mTSLP-V1/V2融合蛋白的真核表達(dá)與鑒定①

楚 鷹 王亭亭 芮昱文 宋思維 蘇艾榮 程 林 宋紅勇 鄭大同 吳稚偉

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共健康醫(yī)學(xué)中心，南京 210093）

mTSLP-V1/V2融合蛋白的真核表達(dá)與鑒定①

楚 鷹 王亭亭 芮昱文 宋思維 蘇艾榮 程 林 宋紅勇 鄭大同②吳稚偉③

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共健康醫(yī)學(xué)中心，南京 210093）

目的:將鼠胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（mouse thymic stromal lymphopoietin，mTSLP）與人免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）B亞型分離株BAL的gp120 V1/V2結(jié)構(gòu)域在293F真核細(xì)胞表達(dá)體系中進(jìn)行融合表達(dá)。方法:以真核表達(dá)質(zhì)粒pCEP-Pu為載體，構(gòu)建mTSLP與gp120BALV1V2融合基因的重組蛋白表達(dá)質(zhì)粒pCTV1V2BAL。限制性酶切電泳與測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建正確后，使用PEI瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293F懸浮細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物以SDS-PAGE與Western blot進(jìn)行分析，并對(duì)純化后重組蛋白的V1/V2抗原表位進(jìn)行了ELISA分析。結(jié)果:SDS-PAGE、Western blot分析顯示，在表觀分子量35 kD至55 kD的范圍內(nèi)存在一條不均一的糖蛋白條帶，并且能與抗mTSLP多克隆抗體和抗His標(biāo)簽單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)。HIV-1陽(yáng)性病人血清能夠識(shí)別mTSLP-V1/V2BAL上的HIV-1V1/V2抗原表位。結(jié)論:在293F中成功表達(dá)了mTSLP-V1/V2BAL融合蛋白，該蛋白具有HIV-1gp120BALV1/V2區(qū)的抗原表位，能夠用于HIV-1 gp120 V1/V2亞單位疫苗的研究。

人免疫缺陷病毒1型;gp120可變區(qū)1/2;鼠胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素;293F表達(dá)體系;融合蛋白

自從1983年HIV被確認(rèn)為AIDS的病因以來(lái)［1］，全世界科學(xué)家經(jīng)過(guò)30年的努力，仍然沒(méi)有找到能夠阻斷病毒傳播的有效疫苗。HIV作為以性傳播作為主要傳播方式的病原體，有效的疫苗需要在病毒入侵的黏膜部位誘導(dǎo)強(qiáng)有力且持久的體液免疫反應(yīng)。因此設(shè)計(jì)能夠誘導(dǎo)黏膜抗體，特別是特異性的IgA與IgG的疫苗具有重要意義［2］。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素TSLP是一種特殊的B細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子，該分子類似IL-7，具有一個(gè)4-螺旋花束樣結(jié)構(gòu)，大小為140個(gè)氨基酸。最初的研究表明該因子能夠支持B細(xì)胞發(fā)育，而進(jìn)一步的研究則表明TSLP能夠激活DC，并誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞分化，從而促進(jìn)特異性IgA分泌性B細(xì)胞的生成［3］。最近有研究證明利用TSLP作為黏膜佐劑，能夠同時(shí)提高針對(duì)HIV gp140蛋白的黏膜以及系統(tǒng)免疫反應(yīng)［4］。該結(jié)果提示TSLP具有開發(fā)為HIV黏膜疫苗佐劑的潛力。HIV表面的包膜蛋白gp120是病毒受體結(jié)合蛋白，也是中和抗體識(shí)別的主要靶點(diǎn)［5］。最近結(jié)束的泰國(guó)HIV疫苗臨床實(shí)驗(yàn)表明，針對(duì)HIV-1包膜蛋白gp120可變區(qū)V1/V2的抗體反應(yīng)與疫苗保護(hù)效果具有正相關(guān)性［6］。本研究通過(guò)構(gòu)建鼠TSLP-V1/V2融合表達(dá)載體，成功表達(dá)了具有V1V2抗原表位的抗原-佐劑融合蛋白，為深入研究HIV-1 V1/V2亞單位黏膜疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌菌株DH5α由本室保存。真核表達(dá)質(zhì)粒pCEP-Pu由意大利國(guó)家癌癥研究所Maurizio Mongiat博士惠贈(zèng)。HIV-1 V1/V2BAL基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后，由Genescript公司合成，克隆于pUC57載體中。鼠TSLP基因質(zhì)粒由日本佐賀大學(xué)醫(yī)學(xué)部Kazuhiko Arima博士惠贈(zèng)。293F細(xì)胞以及FreeStyle 293表達(dá)培養(yǎng)基購(gòu)自Life Technologies公司。限制性內(nèi)切酶 NheⅠ，XhoⅠ，T4 DNA連接酶，預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo公司。DNA聚合酶PrimeSTAR與DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。質(zhì)粒DNA提取純化試劑盒購(gòu)自Promega公司。轉(zhuǎn)染試劑Polyethylenimine（PEI）購(gòu)自Polyscience公司。Anti-His-tag鼠單克隆抗體購(gòu)自Abmart公司。羊抗鼠，羊抗兔熒光二抗以及Odyssey封閉緩沖液購(gòu)自LI-COR公司。堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人二抗購(gòu)自 ZYMED。ELISA顯色底物pNPP購(gòu)自Sigma。用于His標(biāo)簽親和純化的Swell-Gel nickel chelate discs與BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Pierce。HIV-1陽(yáng)性病人血清由北京佑安醫(yī)院吳昊教授提供。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┡渲啤?/p>

1.2 方法

1.2.1 mTSLP-V1/V2BAL重組質(zhì)粒構(gòu)建 采用overlapping PCR方法構(gòu)建mTSLP-V1/V2BAL基因融合片段。第一輪PCR分別擴(kuò)增mTSLP基因（GenBank No.NM021367）與 HIV-1 V1/V2BAL基因片段（Gen-Bank No.AY426110），其中使用引物對(duì) 1（5'-CTAGCTAGCGTACAACTTTTCTAACTGC-3'，5'-CCGCCGCCGCTTCCGCCTCCGCCGCTGCCTTCTGGAGATTGCATG-3'）擴(kuò)增mTSLP基因編碼區(qū)序列（20～140 aa），去除了mTSLP自身的信號(hào)肽序列，在其5'端引入NheⅠ酶切位點(diǎn)，在其3'端引入長(zhǎng)度為14 aa的glycine-serine linker序列（GSGGGGSGGGGSGS）;使用引物對(duì)2（5'-GCGGAAGCGGCGGCGGAGGCAGCGGCAGCCTGAAGCCCTGCGTG-3'，5'-CCGCTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3'）擴(kuò)增HIV-1 V1/V2BAL基因片段，在其5'端引入 glycine-serine linker的互補(bǔ)序列，在其3'端引入6×His標(biāo)簽與XhoⅠ酶切位點(diǎn)。第一輪PCR擴(kuò)增參數(shù):98℃，10 s;55℃，15 s;72℃，30 s;30個(gè)循環(huán);72℃，5 min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，割膠回收純化目的片段。第二輪PCR使用上述回收純化的目的片段作為模板，使用引物對(duì)1的正向引物和引物對(duì)2的反向引物進(jìn)行擴(kuò)增，融合mTSLP與V1/V2BAL。第二輪PCR擴(kuò)增參數(shù):98℃，10 s;55℃，15 s;72℃，1min;30個(gè)循環(huán);72℃，5min。1%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，割膠回收純化融合基因片段。使用限制性內(nèi)切酶NheⅠ、XhoⅠ分別酶切mTSLP-V1/V2BAL基因片段與pCEP-Pu質(zhì)粒，膠回收載體片段，T4 DNA連接酶將目的片段與載體片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取重組克隆，通過(guò)酶切與測(cè)序驗(yàn)證后，將該重組蛋白質(zhì)粒命名為pCTV1V2BAL。

1.2.2 mTSLP-V1/V2BAL重組蛋白在 293F 細(xì)胞中的表達(dá) 使用293F懸浮細(xì)胞表達(dá)重組蛋白［7］，具體步驟如下:①轉(zhuǎn)染前一天以（0.6～0.7）×106cells/ml密度接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞密度應(yīng)達(dá)到（1.2 ～1.5）×106cells/ml，細(xì)胞狀態(tài)良好，多數(shù)呈單個(gè)散在細(xì)胞的形式存在，其細(xì)胞活力達(dá)95%以上。②稀釋細(xì)胞至1×106cells/ml。③使用1/10轉(zhuǎn)染體積的FreeStyle 293培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒，混勻后加入PEI，輕吹混勻，室溫孵育 15～20 min（PEI與Plasmid的轉(zhuǎn)染終濃度分別為2μg/ml與1μg/ml）。④將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩緩加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，同時(shí)輕搖混勻。⑤放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后無(wú)需更換培養(yǎng)基。⑥轉(zhuǎn)染后第6天收集培養(yǎng)物，用于蛋白純化。

1.2.3 重組蛋白純化 因?yàn)閙TSLP-V1/V2BAL重組蛋白N端融合有BM40信號(hào)肽［8］，其主要成分為分泌型蛋白。利用其 C端帶有 his-tag標(biāo)簽，使用Pierce SwellGel nickel chelate discs進(jìn)行純化。具體方法如下:①將過(guò)濾后的細(xì)胞上清液的pH值調(diào)至7.0左右。②加入一顆disc，混合均勻后，室溫結(jié)合2 h，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。③加入1 ml洗滌緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，30 mmol/L 咪唑，pH7.4），室溫顛倒混勻 5 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清液。重復(fù)洗滌4次以去除雜蛋白。④加入200μl洗脫緩沖液（50 mmol/L Na3PO4，300 mmol/L NaCl，300 mmol/L 咪 唑，pH 7.4），室溫顛倒混勻5 min，1 500 r/min 離心5 min，收集上清液。重復(fù)洗脫2次，合并洗脫產(chǎn)物。

1.2.4 重組蛋白的 SDS-PAGE分析以及 Western blot鑒定 將純化蛋白與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞上進(jìn)行SDSPAGE分離。電泳膠組成為5%濃縮膠，10%分離膠。用非還原上樣緩沖液上樣，60 V電泳30 min，將電壓調(diào)至120 V，電泳至指示劑前沿到達(dá)膠底。用去離子水漂洗3次，每次5 min，考馬斯亮藍(lán)R250染液室溫染色1 h。去離子水漂洗后，使用Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃描結(jié)果。

另外準(zhǔn)備樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜后，Odyssey封閉緩沖液室溫封閉1 h，一抗分別用anti-his鼠單克隆抗體（1∶500稀釋）和anti-TSLP兔多克隆抗體 （1∶200稀釋），4℃孵育過(guò)夜，0.1%PBST洗滌10 min，3次。二抗采用熒光標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔抗體（均為1∶15 000稀釋），室溫孵育1 h。0.1%PBST洗滌10 min，3次。Odyssey紅外成像系統(tǒng)掃描結(jié)果。

1.2.5 重組蛋白與HIV-1陽(yáng)性病人血清的反應(yīng)利用 ELISA檢測(cè) mTSLP-V1/V2BAL重組蛋白上的HIV-1抗原表位。具體步驟如下:①使用BCA蛋白定量試劑盒定量重組蛋白。②使用碳酸鹽緩沖液（pH9.6）包被250 ng蛋白于96孔聚乙烯微孔板，4℃孵育過(guò)夜。③0.05%的PBST洗滌5遍，4%脫脂奶粉封閉，37℃孵育1 h。④0.05%的PBST洗滌5遍，4%脫脂奶粉稀釋 HIV-1陽(yáng)性病人血清（1∶1 000稀釋），37℃ 孵育 1 h。⑤0.05% 的 PBST洗滌5遍，4%脫脂奶粉稀釋堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人二抗（1∶1 000稀釋），37℃孵育1 h。⑥0.05%的PBST洗滌5遍，加入pNPP底物，37℃孵育20 min，檢測(cè)OD405值。

2 結(jié)果

2.1 mTSLP-V1/V2BAL重組質(zhì)粒構(gòu)建 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分離后，分別顯示402、356、742 bp的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。

將重組質(zhì)粒pCTV1V2BAL進(jìn)行NheⅠ、XhoⅠ雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在750 bp位置出現(xiàn)目標(biāo)片段（圖2）。使用通用測(cè)序引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明與GenBank登陸的序列完全一致，未出現(xiàn)突變或移碼。

2.2 SDS-PAGE電泳和 Western blot檢測(cè)結(jié)果mTSLP-V1/V2BAL重組融合蛋白含有231個(gè)氨基酸，其V1/V2部分長(zhǎng)度為98個(gè)氨基酸，其序列上包含5個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，根據(jù)理論推測(cè)融合蛋白的表觀分子量約為41～50 kD。純化后的mTSLP-V1/V2BAL蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍(lán)染色后，在40 kD處出現(xiàn)了目標(biāo)條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致（圖3）。分別使用anti-TSLP兔多克隆抗體和antihis鼠單克隆抗體檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)，均能在35 kD至55 kD范圍內(nèi)檢測(cè)到一條不均一的糖蛋白條帶，說(shuō)明該融合蛋白N端的TSLP與C端的V1/V2均得到正確的表達(dá)（圖4）。

圖1 m TSLP-V1/V2BAL的over-lapping PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Over-lapping PCR results ofm TSLP-V1/V2BAL

圖2 重組質(zhì)粒pCTV1V2BAL的酶切鑒定圖譜Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasm id pCTV1V2BAL

圖5 重組蛋白m TSLP-V1/V2BAL的ELISA分析Fig.5 ELISA reaction profiles of m TSLP-V1/V2BAL protein w ith a panel of human sera

2.3 ELISA檢測(cè)結(jié)果 為檢測(cè)重組蛋白是否具有正確的V1/V2抗原表位，使用ELISA分析HIV-1陽(yáng)性病人血清對(duì)其的結(jié)合反應(yīng)。結(jié)果表明9份HIV-1陽(yáng)性病人血清均能識(shí)別重組蛋白，而HIV-1陰性血清與重組蛋白沒(méi)有反應(yīng)（圖5）。該結(jié)果說(shuō)明mTSLP-V1/V2BAL具有HIV-1 V1/V2結(jié)構(gòu)域的天然抗原表位。

3 討論

HIV-1作為主要通過(guò)黏膜傳播的病原體，其傳播過(guò)程中首先面對(duì)的就是黏膜表面各種物理屏障以及黏膜免疫系統(tǒng)的阻擋。當(dāng)黏膜暴露于HIV-1后，只有少量的病毒顆粒能夠穿過(guò)黏膜層建立初始感染。最初感染的靶細(xì)胞是位于黏膜層激活的CD4+T淋巴細(xì)胞。病毒庫(kù)的初始建立視為急性感染的開始，隨后病毒的復(fù)制導(dǎo)致腸道黏膜層的淋巴細(xì)胞急劇減少［9］。腸道黏膜層的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌遷移以及長(zhǎng)期的免疫激活，這導(dǎo)致宿主逐漸進(jìn)入免疫缺陷的進(jìn)展期。宿主的免疫反應(yīng)可以控制病毒的復(fù)制但是卻無(wú)法徹底清除病毒。因此，利用黏膜疫苗誘導(dǎo)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護(hù)性的免疫反應(yīng)，阻斷HIV病毒的傳播，這是一個(gè)很有潛力的疫苗開發(fā)策略。

當(dāng)傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)免疫原應(yīng)用于黏膜免疫時(shí)，經(jīng)常會(huì)遇到免疫原性弱或無(wú)免疫應(yīng)答的情況，所以尋找合適的黏膜免疫佐劑是HIV-1黏膜疫苗成功的前提。TSLP是一種主要由上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，通過(guò)激活DC細(xì)胞，TSLP能夠誘導(dǎo)Th2型炎癥反應(yīng)［3］。Van Roey等［4］報(bào)道，利用 TSLP 作為黏膜佐劑，通過(guò)鼻腔免疫的方式，能夠在小鼠上誘導(dǎo)針對(duì)HIV-1 gp140蛋白的特異性抗體反應(yīng)，而且該反應(yīng)同時(shí)出現(xiàn)在黏膜以及血清中，其免疫反應(yīng)強(qiáng)度與經(jīng)典的黏膜佐劑霍亂毒素（Cholera toxin，CT）相當(dāng)。TSLP可能通過(guò)直接激活鼻黏膜內(nèi)的DCs，促使其攝取HIV-1 gp140蛋白，然后通過(guò)激活Th細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞的激活與分化。此外，TSLP能夠與TCR刺激協(xié)同作用，直接激活幼稚CD4+T細(xì)胞，促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化、增殖以及Th2效應(yīng)細(xì)胞的存活［10，11］。因此，TSLP具有誘導(dǎo)保護(hù)性黏膜免疫反應(yīng)的潛在能力，其作為HIV-1黏膜疫苗佐劑的應(yīng)用值得進(jìn)一步的研究。

長(zhǎng)期以來(lái)的觀點(diǎn)認(rèn)為，保護(hù)性HIV-1疫苗應(yīng)該能夠誘導(dǎo)廣譜中和抗體反應(yīng)［12］。被動(dòng)保護(hù)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明廣譜中和抗體能夠阻止SHIV感染靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型［13］。進(jìn)一步的研究則表明被動(dòng)轉(zhuǎn)移的中和抗體能夠在停止抗病毒治療的個(gè)體內(nèi)延遲HIV-1病毒的反彈［14］。最近在人源化小鼠動(dòng)物模型的研究證明，利用基因治療的手段導(dǎo)入并表達(dá)中和抗體，能夠提供類似于疫苗的保護(hù)效果［15］。Bomsel等［2］人利用gp41亞單位病毒樣顆粒疫苗，在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)出保護(hù)性黏膜抗體反應(yīng)。泰國(guó)RV144疫苗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明針對(duì)V1/V2的IgG抗體與疫苗保護(hù)效果具有相關(guān)性［6］。之前的研究結(jié)果表明，針對(duì)V1/V2抗原表位的抗體通常出現(xiàn)在感染早期，而且由于該區(qū)域的高度變異性，針對(duì)V1/V2抗體通常是亞型特異性的［16］。但最新分離的一系列廣譜中和抗體（PG9、PG16、PGT145）均是針對(duì)V1/V2的保守結(jié)構(gòu)域［17，18］，這充分證明了 V1/V2 區(qū)域作為保守中和抗體靶點(diǎn)的重要意義。我們之前的研究表明，真核表達(dá)的重組V1/V2蛋白具有正確的蛋白構(gòu)象以及抗原表位［19］。因此在本研究中，利用239F懸浮細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，我們成功構(gòu)建了具有正確構(gòu)象的HIV-1 V1/V2-佐劑融合蛋白，該蛋白分泌表達(dá)，純化方法簡(jiǎn)便，可以進(jìn)一步用于黏膜免疫實(shí)驗(yàn)，誘導(dǎo)針對(duì)V1/V2中和表位的保護(hù)性抗體反應(yīng)。

［1］ Barré-Sinoussi F，Chermann JC，Rey F，et al.Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome（AIDS）［J］.Science，1983，220（4599）:868-871.

［2］ Bomsel M，Tudor D，Drillet AS，et al.Immunization with HIV-1 gp41 subunit virosomes inducesmucosal antibodies protecting nonhuman primates against vaginal SHIV challenges［J］.Immunity，2011，34（2）:269-280.

［3］ Liu，YJ，Soumelis V，Watanabe N，etal.TSLP:an epithelial cell cytokine that regulates T cell differentiation by conditioning dendritic cell maturation ［J］.Annu Rev Immunol，2007，25:193-219.

［4］ Van Roey GA，Arias MA，Tregoning JS.Thymic stromal lymphopoietin（TSLP）actsasa potentmucosal adjuvant for HIV-1 gp140 vaccination inmice［J］.Eur JImmunol，2012，42（2）:353-363.

［5］ McElrath MJ，Haynes BF.Induction of immunity to human immunodeficiency virus type-1 by vaccination［J］.Immunity，2010，33（4）:542-554.

［6］ Haynes BF，Gilbert PB，McElrath MJ，etal.Immune-correlatesanalysis of an HIV-1 vaccine efficacy trial［J］.New Engl JMed，2012，366（14）:1275-1286.

［7］ Redmond TM，Poliakov E，Yu S，et al.Mutation of key residues of RPE65 abolishes its enzymatic role as isomerohydrolase in the visual cycle［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（38）:13658-13663.

［8］ MongiatM，Sweeney SM，San Antonio JD，et al.Endorepellin，a novel inhibitor of angiogenesis derived from the C terminus of perlecan［J］.JBio Chem，2003，278（6）:4238-4249.

［9］ Haase A.Targeting early infection to prevent HIV-1mucosal transmission［J］.Nature，2010，464（7286）:217-223.

［10］ Rochman I，Watanabe N，Arima K，et al.Cutting edge:direct action of thymic stromal lymphopoietin on activated human CD4+T cells［J］.J Immunol，2007，178（11）:6720-6724.

［11］ Kitajima M，Lee HC，Nakayama T，et al.TSLP enhances the function of helper type 2 cells［J］.Eur J Immunol，2011，41（7）:1862-1871.

［12］ Van Gils，MJ，and Sanders RW.Broadly neutralizing antibodies against HIV-1:Templates for a vaccine ［J］.Virology，2013，435（1）:46-56.

［13］ Hessell AJ，Rakasz EG，Poignard P，et al.Broadly neutralizing human anti-HIV antibody 2G12 is effective in protection against mucosal SHIV challenge even at low serum neutralizing titers［J］.PLoSPathogens，2009，5（5）:1000433.

［14］ Trkola A，Kuster H，Rusert P，etal.Delay of HIV-1 rebound after cessation of antiretroviral therapy through passive transfer of human neutralizing antibodies［J］.NatMed，2005，11（6）:615-622.

［15］ Balazs AB，Chen J，Hong CM，et al.Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis［J］.Nature，2011，481（7379）:81-84.

［16］ Pinter A.Roles of HIV-1 Env variable regions in viral neutralization and vaccine development［J］.Curr HIV Res，2007，5（6）:542-553.

［17］ Walker LM，Phogat SK，Chan-Hui PY，et al.Broad and potent neutralizing antibodies from an african donor reveal a new HIV-1 vaccine target［J］.Science，2009，326（5950）:285-289.

［18］ Walker LM，Huber M，Doores KJ，et al.Broad neutralization coverage of HIV by multiple highly potent antibodies［J］.Nature，2011，477（7365）:466-470.

［19］ 宋紅勇，楚 鷹，吳稚偉.HIV-1膜蛋白GP120V1/V2區(qū)域的真核表達(dá)、純化和鑒定［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012，28（2）:142-145.

［收稿2013-10-05 修回2014-01-16］

（編輯 倪 鵬）

Eukaryotic expression and characterization ofmouse TSLP and HIV-1 gp120BALV1/V2 fusion protein

CHUYing，WANGTing-Ting，RUIYu-Wen，SONGSi-Wei，SUAi-Rong，CHENGLin，SONGHong-Yong，ZHENGDa-Tong，WUZhi-Wei.CenterforPublicHealthResearch，MedicalSchool，NanjingUniversity，Nanjing210093，China

Objective:To express fusion protein ofmouse thymic stromal lymphopoietin（TSLP）and HIV-1 gp120BALV1/V2 subdomain in 293F cell.Methods:Full length of the V1V2 sequence from BAL isolatewas fused with the C-terminus ofmouse thymic stromal lymphopoietin（TSLP）and sub-cloned into pCEP-Pu vector to construct the eukaryotic expression plasmid-pCTV1V2BAL.The recombinant plasmid was confirmed by enzyme digestion and sequencing，then transfected into 293F cells using PEIas a transfection reagent.The fusion protein was purified by metal chelate affinity chromatography and characterized by SDS-PAGE and Western blot.The epitopes of V1/V2 in fusion protein were identified by ELISA.Results:The SDS-PAGE and Western blot results showed that there were highly heterogeneous glycoprotein bands at the site between 35 kD and 55 kD，which reacted with anti-mTSLP rabbit polyclonal antibody and anti-His tagmousemonoclonal antibody.The ELISA analysis showed that antibodies to V1/V2BALexisted in the sera of HIV-1 positive patients.Conclusion:ThemTSLP-V1/V2 fusion protein was successfully expressed in 293F cells，whichmay be useful for HIV-1 vaccine research.

HIV-1;gp120 V1/V2;TSLP;293F expression system;Fusion protein

R392.11

A

1000-484X（2014）05-0582-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.002

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（No.30870124），科技部國(guó)際合作項(xiàng)目 （No.2009DFA31260）的資助。

②南京醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，南京210011。

③通訊作者，E-mail:wzhw@nju.edu.cn。

楚 鷹（1979年－），男，博士，主要從事HIV-1分子免疫學(xué)方面研究。