七十味珍珠丸對局灶性腦缺血大鼠腦組織中SOD、CAT、MDA的影響

甄麗芳羅遠帶黃福開胡賢達邵 杰尚 穎劉亞麗杜文兵

（1南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州，510515；2中國藏學研究中心北京藏醫(yī)院，北京，100029）

實驗研究

七十味珍珠丸對局灶性腦缺血大鼠腦組織中SOD、CAT、MDA的影響

甄麗芳1羅遠帶2黃福開2胡賢達2邵 杰2尚 穎1劉亞麗1杜文兵1

（1南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，廣州，510515；2中國藏學研究中心北京藏醫(yī)院，北京，100029）

目的：觀察七十味珍珠丸對永久性大腦中動脈阻塞（Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion，PMCAO）大鼠腦組織中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）及丙二醛（Maleic dialdehyde，MDA）含量的影響，初步探討其腦保護作用機制。方法：取SD大鼠用線栓法制備PMCAO模型。觀察七十味珍珠丸對大鼠腦梗死體積、腦組織中超SOD、CAT及MDA含量的影響。結果：與PMCAO模型組比較，七十味珍珠丸高、低劑量組大鼠腦梗死體積都有不同程度的減小（P＜0.01或P＜0.05），腦組織中SOD、CAT含量都有所升高，MDA含量有不同程度下降（P＜0.01）。結論：七十味珍珠丸可能通過有效地增強內源性抗氧化酶清除自由基的能力、減輕腦組織脂質過氧化損傷來實現腦保護作用的。

七十味珍珠丸；局灶性腦缺血損傷；氧化應激

缺血性腦損傷病理過程涉及鈣超載、氧化應激、炎癥級聯反應、興奮性氨基酸毒性、神經元細胞凋亡等，越來越多的研究表明，氧化應激在缺血性腦損傷的病理生理機制中發(fā)揮了重要的作用。氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，機體內自由基的產生和內源性抗氧化系統(tǒng)（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、細胞色素氧化酶等）之間的嚴重失衡，導致氧自由基在機體蓄積而引起細胞毒性反應，從而導致組織損傷的過程［1］。而自由基反應參與了腦缺血后神經細胞的損害過程，是導致遲發(fā)性神經元損傷的核心環(huán)節(jié)。七十味珍珠丸（Rannasangpei）由金、銀、珍珠、藍寶石、瑪瑙、麝香、天然牛黃等70味天然動、植、礦物類藥經煮、燒、泡等特殊的加工方法精制而成。含有較高的鐵、鎂、銅、鉻、鋅以及錳等微量元素［2］。而這些微量元素參與構成了抗氧化系統(tǒng)中許多酶的活性中心，由此猜想七十味珍珠丸應該具有抗氧化損傷的作用。本次實驗意在通過觀察七十味珍珠丸對于局灶性腦缺血大鼠腦梗死體積、腦組織中SOD、CAT及MDA含量的影響來驗證上述猜想是否成立。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品 七十味珍珠丸由北京藏醫(yī)院提供，批號：20130109。維腦路通片（曲克蘆丁片）由亞寶藥業(yè)集團股份有限公司生產，批號：20130701。

1.2 實驗動物 SPF級SD大鼠80只，體重230～250g，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：44005900000285。

1.3 實驗試劑 氯化三苯基四氮唑（TTC）購于Sigma公司。大鼠SOD、CAT及MDA的ELISA試劑盒均購自廣州拓科達生物科技有限公司。

1.4 主要儀器 Thermo酶標儀、2K-15低溫離心機等均由南方醫(yī)科大學生命科學樓解剖教研室提供。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組、給藥劑量及方式 購買230～250 g SD大鼠80只，隨機分成兩批，每批隨機分成5組，即假手術組，PMCAO模型組；七十味低劑量組（166 mg/kg·d）；七十味高劑量組（664mg/kg·d）；維腦路通組（50 mg/kg·d），每組各8只大鼠。每天灌胃給藥1次（按體表面積法），連續(xù)14 d，于造模前1 h給藥1次，給藥劑量及途徑同前。假手術組和PMCAO模型組用蒸餾水灌胃。

第一批：進行腦梗死體積檢測（腦片TTC染色及腦梗體積百分比計算）。第二批：測定大鼠腦組織中CAT、SOD、MDA的含量。

1.5.2 建立PMCAO模型 采用改良后的Zea Longa模型［3］制作方法。實驗動物以10%的水合氯醛（0.32 mL/100 g）腹腔麻醉后，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切開皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，暴露右側頸總動脈（Common Carotid Artery，CCA），沿著頸總動脈快速分離勁外動脈（External Carotid Artery，ECA）和頸內動脈（Internal Carotid Artery，ICA）。電凝聯系ECA與ICA之間的動脈。在右ECA主干的遠心端1.5 cm處結扎，提拉ECA殘端的結扎線，用微型血管夾在CCA分出ECA處，將ECA臨時夾閉，在血管夾與ECA殘端之間結扎一道縫合線，不打緊。在ECA遠心端死結與近心端活結之間開一小口，用制備好的直徑為0.21 mm線栓沿ECA插入，扎緊縫合線，綁住線栓，同時松開微型血管夾。當線栓頭端進到ICA與ECA的分叉處。剪斷開口上端的ECA，使線栓掉頭進入右ICA，避開翼顎動脈（Pterygopalatine Artery，PPA），待線栓標記點（距線栓頂端18 mm處做標記）進到分叉內，有阻擋感時，扎緊線栓，縫合切口。在插線的過程中要注意手感，當遇到阻力時不要用蠻勁插入，當線栓彎曲時要更換，手法要輕柔、迅速。假手術組：只是不插入線栓，其他步驟與上述步驟相同。模型成功標準：手術清醒后Bederson評分［4］≥l分者，認為造模成功，可作為實驗納入患者。

1.6 觀測指標

1.6.1 腦組織TTC染色及梗死體積測定 第一批各組大鼠手術24 h后斷頭處死，在生理鹽水冰盤上快速剝離出腦組織，放于-20℃冰箱凍至適當硬度，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余以2 mm間隔行連續(xù)冠狀切片共6片，放入2%氯化三苯基四氮唑（TTC）磷酸鹽緩沖液中（pH＝7.4）中，37℃水孵育恒溫箱內避光孵育30 min后，置于4%多聚甲醛中固定24 h后觀察，正常腦組織著玫瑰紅色，梗死腦組織呈蒼白色。將切片掃描入掃描儀中，保存圖像。運行Image Pro Plus 4.5（IPP）圖像處理軟件，計算腦梗死面積及層面總面積，應用公式：V＝（A1+…An）t（V：梗死體積或全腦體積，t：切片厚度，A：各切片梗死面積或總面積）計算出腦梗死體積及全腦體積，用腦梗死體積百分比（腦梗死體積/全腦體積）來表示腦組織壞死程度。

1.6.2 腦組織中SOD、CAT及MDA的測定 第二批各組大鼠手術24 h后斷頭處死，同時在冰上取腦，取新鮮右側半腦組織，稱重；用吸管吸取預冷的10倍于組織塊重量的勻漿介質（冷PBS pH＝7.4），加入玻璃勻漿管，眼科小剪剪碎組織塊；將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，放入冰水混合的大燒杯中，超聲組織勻漿器制成10%的腦組織勻漿液，將勻漿液以3 000 r/min，離心20 min；取上清液，分裝置-20℃保存，按ELISA試劑盒說明書測定CAT、SOD、MDA的含量。

1.7 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0版統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計，數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單向方差分析，組間兩兩比較方差齊時用LSD檢驗，方差不齊時用Dunntt's T3檢驗。

圖1 TTC染色情況比較（0：假手術組；1：七十味低劑量組；2：七十味高劑量組；3：維腦路通組；4：PMCAO模型組）

2 結果

2.1 各組腦梗死體積比較（見圖1、表1） 假手術組大鼠腦梗死體積測定均為0，即無梗死灶。而PMCAO模型組大鼠右半腦出現較大面積的白色梗死灶（P＜0.01）。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組和維腦路通組大鼠腦梗死體積都有不同程度的減?。≒＜0.01或P＜0.05）。七十味高劑量組大鼠腦梗死體積顯著小于維腦路通組（P＜0.01）。而七十味低劑量組大鼠腦梗死體積與維腦路通組相比無統(tǒng)計學意義。

2.2 各組SOD、CAT及MDA含量比較（見表2、表3）

與假手術組比較，PMCAO模型組大鼠腦組織中SOD、CAT含量明顯下降，而MDA含量顯著升高（P＜0.01）。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組和維腦路通組大鼠腦組織中SOD、CAT含量都有所升高，MDA含量有不同程度下降（P＜0.01），其中以七十味高劑量組更為顯著。而七十味低劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT及MDA含量與維腦路通組相比差異均無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠PMCAO后腦梗死體積的比較（±s）

表1 各組大鼠PMCAO后腦梗死體積的比較（±s）

注：與假手術組比較，ΔP＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與維腦路通組比較，ΔΔP＜0.01。

組別例數劑量（mg/kg·d）腦梗死體積（%）0.0000±0.00000 PMCAO模型組8蒸餾水54.4700±6.02040Δ七十味低劑量組8 166 40.4550±8.04193*七十味高劑量組8 664 27.4475±7.27801**ΔΔ維腦路通組8 50 41.1325±4.12638假手術組8蒸餾水**

表2 各組大鼠PMCAO后腦組織中SOD、CAT及MDA含量比較（±s）

表2 各組大鼠PMCAO后腦組織中SOD、CAT及MDA含量比較（±s）

注：與假手術組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與維腦路通組比較，ΔΔP＜0.01。

組別例數劑量（mg/kg·d）SOD（U/L）CAT（U/L）MDA（nmol/L）04102 PMCAO模型組8蒸餾水100.9729±3.47249▲▲1.5306±0.07163▲▲2.8511±0.09876▲▲七十味低劑量組8 166 108.5886±2.65902**1.6415±0.09413**2.6368±0.09393**七十味高劑量組8 664 122.5188±2.94949**ΔΔ1.9168±0.07662**ΔΔ2.3381±0.08349**ΔΔ維腦路通組8 50 109.2335±4.39312**1.6794±0.05102**2.5708±0.08805假手術組8蒸餾水139.1979±3.18762 2.2063±0.06126 1.9515±0. **

3 討論

大腦中動脈（MCA）是人類腦卒中的好發(fā)部位，線栓法造成大腦中動脈閉塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）模型被認為是局灶性腦缺血的標準動物模型［5］。由于大鼠腦血管解剖結構和功能與人類相近似，種內純合性好，便于進行統(tǒng)計學處理，所以常被用做腦缺血的實驗動物模型。其中永久性大腦中動脈阻塞（Permanent Middle Cerebral Artery Occlusion，PMCAO）模型具有制作簡單、成功率高、術后感染少、結果穩(wěn)定等特點，入選為本次實驗患者。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是呼吸鏈中吡啶-核苷結構酶系統(tǒng)的質子受體，與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織因脫氫酶活性下降，不能反應而呈蒼白色［6］。本實驗觀察到假手術組大鼠冠狀腦組織切面呈均一深紅色，即無梗死灶。而PMCAO模型組腦組織TTC處理后均見到右側半球自顳頂皮層至基底節(jié)區(qū)有較大面積的白色梗死灶（P＜0.01），未缺血組織呈深紅色，說明腦缺血造成了腦組織大面積壞死，壞死區(qū)與MCA支配的腦區(qū)一致，模型制作成功。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組大鼠腦梗死體積都有不同程度的減?。≒＜0.01或P＜0.05），以七十味高劑量組更為顯著，說明七十味珍珠丸可減小大鼠PMCAO后腦梗死體積，抑制缺血造成的腦損傷，具有較好的腦保護作用，其中高劑量作用顯著。

自由基廣泛存在于生物體內，正常情況下參與藥物及毒物的降解，殺滅細菌，調節(jié)免疫功能，而體內存在許多內源性抗氧化系統(tǒng)（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、細胞色素氧化酶等）可以清除自由基，使自由基的生成與清除處于動態(tài)平衡，對機體并無有害影響。由于腦缺血時產生大量自由基，遠遠超過自身內源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，導致大量毒性自由基在組織細胞內堆積，表現為：1）使脂質過氧化，破壞細胞膜；2）使蛋白質變性；3）使DNA突變；4）RNA大分子損傷。

而SOD是體內重要的抗氧化酶，屬于金屬酶，當體內氧自由基（Oxygen Free Radicals，OFR）生成增多時，可與超氧陰離子反應生成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化酶轉變?yōu)樗?，從而清除OFR，保護細胞免受損傷［7］。CAT是一種酶類清除劑，是以鐵卟啉為輔基的結合酶。它可促使自由基H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害［8］，是生物防御體系的關鍵酶之一。MDA是機體脂質過氧化反應的最終產物，其含量可以反映組織中自由基的含量和組織細胞受到自由基攻擊即脂質過氧化反應的程度［9］。

與假手術組比較，PMCAO模型組大鼠腦組織中SOD、CAT含量明顯下降，而MDA含量顯著升高（P＜0.01），說明腦缺血造成了自由基的堆積，引起腦組織脂質過氧化反應加強，消耗了過多的內源性抗氧化酶，氧化-抗氧化平衡被打破，機體抗自由基能力下降，腦組織損傷加重。與PMCAO模型組比較，七十味高、低劑量組大鼠腦組織中SOD、CAT含量都有所升高，MDA含量有不同程度下降（P＜0.01），其中以七十味高劑量組更為顯著；再加之，七十味珍珠丸所含的鐵、鎂、銅、鉻、鋅以及錳等微量元素參與構成了抗氧化系統(tǒng)中多種酶的活性中心（其中鋅、銅作為Cu/Zn-SOD的輔基，在其合成與調節(jié)方面發(fā)揮重要作用；錳參與Mn-SOD的構成，在線粒體中發(fā)揮清除超氧陰離子自由基的作用；Fe3+為CAT的輔基，CAT催化過氧化氫轉變?yōu)樗脱鯕猓?0］），從而說明七十味珍珠丸能夠增強內源性抗氧化酶的活性，清除多余自由基，抑制脂質過氧化反應造成的腦損傷，以高劑量作用顯著。

上述實驗結果提示，七十味珍珠丸可減小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死體積，具有較好的腦保護作用；其機制可能與其增強內源性抗氧化酶的活性，提高機體的抗氧化能力，減輕腦組織脂質過氧化損傷有關。

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（2013-12-10收稿 責任編輯：王明）

Effect of Rannasangpei on the SOD，CAT and M DA in Brain Tissues of Rats with Local Cerebral Ischemia

Zhen Lifang1，Luo Yuandai1，Huang Fukai2，Hu Xianda2，Shao Jie2，Shang Ying1，Liu Yali1，Du Wenbing1
（1 College of Traditional Chinese Medicine，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2 Beijing Tibetan Hospital，China Tibetology Research Center，Beijing 100029，China）

Objective：To explore the effect of Rannasangpei on the SOD，CAT and MDA in the brain tissues of rats with permanent middle cerebral artery occlusion（PMCAO），and to study its cerebral protective mechanism.Methods：SD rats were made into local cerebral ischemic models with the method of permanent middle artery occlusion.The effects of Rannasangpei on the volume of cerebral infarction in rats and the changes of SOD，CAT and MDA contents in their brain tissues were observed.Results：The infarct volumes of rats in two Rannasangpei intervention groups were obviously decreased compared with the PMCAO model group（P＜0.01 or P＜0.05）；compared with the PMCAO model group，the SOD and CAT contents in brain tissues of the rats in the high and low dose Rannasangpei groups were all significantly increased，the MDA contents were decreased in different degrees（P＜0.01）.Conclusion：Rannasangpei has significant protective effect on cerebral ischemic injury in rats，and its protective mechanism may come from effectively enhancing ability of the endogenous antioxidant enzyme to scavenge the free radicals，and relieving lipid peroxidation damage of brain tissue.

Rannasangpei；Local ischemic injury；Oxidative stress

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.03.029

國家重大財政專項“藏醫(yī)心腦血管病臨床研究與藥物研發(fā)”（編號：1981020421）

甄麗芳（1987.2—），女，研究生，研究方向：中西醫(yī)結合腦病，E-mail：530539114＠qq.com

黃福開（1958.2—），男，研究生，副主任醫(yī)師，院長，研究生導師，研究方向：中西醫(yī)結合心腦血管?。籈-mail：530539114＠qq.com