肉制品中瘦肉精的檢測方法

羅宿星，黃麗娟，伍遠輝

（遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州遵義563002）

肉制品中瘦肉精的檢測方法

羅宿星，黃麗娟，伍遠輝

（遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，貴州遵義563002）

瘦肉精是一類能夠促進瘦肉生長、抑制肥肉生長的動物用藥。不法分子為了促進家畜生長和提高瘦肉率將瘦肉精添加于飼料中，食用了含瘦肉精的動物組織會產(chǎn)生嚴重的毒副作用。作者綜述了瘦肉精的危害以及肉制品中瘦肉精檢測方法研究的進展，并對各種檢測方法的優(yōu)缺點進行總結(jié)。

瘦肉精；檢測方法；研究進展

1 “瘦肉精”的危害

“瘦肉精”是一類具有腎上腺素受體激動作用的藥物統(tǒng)稱，能促進瘦肉快速生長、降低脂肪率。國務(wù)院規(guī)定屬于“瘦肉精”的有：鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、鹽酸多巴胺、沙丁胺醇、硫酸特布他林、班布特羅、硫酸沙丁胺醇、苯乙醇胺A、馬布特羅、鹽酸氯丙那林、西馬特羅、西布特羅、鹽酸齊帕特羅、酒石酸阿福特羅、溴布特羅、富馬酸福莫特羅。在我國，通常說的瘦肉精是指鹽酸克倫特羅(簡稱CLB)，是 -腎上腺素能受體的興奮劑之一，也叫雙氯醇胺，是苯乙醇胺類衍生物，分子式為C12H19Cl3N2O，化學(xué)名-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇鹽酸鹽[1]。

瘦肉精具有很好的平喘效果，可作為支氣管舒張劑，治療支氣管哮喘病。瘦肉精在動物體內(nèi)吸收快，存在周期長，難消除，主要分布在視網(wǎng)膜、內(nèi)臟及肌肉中，視網(wǎng)膜中殘留量最大，其次是肝臟中，肌肉中相對較少。

20世紀80年代初，國外研究發(fā)現(xiàn)“瘦肉精”能明顯減少脂肪率、提高瘦肉率，畜禽瘦肉率能增加10%左右，同時還能促進生長。因此，“瘦肉精”在畜禽生產(chǎn)中被作為“促生長劑”、“營養(yǎng)重分配劑”得到廣泛運用。其后，發(fā)現(xiàn)食用殘留“瘦肉精”的動物肝臟會使人中毒，許多國家開始禁止使用“瘦肉精”作為畜禽飼料添加劑。盡管我國早在1997年就已明令禁止在飼料中添加“瘦肉精”，但一些不法分子為了牟取暴利，對國家的法律[2-5]置若罔聞，損害了人民的身體健康。

動物開始入食“瘦肉精”時會出現(xiàn)呼吸加劇、體溫升高、內(nèi)臟負擔加重、食量下降、身體平衡失調(diào)等一系列癥狀?！笆萑饩边M入人體，一方面它能促進體內(nèi)脂肪分解，使大量游離脂肪酸進入血液，使血管壁彈性變?nèi)?，血壓升高，血管發(fā)生膨脹，壓迫周圍的神經(jīng)末梢；另一方面它能降低Mg2+濃度，導(dǎo)致肌肉過度興奮，發(fā)生震顫，同時它還可以改變K+、Ca2+、Na+的濃度。綜上，瘦肉精雖然有藥理作用，但對人體危害也極大，因此，加強對肉制品中瘦肉精的檢測工作顯得十分重要。

2 “瘦肉精”的檢測方法

2.1 高效液相色譜法

Fredy Morales-Trejo[6]采用高效液相色譜法（HPLC）對牛肝臟中的鹽酸克倫特羅進行測定，檢出限為0.42ng/g，相對偏差＜4.74%，該法快速、準確、重復(fù)性高，可操作性強，可用于動物肝臟中克倫特羅殘留的測定。Pilar Gonzalez Gigosos[7]采用高效液相色譜法對動物視網(wǎng)膜中的鹽酸克倫特羅進行了檢測，檢出限為0.5ng/g，該法準確、快速。宗萬里[8]等采用高效液相色譜法對火腿腸中的鹽酸克倫特羅進行測定，此法與國標法中的液相法對比[9]在實驗準確度得以保證的前提下，無需太多的有機溶劑，同時還簡化了樣品的前處理方法，很大程度上節(jié)省了檢測的成本和時間，適用于大批量檢測。何佳璐[10]用高效液相色譜法對豬肉中的鹽酸克倫特羅進行了測定，首先用正己烷進行除脂，減少油脂對實驗產(chǎn)生的干擾，提取后在用紫外檢測器檢測前用C18小柱分離富集樣品，得出實驗結(jié)果，該方法的檢測線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999，相對標準偏差3.1%～4.0%，回收率87.5%～95.3%，實驗重現(xiàn)性好，操作簡單，結(jié)果可靠。康莉等[11]用固相萃取-高效液相色譜法測定肉類樣品中的鹽酸克倫特羅，檢出限為1.7ng（3倍噪聲值），回收率81.0%～91.4%，該方法簡便高效，靈敏度高，試劑用量少，適于日常檢測工作。龐坤等[12]用外標法來定量，用配有熒光檢測器的高效液相色譜儀測定，鹽酸克倫特羅檢出限為0.5g/g，回收率為85.15%～93.25%，相對標準偏差2.81%～3.16%，實驗重現(xiàn)性、再現(xiàn)性、選擇性、特異性都很好，是一種行之有效的方法。劉志梅[13]等用中空纖維液相微萃取技術(shù)聯(lián)合液相色譜技術(shù)，對液相萃取的試驗影響條件進行優(yōu)化，選擇7cm的聚丙烯中空纖維，樣品溶液pH=11，室溫，磁力攪拌速度為1000r/min的條件下萃取20min后，讓有機溶劑在氮氣流環(huán)境中吹干，用15L甲醇來溶解，取樣10L做色譜分析，用此法測定豬肉組織中的鹽酸克倫特羅，低、中、高三種濃度的回收率對應(yīng)是84.9%、91.4%和95.0%，相對標準偏差對應(yīng)是6.3%、5.8%和4.6%，該實驗靈敏度高、對環(huán)境友好、操作簡便，適于檢測豬肉中鹽酸克倫特羅的殘留量。

2.2 氣相色譜法

Limin He等[14]采用GC-MS同時測定動物組織中的萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅，檢出限分別為4ug/kg和2ug/kg。吳銀良等[15]用有機混合溶劑來提取動物肝組織樣品，條件是堿性環(huán)境，提取液先濃縮，然后用乙酸乙酯溶解，再用稀HCl反萃取，達到除去脂肪的目的，調(diào)節(jié)pH值之后用SCX固相萃取柱來凈化，洗脫液先用氮氣吹干，再用雙三甲基硅基三氟乙酰氨衍生，采用外標法來定量，選擇離子模式進行測定。鹽酸克倫特羅的檢出限是0.30g/kg，添加濃度1.0～5.0ng/kg，回收率77.4%～88.3%，相對標準偏差3.1%～5.1%，衍生物的峰面積與被測物的濃度在0.003～1.00 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸系數(shù)大于0.999。朱永林等[16]用HCl溶液和乙酸乙酯提取豬肝后，分別用SCX固相萃取柱、BSTFA凈化、衍生化、定容，用氣相色譜-質(zhì)譜外標法來測定鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺，該法靈敏度非常高、干擾不多、簡便可靠，可用于豬肝中鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺殘留的同時測定。王立君等[17]利用乙腈、稀鹽酸進行提取，乙酸乙酯去脂，用雙三甲基硅基三氟乙酰氨來進行衍生化，PCX固相萃取凈化相結(jié)合處理，建立了飼料中三聚氰胺、鹽酸克倫特羅同時測定的氣相色譜-質(zhì)譜分析法，被測物質(zhì)的回收率70.8%～92.0%，批內(nèi)RSD2.6%～5.2%，批間RSD3.8%～7.0%，檢出限為0.6g/kg(三聚氰胺)、2.4g/kg（鹽酸克倫特羅）。此該方法的特點是準確、快速、靈敏，能同時痕量分析飼料中這兩種物質(zhì)。

2.3 膠體金免疫法

羅奕銘[18]研究出一種聯(lián)檢速測卡，能檢測萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，膠體金顆粒的制備使用檸檬酸鈉還原法，標記單克隆抗體萊克多巴胺和鹽酸克洛特倫，并噴在玻璃纖上，萊克多巴胺、鹽酸克倫特羅偶聯(lián)羊抗鼠IgG和OVA抗原分別結(jié)合在硝酸纖維膜上，將膠體金墊、樣品墊、吸水紙、硝酸纖維素膜依次組裝切割成為萊克多巴胺與鹽酸克倫特羅聯(lián)檢速測卡，試驗結(jié)果表明，靈敏度分別為5ng/mL（萊克多巴胺）、3ng/mL（鹽酸克倫特羅），檢測時間在3min內(nèi)便可完成，批間和批內(nèi)重復(fù)性均是百分之百，假陰性率和假陽性率都為零，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，實現(xiàn)了一個樣本同時檢測兩種類似的激素，降低了檢測時間和檢測成本，比單檢技術(shù)更具優(yōu)勢，方法既簡捷又可靠，是一種值得推廣的定性篩選方法，可作為液相色譜等儀器法的補充，同時也作為鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺快速檢測的利器，在我國家禽生產(chǎn)場、動物性食品加工廠、國家和地方的檢驗/監(jiān)督部門等行業(yè)領(lǐng)域推廣應(yīng)用。姜艷彬等[19]以膠體金標記鹽酸克倫特羅單克隆抗體競爭性膜層析技術(shù)制成了豬尿液中鹽酸克倫特羅殘留檢測的快速檢測試紙，它能快速、簡便地檢測出豬尿中的鹽酸克倫特羅，如待測尿樣中無鹽酸克倫特羅，金標抗體便能與固相載體結(jié)合，形成紅色帶，如待測尿樣中含鹽酸克倫特羅，它與金標抗體一樣可以和固相載體結(jié)合，占去了金標抗體和固相載體結(jié)合的可能性，導(dǎo)致金標抗體和固相載體結(jié)合量大大減少，形成不了紅色帶；經(jīng)試驗制成了可檢測出豬尿樣中鹽酸克倫特羅濃度為2ng/mL的試紙條，可在8min內(nèi)完成測試，肉眼便可判斷，試紙條使用不需任何的儀器設(shè)備，能在現(xiàn)場快速檢測和篩選，靈敏度滿足臨床使用要求。許春光等[20]對ELISA法與膠體金檢測法進行比較，采用了免疫層析分析技術(shù)和高度特異性的抗體抗原反應(yīng)，檢測靈敏度5ng/mL，膠體金法檢測時間短、簡便、觀察直觀，無需特殊的實驗條件、儀器設(shè)備，其敏感性、特異性都達到了ELISA水平，可作為生豬中轉(zhuǎn)站、飼養(yǎng)場、屠宰場篩查鹽酸克倫特羅的重要手段，采用快速檢測試紙條不僅可以對宰前樣品，還可以對宰后樣品進行鹽酸克倫特羅快速現(xiàn)場檢測，為食品安全檢測提供新思路和新模式，具有重要意義。張慧嫦等[21]采用免疫競爭法，以顏色顯示檢測結(jié)果，檢測試樣為豬肉時，靈敏度可達0.5ng/ml，3～5min即可完成，與萊克多巴胺、沙丁胺醇的交叉反應(yīng)率為0.86%，用該法檢測鹽酸克倫特羅具有很好的發(fā)展空間，有特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點。

2.4 放射免疫分析法

此方法的基本原理是：用需測定的非標記抗原（CLB-Ag）和放射性標記抗原（*CLB-Ag）對其特異抗體（CLB-Ab）進行競爭性反應(yīng)，當僅有標記抗原（*CLB-Ag-Ab）與特異性抗體（CLB-Ab）存在時，只會產(chǎn)生一種結(jié)合物（*CLB-Ag-Ab），競爭性反應(yīng)是可逆的，結(jié)合反應(yīng)和解離反應(yīng)同時進行，達到平衡時，有*CLB-Ag-Ab和CLB-Ag-Ab兩種結(jié)合物產(chǎn)生，結(jié)合物總量保持不變，由標準曲線算出CLB-Ab的含量[22]。目前已生產(chǎn)出測定鹽酸克倫特羅的試劑盒產(chǎn)品，還建立了類似放射免疫分析法的放射受體分析法，這種方法是用受體代替抗體結(jié)合鹽酸克倫特羅，檢測限可達到 2.4 ng/g[23]。此法的顯著特點是操作簡單、易標準化，且快速、特異性強、準確，但價格昂貴，存在放射性的廢棄物，所以實際應(yīng)用比較少[24]。

2.5 酶聯(lián)免疫法

ELISA法檢測“瘦肉精”是目前國內(nèi)普遍使用的檢測方法之一。其原理是利用抗原抗體反應(yīng)[25]：加入特定的“瘦肉精”抗體之后，它會與捕獲抗體結(jié)合，如果樣品中有 -興奮劑，將與特定“瘦肉精”的酶連接物相互競爭捕獲抗體的連接位點，在洗板過程中，沒有連接的酶連接物會被除去，加入標準品、樣品溶液、酶連接物之后，經(jīng)過孵育、洗板，將底物（發(fā)色劑）轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色的產(chǎn)物，加入終止液后，顏色從藍色變?yōu)辄S色。顯示的顏色越淺，“瘦肉精”含量越高，測量在450nm處進行，樣品中 -興奮劑的濃度與吸光度成反比。陳存社等[26]將鹽酸克倫特羅重氮化后分別連接到卵清蛋白（OVA）和牛血清蛋白（BSA）上制得包被抗原OVA-CL和免疫原BSA-CL；通過免疫兔得到含有多克隆抗體血清，用硫酸銨沉淀、純化，得到兔源抗CLB抗體，用間接酶聯(lián)免疫檢測法，得出實驗結(jié)果，羊抗兔酶聯(lián)抗體的最適稀釋度和抗CL抗體的最適稀釋度是1：1500、1：1000，線性檢測范圍7.26～90.75g/L，檢測靈敏度1.45g/L。鄭海松等[27]用 ELISA法對出口肉制品中的鹽酸克倫特羅進行測定分析，實驗結(jié)果顯示，鹽酸克倫特羅交叉反應(yīng)是100%，豬肉罐頭、牛肉中的檢測限分別為0.026g/kg、0.028g/kg，樣品平均回收率83.6%～91.3%，相對標準偏差3.5%～5.6%，經(jīng)HPLC確證假陽性率≤2.0%。國內(nèi)外開發(fā)了許多基于ELISA法檢測“瘦肉精”的試劑盒，與HPLC相比，具有敏感、快速、經(jīng)濟的特點，但是重現(xiàn)性和特異性比HPLC要差，適用于大批量樣品的快速初篩，不適于定量分析。

2.6 綜合化學(xué)法根據(jù)“瘦肉精”的化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進行綜合鑒別主要是參照國家藥典標準方法。由于“瘦肉精”溶于水、乙醇，可以用水對其進行提取。“瘦肉精”可以顯示芳香第一胺類、氯化物的鑒別反應(yīng)，用分光光度計檢測，最大吸收波長244～295nm。綜合分析能定性確定肉制品中是否存在“瘦肉精”類物質(zhì)，它不需要昂貴的試劑、儀器，操作簡單，沒有復(fù)雜處理過程，

是基層動物檢疫工作者初查“瘦肉精”類物質(zhì)殘留的有效方法，但靈敏度和最低檢測限不是很理想[28]。

2.7 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析法主要包括微分脈沖伏安法和生物傳感分析法。生物傳感分析法起步較晚，但該法操作簡單、成本小。CanWu等[29]制備了氧化石墨烯修飾電極，對豬肉中的萊克多巴胺和鹽酸克倫特羅進行了測定，檢出限分別為17ug/L和15ug/L。Lijing Liu等[30]制備了nafion-金膠修飾電極，對人體血漿中的鹽酸克倫特羅進行了檢測，檢出限為1.0×107mol/L。ChangZhao[31]，BuiTheHuy[32]等分別制備了分子印跡膜電極 MIP-CNSQ/WGE和 MIP-CdTe QDs，分別對豬肉和牛奶樣品中的鹽酸克倫特羅進行了測定，檢出限為0.01 uM和0.4 uM，該法重現(xiàn)性好，檢測靈敏。

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（責(zé)任編輯：朱彬）

Detection Method of Clenbuterol in Meat Products

LUO Su-xing,HUANG Li-juan,WU Yuan-hui
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Zunyi Normal University,Zunyi 563002)

Clenbuterol is a kind of animal drugs which can promote lean growth and inhibit fat growth.Criminals added clenbuterol to forage in order to promote animal growth and improve the lean percentage.When people eat the animal tissue containing these drugs, serious side effects can occured.In this paper the research progress in detection method about clenbuterol in meat products are reviewed, and the advantages and disadvantages of various detection methods are summarized.

clenbuterol;detection method;research progress

TS207.3

A

1009-3583（2014）-0074-04

2014-09-15

貴州省高校優(yōu)秀科技創(chuàng)新人才支持計劃資助項目（黔教合KY[2012]103號）；遵義市科技局基金資助項目（遵市科合社字（2011）1號）

羅宿星，女，四川眉山人，遵義師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院教授，碩士，主要從事環(huán)境化學(xué)研究。