1)，提示ALI大鼠模型建立。

Table1 The lung coefficients and the ALI scores in different groups of rats after LPS treatment

組別只數(shù)肺系數(shù)ALI評分(分)對照組190.51±0.05 1.56±0.42 模型組170.69±0.09*12.23±2.10*英脫利匹特組150.62±0.10*19.76±0.91*克林諾組160.63±0.09*18.35±0.92*尤文組160.60±0.07*18.89±0.85*F值3.522.93P值0.0180.027

注：ALI=急性肺損傷；與對照組比較，*P<0.01

2.2 各組大鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)水平 5組大鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中對照組大鼠肺組織IL-6 mRNA表達(dá)水平均低于其他4組，英脫利匹特組IL-6 mRNA表達(dá)水平高于模型組、克林諾組和尤文組，林諾組、尤文組IL-6 mRNA表達(dá)水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而克林諾組和尤文組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖2、表2)。

2.3 各組大鼠BALF中IL-6水平比較 5組大鼠BALF中IL-6水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中對照組大鼠BALF中IL-6水平均低于其他4組，英脫利匹特組IL-6水平高于模型組、克林諾組及尤文組，克林諾組、尤文組IL-6水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而克林諾組和尤文組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

Table2 Comparison of IL-6 mRNA expression levels of lung tissues and IL-6 levels of BALF in different groups of rats

組別例數(shù)IL-6mRNA IL-6(pg/ml)對照組190.023±0.01014.51±3.56 模型組170.214±0.043*58.83±19.18* 英脫利匹特組150.323±0.056*△73.55±14.32*△ 克林諾組160.183±0.020*△▲46.77±9.98*△▲尤文組160.151±0.015*△▲43.76±8.45*△▲F值 2.863.32P值 <0.05<0.05

注：IL-6=白介素6；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與英脫利匹特組比較，▲P<0.05

2.4 各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡情況比較 5組大鼠肺組織均可見不同程度的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞以肺泡上皮細(xì)胞為主。各組大鼠肺泡上皮細(xì)胞AI比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中對照組AI均低于其他4組，克林諾組、尤文組AI均低于模型組和英脫利匹特組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of apoptosis index of alveolar epithelial cells in different groups of rats

組別例數(shù)AI 對照組19 3.3±2.0 模型組1719.7±4.9* 英脫利匹特組1518.2±3.0* 克林諾組1612.8±3.9*△▲尤文組1611.8±3.2*△▲F值12.34P值<0.05

注：AI=凋亡指數(shù)；與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與英脫利匹特組比較，▲P<0.05

注：1為對照組，2為模型組，3為英脫利匹特組，4為克林諾組，5為尤文組

圖1 各組大鼠肺組織HE染色結(jié)果(×200)

Figure1 The HE staining of lung tissues in different groups of rats

注：1為對照組，2為模型組，3為英脫利匹特組，4為克林諾組，5為尤文組

圖2 各組大鼠肺組織IL-6 mRNA的表達(dá)

Figure2 Expression of IL-6 mRNA of lung tissues in different groups of rats

3 討論

ALI/ARDS的發(fā)病機制錯綜復(fù)雜，目前認(rèn)為嚴(yán)重創(chuàng)傷和膿毒血癥等引起的過度炎性反應(yīng)經(jīng)啟動并失去控制，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，而肺臟是全身炎性反應(yīng)失控最容易受到打擊的器官，SIRS失控在肺部表現(xiàn)為ALI/ARDS。在這個過程中，多種效應(yīng)細(xì)胞和炎性遞質(zhì)參與了ALI/ARDS的發(fā)生或發(fā)展。IL-6是啟動全身炎性反應(yīng)最強的內(nèi)源性炎性遞質(zhì)，能夠催化和放大炎性反應(yīng)，是機體炎癥與疾病嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[1]。在參與ALI/ARDS的眾多前炎性細(xì)胞因子中，IL-6是ALI/ARDS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用的炎性遞質(zhì)。Hierholzer等[2]給正常小鼠氣管內(nèi)吸入IL-6可導(dǎo)致多形核白細(xì)胞(PMN)滲透、積聚以及以肺水腫為特征的ALI，認(rèn)為IL-6可致肺損傷。其轉(zhuǎn)錄由核因子κB(NF-κB)所介導(dǎo)，而NF-κB可被活性氧等上游信號分子誘導(dǎo)活化，從而激活I(lǐng)L-6信號途徑。LPS預(yù)處理后，年輕和衰老小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-6的能力普遍增加[3]。

英脫利匹特是在臨床上最常使用的富含ω-6長鏈PUFAs，以豆油為主要來源，其中亞油酸被分解產(chǎn)生的AA是脂質(zhì)炎性遞質(zhì)的前體，通過環(huán)氧化酶、脂氧化酶、細(xì)胞色素-P450途徑可以產(chǎn)生多種炎性遞質(zhì)，如前列腺素E2、白三烯B4(LTB4)等，進(jìn)而調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)和免疫。在歐洲國家，一種富含ω-9MUFAs、以橄欖油為主的脂肪乳——克林諾，被推薦用于靜脈營養(yǎng)(含橄欖油80%、豆油20%)。此外，一種富含ω-3PUFAs、以魚油為主的脂肪乳——尤文，對炎癥的影響也是最近比較熱門的研究課題，其主要成分為EPA和DHA，二者可增加細(xì)胞膜磷脂ω-3PUFAs成分，減少炎性二十烷類產(chǎn)生；同時增加了非炎性二十烷，以競爭AA至二十烷類合成的途徑，從而調(diào)節(jié)機體內(nèi)一系列細(xì)胞因子的水平及免疫功能。

ω-3PUFAs在脂氧合酶和環(huán)氧合酶的作用下產(chǎn)生前列腺素3(PGE3)和白三烯B5(LTB5)，對中性粒細(xì)胞的趨化、聚集和釋放溶菌酶等的作用大約是LTB4的十分之一；同時ω-3PUFAs與AA競爭結(jié)合細(xì)胞膜磷脂，降低細(xì)胞膜磷脂中AA含量，進(jìn)而減少高效炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生；ω-3PUFA還可通過抑制磷脂酶A2(PLA2)的活性，減少膜磷脂AA的釋放，從而減少來源于AA的類花生酸；EPA和DHA還能抑制細(xì)菌LPS誘導(dǎo)NF-κB的活化和環(huán)氧酶2的表達(dá)[4]。本研究結(jié)果顯示，英脫利匹特的代謝產(chǎn)物AA作為脂質(zhì)炎性遞質(zhì)的前體，可顯著上調(diào)肺組織IL-6 mRNA的表達(dá)，使BALF中IL-6水平升高；而克林諾組和尤文組肺組織IL-6 mRNA的表達(dá)和BALF中IL-6水平則較英脫利匹特組降低。由于克林諾富含天然抗氧化劑維生素E，后者能夠減少氧自由基和脂質(zhì)過氧化物的損害；而NF-κB可被活性氧等上游信號分子誘導(dǎo)活化，從而激活I(lǐng)L-6信號途徑。通過研究推測克林諾可能通過減少NF-κB的活化而下調(diào)IL-6的表達(dá)。尤文能降低IL-6的表達(dá)，推測其機制可能與其主要成分EPA和DHA減少炎性遞質(zhì)的產(chǎn)生，并能抑制細(xì)菌LPS誘導(dǎo)NF-κB的活化有關(guān)。在降低炎性遞質(zhì)IL-6分泌方面，克林諾與尤文作用相似，均優(yōu)于豆油來源的英脫利匹特。

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，指體內(nèi)外生理或病理因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細(xì)胞主動死亡過程，在炎癥、損傷、組織修復(fù)等過程中具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，活性氧[5]、LPS[6]均可誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的主要組成細(xì)胞——肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞(AT-Ⅱ)的凋亡。英脫利匹特所引起高氧化狀態(tài)致使氧自由基大量增加和脂質(zhì)過氧化加重，從而影響細(xì)胞黏附，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。故本研究發(fā)現(xiàn)英脫利匹特組大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡增加。克林諾所含PUFAs較少，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)小，故可通過減少氧自由基及脂質(zhì)過氧化物的生成而降低肺泡上皮細(xì)胞的凋亡。尤文也能通過抑制氧自由基形成和脂質(zhì)過氧化來減少細(xì)胞凋亡[7]。有文獻(xiàn)報道，克林諾和尤文都能通過降低炎性遞質(zhì)而減少肺泡上皮細(xì)胞凋亡[8]。在本實驗中，英脫利匹特對肺泡上皮細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用，而克林諾和尤文則能減少細(xì)胞凋亡。

以往對脂肪乳的研究多集中于細(xì)胞培養(yǎng)方面，本實驗是在活體大鼠內(nèi)進(jìn)行的，與以往實驗相比，對臨床工作更有參考價值。今后可進(jìn)一步研究3種脂肪乳對LPS所致肺損傷的影響，以探討其對炎性遞質(zhì)的深層調(diào)節(jié)機制。

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