瘢痕疙瘩成纖維細胞低密度培養(yǎng)的克隆能力分析

曲淼武曉莉柴崗

瘢痕疙瘩成纖維細胞低密度培養(yǎng)的克隆能力分析

曲淼武曉莉柴崗

目的比較瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFs）和正常真皮成纖維細胞（NFs）間克隆形成能力的差異，探討瘢痕疙瘩中病理性干細胞是否存在，及其對瘢痕疙瘩發(fā)生發(fā)展的影響。方法利用酶消化法獲得瘢痕疙瘩和正常皮膚組織的原代細胞，以4 000個/皿的密度接種，進行低密度培養(yǎng)，2周后觀察細胞克隆的形成及形態(tài)變化。結(jié)果低密度培養(yǎng)條件下的瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常皮膚成纖維細胞都可形成克隆，但KFs可形成明顯的克隆集落，NFs形成的克隆不明顯且松散。KFs克隆形成率高于NFs，為（0.80±0.21）%，而NFs為（0.18±0.06）%，兩者間差異顯著（P<0.05）。結(jié)論低密度培養(yǎng)條件下，瘢痕疙瘩成纖維細胞的克隆形成能力高于正常皮膚成纖維細胞，可能與瘢痕疙瘩組織中存在病理性瘢痕疙瘩干細胞有關(guān)。

瘢痕疙瘩低密度培養(yǎng)克隆形成率瘢痕疙瘩干細胞

瘢痕疙瘩作為一種人類特發(fā)的病理性瘢痕，呈浸潤性生長，治療后復(fù)發(fā)率高，通常被認為是皮膚的良性腫瘤[1-2]。腫瘤干細胞是指腫瘤中存在的少量具有自我更新能力、分化潛能，并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞[3]。腫瘤干細胞理論認為，腫瘤可能是由腫瘤干細胞產(chǎn)生，而腫瘤干細胞則可能由正常組織干細胞突變形成。從腫瘤和干細胞的角度來研究瘢痕疙瘩，探討瘢痕疙瘩的病理機制是新的研究思路。由于干細胞最基本的特征是自我更新能力和多向分化能力，本研究將瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFs）和正常皮膚成纖維細胞（NFs）進行低密度培養(yǎng)，并比較這兩種細胞在克隆形成能力方面的差異，為進一步明確瘢痕疙瘩中是否存在干細胞提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗主要試劑和儀器

0.2 %Ⅰ型膠原酶（Worthington，USA）；0.2%中性蛋白酶（Roche，Germany）；磷酸鹽緩沖液、0.25%胰蛋白酶（上海思吉生物制品有限公司）；胎牛血清（FBS）（上海華美生物工程公司）；10%福爾馬林、臺盼蘭（上海試劑廠）；Rhodamine B（Sigma，USA）；DMEM培養(yǎng)液（Gibco，USA）。

純水系統(tǒng)（Millipore，USA）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific，USA）；普通臺式離心機、高速恒溫冷凍離心機（Heraeus，USA）；精密天平秤（Shangping，中國）；恒溫搖床（太倉市華美生化儀器廠）；倒置相差顯微鏡（Olympus，Japan）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；10 cm培養(yǎng)皿、50 mL離心管、15 mL離心管、200目尼龍濾網(wǎng)（FALCON，USA）。

1.2 方法

瘢痕疙瘩和正常皮膚標本均來源于手術(shù)切除的瘢痕和皮膚組織，并記錄標本具體資料，如性別、年齡、部位等。在獲取標本前，獲患者及家屬知情同意。本實驗采用的正常皮膚標本不包括人包皮來源。

1.2.1 瘢痕疙瘩成纖維細胞獲取

瘢痕疙瘩標本以氯霉素沖洗液沖洗3遍，PBS充分振蕩洗滌3遍，去除血漬及其他組織碎片；無菌下去除表皮及皮下脂肪組織，將獲得的瘢痕疙瘩真皮部分剪至1 mm×1 mm大小，PBS振蕩洗滌1遍后用0.2%的Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化，6～8 h后收獲真皮層細胞。消化產(chǎn)物以200目尼龍篩過濾，細胞懸液1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS振蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清；取少量細胞，加入臺盼蘭溶液進行拒染試驗，用血球記數(shù)板對活細胞量進行計數(shù)。

1.2.2 正常皮膚成纖維細胞獲取

標本以氯霉素沖洗液沖洗3遍，PBS充分振蕩洗滌3遍，去除血漬及其它組織碎片；無菌下去除皮下組織，并剪至2 mm×2 mm大小，PBS振蕩洗滌1遍；加入0.2%的中性蛋白酶4℃消化過夜，無血清DMEM培養(yǎng)液清洗、終止消化，并輕輕揭去表皮層。余下的真皮組織用無菌剪刀剪成l mm×l mm大小組織塊，以0.2%的Ⅰ型膠原酶，37℃恒溫振蕩消化，2～5 h后收獲真皮層細胞。消化產(chǎn)物以200目尼龍篩過濾，細胞懸液1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS振蕩混勻，1 500 r/min離心5 min，棄上清；取少量細胞，加入臺盼蘭溶液進行拒染試驗，用血球記數(shù)板對活細胞量進行計數(shù)。

1.2.3 KFs和NFs的低密度培養(yǎng)

將兩種原代細胞以低糖DMEM培養(yǎng)液重懸，每例標本以4 000個/皿的密度接種至4個10 cm培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天換液一次，并觀察細胞生長情況，注意細胞克隆的形成情況。本實驗中，共收集5例瘢痕疙瘩和5例正常皮膚標本進行低密度培養(yǎng)。

1.2.4 克隆形成能力檢測

一般克隆形成能力檢測的時間為3周左右，而我們在2周時即終止培養(yǎng)，目的是在早期比較KFs和NFs低密度培養(yǎng)時克隆形成能力的差異。以PBS沖洗3次，10%福爾馬林固定細胞10 min，再以PBS沖洗3次，每皿中加入1 mL Rhodamine B，30 min后以流水小心沖洗，放置晾干，拍照。

1.2.5 克隆形成能力統(tǒng)計

倒置顯微鏡下觀察細胞克隆數(shù)，計算克隆形成率（克隆形成率＝克隆形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%），每例標本的克隆形成數(shù)為4個培養(yǎng)皿中形成的克隆總數(shù)。采用SPSS 19.0軟件進行，結(jié)果用x±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

低密度培養(yǎng)條件下，KFs和NFs的克隆形成能力有明顯差異。培養(yǎng)2周時，KFs的克隆形成率為（0.80±0.21）%，且克隆較為明顯而緊密；而NFs的克隆形成率為（0.18±0.06）%，形成的克隆稀少而松散。兩者間差異明顯（P＜0.05）（表1）（圖1，2）。

表1 細胞標本克隆形成率統(tǒng)計Table 1Data of cloning formation efficiency of each specimen

圖12周時，低密度培養(yǎng)條件下KFs和NFs的Rhodamine B染色對比Fig.1Typical morphological contrast of KFs and NFs under low-density culture conditions by Rhodamine B staining after cultured for 2 weeks

圖2 KFs和NFs在低密度培養(yǎng)條件下克隆形成率對比Fig.2The contrast of cloning formation efficiency between KFs and NFs under low-density culture conditions

3 討論

低密度培養(yǎng)方法是一種檢測原代細胞中是否有干細胞存在的經(jīng)典方法，該方法的原理是基于干細胞本身具有的自我更新能力[4]，已廣泛應(yīng)用于腫瘤干細胞的研究[5-7]。為探索低密度培養(yǎng)的最佳密度，我們在預(yù)實驗中嘗試了3種不同的接種密度，發(fā)現(xiàn)KFs和NFs均可形成細胞克隆。以3 000個/皿密度接種的細胞在直徑10 cm的培養(yǎng)皿中可形成1～2個克隆，其形成的克隆數(shù)目少且排列松散，相對失敗率較高。5 000個/皿密度接種培養(yǎng)的細胞形成的克隆數(shù)目多，但克隆集落彼此鄰近難以分辨，篩選率低。而以4 000個/皿密度接種培養(yǎng)的KFs可獲得明顯的克隆集落形成。因此，我們選取4 000個/皿的接種密度進行實驗。

瘢痕疙瘩的發(fā)病機理尚未完全闡明，治療后極易復(fù)發(fā)，導(dǎo)致臨床缺乏切實有效的治療手段[8]。不同于增生性瘢痕和其他瘢痕，瘢痕疙瘩具有持續(xù)浸潤性生長、侵犯正常皮膚、易于耐藥和復(fù)發(fā)的特性，即具有類似于腫瘤的特點，即瘢痕疙瘩腫瘤源性學說。研究表明，與正常皮膚成纖維細胞相比，瘢痕疙瘩成纖維細胞具有類似于腫瘤細胞的生物學特點，一些腫瘤相關(guān)基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中有特異性表達[9-11]。此外，瘢痕疙瘩具有一定的遺傳傾向及家族聚集性，存在癌基因過度表達、抑癌基因突變失活、多種生長因子表達及信號通路的異常等[12-14]。

鑒于瘢痕疙瘩與腫瘤相似的特點，瘢痕疙瘩可以采用抗腫瘤藥物，如5-氟尿嘧啶（5-FU）、秋水仙堿、絲裂霉素等進行治療[15-16]，治療后大部分瘢痕疙瘩出現(xiàn)萎縮，但仍有一定比例的復(fù)發(fā)，并出現(xiàn)瘢痕疙瘩局部組織對治療藥物不敏感的現(xiàn)象，提示瘢痕疙瘩可能存在與腫瘤類似的“細胞耐藥”機制。

關(guān)于腫瘤細胞的耐藥機制，最新的學說認為是由于腫瘤干細胞（tumor stem cell，TSC）表達耐藥基因所致[17-18]。TSC是指腫瘤中存在的少量具有自我更新能力、多向分化潛能，并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞的細胞。TSC理論認為，腫瘤可能是由TSC產(chǎn)生，TSC則可能由正常組織干細胞突變形成[19]。TSC具有強大的自我更新能力、高致瘤性、多向分化潛能，并表達多種干細胞標志物（如膜表面蛋白CD34、CD117和CD133，細胞骨架蛋白如Nestin以及一些與自我更新相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如Oct-4和Nanog等）。TSC還表現(xiàn)出對多種抗腫瘤藥物的耐藥性，被認為是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因。

目前在幾乎所有正常組織中均可發(fā)現(xiàn)干細胞的存在[20-21]。Moon等[22]采用貼壁培養(yǎng)法從瘢痕疙瘩組織中分離出了間充質(zhì)樣干細胞，Zhang等[23]也采用單細胞克隆法從瘢痕疙瘩組織中分離出了腫瘤樣干細胞。本研究通過比較瘢痕疙瘩成纖維細胞和正常真皮成纖維細胞間克隆形成率的差異，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩成纖維細胞形成克隆的能力顯著高于正常真皮成纖維細胞，提示瘢痕疙瘩中可能存在某些具有干細胞樣特性的病理性瘢痕疙瘩細胞，表現(xiàn)出較高的自我更新能力和高增殖狀態(tài)。

結(jié)合本實驗結(jié)果，我們有理由認為，正常皮膚組織干細胞在瘢痕疙瘩的特殊病理環(huán)境因素或某種致病因子作用下，有可能轉(zhuǎn)變?yōu)樘厥獾牟±硇浴榜：鄹泶窀杉毎保@些細胞具有強大的自我更新能力及耐藥性，可以通過不對稱分裂既維持自身的存在，又不斷產(chǎn)生新的瘢痕疙瘩細胞，從而使瘢痕疙瘩出現(xiàn)浸潤性生長和易于耐藥的臨床表現(xiàn)。

若能分離出瘢痕疙瘩干細胞，并研究其細胞增殖潛能、凋亡、耐藥性、耐藥基因表達及多向分化潛能等，將有助于了解瘢痕疙瘩干細胞的生物學特性，闡明瘢痕疙瘩浸潤性生長、高復(fù)發(fā)率及耐藥性等病理特征的機制，為研究瘢痕疙瘩更為有效的治療方案奠定科學基礎(chǔ)。

[1]Niessen FB,Spauwen PH,Schalkwijk J,et al.On the nature of hypertrophic scars and keloids:a review[J].Plast Reconstr Surg, 1999,104(5):1435-1458.

[2]Kelly AP.Medical and surgical therapies for keloids[J].Dermatol Ther,2004,17(2):212-218.

[3]Guo W,Lasky JL 3rd,Wu H.Cancer stem cells[J].Pediatr Res, 2006,59(4 Pt 2):59R-64R.

[4]Hope K,Bhatia M.Clonal interrogation of stem cells[J].Nat Methods,2011,8(4 Suppl):S36-S40.

[5]Kishi T,Takao T,Fujita K,et al.Clonal proliferation of multipotentstem/progenitor cells in the neonatal and adult salivary glands[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,340(2):544-552.

[6]Miller RH,Szigeti V.Clonal analysis of astrocyte diversity in neonatal rat spinal cord cultures[J].Development,1991,113(1): 353-362.

[7]Cao X,Gu Y,Jiang L,et al.A new approach to screening cancer stem cells from the U251 human glioma cell line based on cell growth state[J].Oncol Rep,2013,29(3):1013-1018.

[8]Mustoe TA,Cooter RD,Gold MH,et al.International clinical recommendations on scar management[J].Plast Reconstr Surg, 2002,110(2):560-571.

[9]Vincent AS,Phan TT,Mukhopadhyay A,et al.Human skin keloid fibroblasts display bioenergetics of cancer cells[J].J Invest Dermatol,2008,128(3):702-709.

[10]Satish L,Lyons-Weiler J,Hebda PA,et al.Gene expression patterns in isolated keloid fibroblasts[J].Wound Repair Regen, 2006,14(4):463-470.

[11]蔡景龍.瘢痕疙瘩發(fā)生的腫瘤源性學說[J].中華醫(yī)學雜志,2009, 89(16):1084-1087.

[12]Brown JJ,Ollier W,Arscott G,et al.Genetic susceptibility to keloid scarring:SMAD gene SNP frequencies in Afro-Caribbeans [J].Exp Dermatol,2008,17(7):610-613.

[13]De Felice B,Ciarmiello LF,Mondola P,et al.Differential p63 and p53 expression in human keloid fibroblasts and hypertrophic scar fibroblasts[J].DNA Cell Biol,2007,26(8):541-547.

[14]胡振富,羅力生,羅盛康.病理性瘢痕中c-myc、c-fos和ras原癌deep bite prior to surgical mandibular advancement[J].Eur J Orthod,2010,32(3):342-345.

[17]陳小平,林潔,楊甄宇,等.下面部輪廓過寬改型的新概念[J].中華整形外科雜志,2007,23(6):540-541.

[18]祖青,米從波,聶晶,等.中國美貌女性頦部軟組織形態(tài)的分布[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(22):4065-4068.

[19]朱明,柴崗,張艷,等.下頜骨截骨術(shù)后咬肌變化的研究[J].中華整形外科雜志,2010,26(5):340-344.

[20]Yang J,Wang L,Xu H,et al.Mandibular oblique ostectomy:an alternative procedure to reduce the width of the lower face[J].J Craniofac Surg,2009,20(Suppl 2):1822-1826.

[21]Dutedoo HS.Transtative and transformative growth of the rat mandible[J].Acta 0dontol Scand,1978,36(1):25-32.

[22]Weijs WA,Hillen B.Corrections between the cross-sectional area of the jaw muscles and craniofaeial size and shape[J].Am J Phys Anthropol,1986,70(4):423-431.

[23]Van Spronson PH,Weijs WA,Pranhl-Andersen B.Comparison of jaw muscle bite-force cross-sections obtained by means of magnetic resonance imaging and high-resolution CT scanning[J]. J Dent Res,1989,68(12):1765-1770.

[24]Pu Z,Zhang Y,Yang J,et al.Mandibular angle ostectomy for Chinese wowen:approaches and extent determined by cephalometric analysis[J].J Craniofac Surg,2009,20(1):105-110.

[25]Hwang K,Han JY,Kil MS,et al.Treatment of condyle fracture caused by mandibular angle ostectomy[J].J Craniofac Surg, 2002,13(5):709-712.基因表達的實驗研究[J].中華整形外科雜志,2002,18(3):165-167.

[15]Al-Attar A,Mess S,Thomassen JM,et al.Keloid pathogenesis and treatment[J].Plast Reconstr Surg,2006,117(1):286-300.

[16]陳發(fā)國,姜萍,張建軍,等.絲裂霉素C治療產(chǎn)瘢痕疙瘩21例[J].皮膚病與性病,2006,28(4):40.

[17]Sabisz M,Skladanowski A.Cancer stem cells and escape from drug-induced premature senescence in human lung tumor cells: implications for drug resistance and in vitro drug screening models[J].Cell Cycle,2009,8(19):3208-3217.

[18]Gangemi R,Paleari L,Orengo AM,et al.Cancer stem cells:a new paradigm for understanding tumor growth and progression and drug resistance[J].Curr Med Chem,2009,16(14):1688-1703.

[19]Polyak K,Hahn WC.Roots and stems:stem cells in cancer[J]. Nat Med,2006,12(3):296-300.

[20]Brunt KR,Weisel RD,Li RK.Stem cells and regenerative medicinefuture perspectives[J].Can J Physiol Pharmacol,2012,90(3):327-335. [21]Chen FG,Zhang WJ,Bi D,et al.Clonal analysis of nestin(-) vimentin(+)multipotent fibroblasts isolated from human dermis [J].J Cell Sci,2007,120(Pt 16):2875-2883.

[22]Moon JH,Kwak SS,Park G,et al.Isolation and characterization of multipotent human keloid-derived mesenchymal-like stem cells[J].Stem Cells Dev,2008,17(4):713-724.

[23]Zhang Q,Yamaza T,Kelly AP,et al.Tumor-like stem cells derived from human keloid are governed by the inflammatory niche driven by IL-17/IL-6 axis[J].PLoS One,2009,4(11):e7798.（收稿日期：2013年12月28日；修回日期：2014年2月5日）

Clonal Analysis on Low Density Culture of Keloid Fibroblasts

QU Miao,WU Xiaoli,CHAI Gang.Department of

Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China.Corresponding author:WU Xiaoli(E-mail: wuxiaoli528@gmail.com);CHAI Gang(E-mail:13918218178@163.com).

ObjectiveTo compare the clone forming capacity between keloid fibroblasts(KFs)and normal dermal fibroblasts(NFs),and to explore whether there are pathological stem cells in keloid and the role of keloid stem cells on the mechanism of keloid formation.MethodsPrimary cells were obtained from keloid tissue and normal dermis respectively through enzyme digestion method,and then were cultured under low-density conditions of 4 000/dish.Two weeks later,the clone formation and morphology were determined.ResultsUnder low-density culture conditions,clones were formed in both KFs and NFs.KFs formed distinct and dense clones while NFs formed loose and fewer ones.KFs exhibited higher clone forming efficiency(CFE)of(0.80±0.21)%than NFs with CFE of(0.18±0.06)%(P<0.05).ConclusionWith low-density culture,keloid fibroblasts possess higher level of cloning capacity than normal dermal fibroblasts,which suggests pathological stem cells may exist in keloid tissues.

Keloid;Low-density culture;Cloning formation efficiency;Keloid stem cells

R619+.6

A

1673－0364（2014）02－0082－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.02.005

2013年12月28日；

2014年2月19日）

國家自然科學基金項目（30872694，81101432）。

200011上海市上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點實驗室。

武曉莉（E-mail：wuxiaoli528@gmail.com）；柴崗（E-mail：13918218178@163.com）。