人脂肪來源干細(xì)胞與膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)-絲素蛋白雙層支架的生物相容性研究

趙 陽 吳稼晟 周 哲 周 娟 張明 李 偉 王 忠 孫康 盧慕峻

人脂肪來源干細(xì)胞與膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)-絲素蛋白雙層支架的生物相容性研究

趙 陽 吳稼晟 周 哲 周 娟 張明 李 偉 王 忠 孫康 盧慕峻

目的觀察人脂肪來源干細(xì)胞（Human adipose derived stem cells，hASCs）在膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)-絲素蛋白（Bladder acellular matrix graft-silk fibroin，BAMG-SF）雙層支架材料中的生長情況，分析其生物相容性。方法取hASCs，置于BAMG-SF浸提液中培養(yǎng)，CCK-8法檢測其細(xì)胞活力，評價BAMG-SF支架的細(xì)胞毒性并繪制生長曲線。掃描電鏡觀察BAMG-SF雙層支架材料的表面形貌。將hASCs傳代擴(kuò)增后接種到BAMG-SF雙層支架材料上，體外培養(yǎng)1周后，轉(zhuǎn)至裸鼠皮下培養(yǎng)1周、2周，HE染色觀察細(xì)胞在支架上的生長情況。HLA免疫熒光鑒定裸鼠皮下雙層支架上細(xì)胞的種屬來源。結(jié)果hASCs在BAMG-SF雙層支架浸提液中可保持較高的增殖率，根據(jù)細(xì)胞相對增殖率與細(xì)胞毒性分級關(guān)系證實BAMG-SF雙層支架浸提液無細(xì)胞毒性。由hASCs在BAMG-SF浸提液和DMEM培養(yǎng)基中的生長曲線可知，BAMG-SF有利于hASCs的生長。將hASCs接種到BAMG-SF雙層支架材料上，經(jīng)過體外、內(nèi)培養(yǎng)，hASCs均能長入支架的空隙內(nèi)，且體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的hASCs細(xì)胞長入支架。HLA檢測顯示支架內(nèi)細(xì)胞部分為hASCs。結(jié)論新型BAMG-SF雙層支架材料安全無毒，與hASCs生物相容性好，可作為細(xì)胞載體應(yīng)用于組織工程膀胱的研究。

人脂肪來源干細(xì)胞膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)絲素蛋白雙層支架材料組織工程

膀胱大面積缺損的修復(fù)一直是臨床面臨的難題。利用胃腸道替代膀胱是目前最常用的方法，但存在著慢性尿路感染、結(jié)石、穿孔、尿瘺、電解質(zhì)紊亂，以及繼發(fā)腫瘤等諸多并發(fā)癥。組織工程技術(shù)為膀胱修復(fù)與重建開辟了一條嶄新的途徑，利用組織工程技術(shù)修復(fù)大面積膀胱缺損已成為新的研究熱點[1-3]。人脂肪來源干細(xì)胞（Human adipose derived stem cells，hASCs）來源豐富，取材方便，具有多向分化潛能，可作為種子細(xì)胞進(jìn)行膀胱修復(fù)，研究潛能巨大[4-5]。膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)（Bladder acellular matrix graft，BAMG）是將同種或異種膀胱組織去除細(xì)胞，抗原等成分，僅保留細(xì)胞外基質(zhì)成分，因來源于膀胱組織，與人膀胱組織結(jié)構(gòu)最接近，生物相容好，具有修復(fù)膀胱組織的獨特優(yōu)勢，是較為理想的天然生物支架[6-8]。絲素蛋白（Silk fibroin，SF）由蠶繭繅絲脫膠得到，來源豐富，是一種無生理活性的天然結(jié)構(gòu)性蛋白[9]。絲素蛋白有良好的生物相容性，無毒，無刺激性，可部分生物降解，其降解產(chǎn)物對組織無毒副作用，絲素本身具有良好的機(jī)械性能和理化性質(zhì)，如良好的柔韌性和抗拉伸強(qiáng)度、透氣透濕性、緩釋性等，而且經(jīng)過不同處理可以得到不同的形態(tài)，如纖維、溶液、粉、膜以及凝膠等[10-11]。

本實驗將hASCs置于BAMG-SF浸提液中培養(yǎng)，檢測BAMG-SF的細(xì)胞毒性，并將hASCs種植于BAMG-SF支架上，進(jìn)行體外、體內(nèi)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況，探討B(tài)AMG-SF作為hASCs的支架材料用于組織工程膀胱缺損修復(fù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

hASCs取自我院整復(fù)外科抽脂術(shù)后廢棄的人脂肪組織（獲患者知情同意）。BAMG由豬膀胱經(jīng)實驗室處理后獲得，BAMG+SF由上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院制作并提供。兔抗人HLA抗體（Abcam公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 hASCs的分離培養(yǎng)

將獲取的人脂肪組織用PBS沖洗3遍，洗去其中的血液和腫脹液。加入等體積的0.1%膠原酶Ⅳ，37℃恒溫振蕩消化1 h，1 500 r/min離心5 min，去除懸浮的脂肪和上清液。加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸。置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。48 h后首次更換培養(yǎng)液，以后每3天換液1次。待細(xì)胞生長融合達(dá)80%～90%后，0.25%胰酶-EDTA消化，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 BAMG-SF雙層支架的制備及掃描電鏡觀察

將制備的BAMG剪成15 mm×15 mm的小塊，去離子水洗滌10余遍后，均勻鋪在模具底部，將350 μL絲素蛋白滴在BAMG上，凍干后得到BAMG-SF雙層支架，支架孔徑約100 μm，孔間連通性較好。將材料制備成10 mm×10 mm的補(bǔ)片，乙醇消毒備用。將上述方法制備得到的BAMG-SF雙層支架噴金鍍膜，在液氮中脆斷，噴金處理后，掃描電鏡觀察。

1.2.3 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養(yǎng)基中增殖率的測定

BAMG-SF支架用75%乙醇浸泡過夜，PBS洗去殘留乙醇，并加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中24 h，收集浸提液，備用。將第3代hASCs接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后，吸出培養(yǎng)基，分別添加100 μL低糖DMEM完全培養(yǎng)基（對照組）和100 μL BAMG-SF浸提液（實驗組），繼續(xù)培養(yǎng)。于第1、3、5天，每組各取6個孔。每孔加入10 μL CCK-8溶液，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。然后酶標(biāo)儀測定450 nm波長時的A值，計算相對增殖率，并據(jù)此進(jìn)行毒性分級。

1.2.4 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養(yǎng)基中細(xì)胞生長曲線的測定

將第2代的hASCs接種在10 cm×10 cm的培養(yǎng)皿中，每皿約5×105個細(xì)胞。培養(yǎng)皿分為兩組：對照組加DMEM培養(yǎng)基，實驗組加BAMG-SF支架材料浸提液，放入培養(yǎng)箱中，在第1、2、3、4天時，將細(xì)胞消化，計算細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞生長曲線圖。

1.2.5 hASCs種植于BAMG-SF支架

將消毒后備用的BAMG-SF支架用PBS沖洗后，加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)過夜。將上清及材料表面的培養(yǎng)基吸凈，選取生長較好的第3代hASCs，制成密度為2×107cells/mL的細(xì)胞懸液。每個材料表面均勻滴加50 μL細(xì)胞懸液，靜置2 h后沿培養(yǎng)皿邊緣緩慢加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用于體內(nèi)試驗的細(xì)胞-材料復(fù)合物，在體外培養(yǎng)2 d后植入裸鼠皮下。用于體外實驗的支架，仍繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液一次。

1.2.6 組織學(xué)觀察

體外培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物于培養(yǎng)1周后取材，體內(nèi)培養(yǎng)的支架材料在1周、2周后分別取材。4%多聚甲醛固定4 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片（4 μm厚），HE染色，光鏡下觀察細(xì)胞在支架內(nèi)的生長情況。

1.2.7 體內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物免疫熒光檢測

體內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物于2周后取材，冰凍切片。將切片浸水10 h，洗去OCT，檸檬酸微波法修復(fù)抗原，自然冷卻，用0.3%的Triton破膜15 min，滴加羊血清封閉非特異性抗原，一抗為兔抗人HLA抗體，4℃過夜，二抗為帶有紅色熒光標(biāo)記的羊抗兔抗體，DAPI染細(xì)胞核，熒光封片劑封片，避光保存。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS l7.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示。實驗組與對照組各時間點A值的比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hASCs的形態(tài)和生長特性

原代細(xì)胞培養(yǎng)6～8 h后，有部分成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞貼壁。貼壁細(xì)胞呈梭形，其間可見少量三角形、多邊形細(xì)胞（圖1A）。隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞形態(tài)為典型的梭形。培養(yǎng)4～6 d，細(xì)胞可達(dá)80%～90%融合，7～8 d可形成100%融合的致密單層。傳代后的細(xì)胞形態(tài)主要為梭形，少數(shù)為三角形或多邊形（圖1B）。我們前期實驗中的流式細(xì)胞鑒定顯示，CD29表達(dá)為99.77%，CD44表達(dá)為97.1%，CD73表達(dá)為96.54%，CD105表達(dá)為93.06%，CD45表達(dá)為0.37%，CD34表達(dá)為1.38%[12]。結(jié)果證實得到的是hASCs。

圖1 hASCs形態(tài)學(xué)觀察（40×）Fig.1 Histological observation of hASCs(40×)

2.2 支架材料的制備

制備的BAMG-SF雙層支架外觀呈白色，掃描電鏡觀察孔徑為100 μm左右。橫截面顯示，上面是SF，下面是BAMG（圖2）。

圖2 BAMG-SF支架材料大體觀及掃描電鏡觀察Fig.2 Gross and SEM observation of BAMG-SF

2.3 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養(yǎng)基中增殖率和生長曲線的測定

在第1、3、5天，BAMG-SF浸提液（實驗組）中hASCs的增殖是DMEM完全培養(yǎng)基（對照組）的98.8%、104.2%和111.1%，平均相對增殖率是104.7%，實驗組與對照組無顯著差異（P＞0.05），說明BAMG-SF浸提液對hASCs增殖無明顯影響。兩組的生長曲線無顯著差異（圖3）。依據(jù)細(xì)胞相對增殖率與細(xì)胞毒性分級關(guān)系，浸提液在第1、3、5天的細(xì)胞毒性分別是I級、0級和0級，說明BAMG-SF浸提液無細(xì)胞毒性。

圖3 hASCs在BAMG-SF支架浸提液與DMEM培養(yǎng)基中的生長曲線測定Fig.3 The growth curves of hASCs cultured in theleaching solution of the BAMG-SF and DMEM

2.4 細(xì)胞在支架上的生長情況

如圖4所示，hASCs種植到BAMG-SF雙層材料后，經(jīng)過體內(nèi)外培養(yǎng)，hASCs均能夠長入支架材料的空隙內(nèi)。細(xì)胞-材料復(fù)合物體外培養(yǎng)1周，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附在材料邊緣生長，少量細(xì)胞滲透入支架材料內(nèi)部淺層；體內(nèi)培養(yǎng)1周后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞黏附在材料表面，部分在淺層，少量在材料內(nèi)部；體內(nèi)培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞滲透進(jìn)入材料內(nèi)部。同時，利用免疫熒光檢測HLA發(fā)現(xiàn)，支架內(nèi)細(xì)胞部分陽性染色，說明進(jìn)入支架內(nèi)部的細(xì)胞一部分是hASCs，一部分是裸鼠自體細(xì)胞。

圖4 hASCs復(fù)合BAMG-SF雙層支架組織學(xué)檢測及免疫熒光檢測（200×）Fig.4 Morphological observation and immunofluorescence observation of BAMG-SF bilayer scaffold combined with hASCs(200×)

3 討論

全球約有4億患者罹患膀胱疾病，僅美國每年就有約5萬例患者被診斷為膀胱癌[13]。特別是浸潤性膀胱癌，需要進(jìn)行全膀胱切除，卻缺乏有效的修復(fù)手段，常用胃腸道代膀胱進(jìn)行修復(fù)，不僅存在多種并發(fā)癥，還會造成供區(qū)嚴(yán)重?fù)p傷。近年來，組織工程的發(fā)展為膀胱重建帶來了希望。

理想的膀胱修復(fù)材料應(yīng)具有以下性能：良好的生物相容性，可靠的機(jī)械性能，能抵抗腹膜內(nèi)及腹膜外感染，不影響正常腎功能，具有良好的收縮能力，并通過神經(jīng)和膀胱平滑肌再生后具有自主排尿功能等[14-16]。BAMG來源于膀胱組織，與人膀胱組織結(jié)構(gòu)最接近，生物相容較好，具有膀胱組織修復(fù)的獨特優(yōu)勢，是一種較為理想的天然生物支架。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，尿路上皮細(xì)胞、膀胱平滑肌細(xì)胞與BAMG體外構(gòu)建，能夠形成類似正常膀胱壁的組織結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)材料降解與組織器官再生同步化，顯示出人工合成支架材料無可比擬的優(yōu)勢。但天然BAMG由于孔隙率低，不利于細(xì)胞的滲透和厚層組織的再生[17-18]。絲素蛋白（SF）是近年來修復(fù)膀胱缺損的常用合成材料之一，其細(xì)胞生物相容性好，并具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，多孔結(jié)構(gòu)也較適合細(xì)胞和組織的長入，本身無毒，降解產(chǎn)物也無生物毒副作用，尤其是其直接修補(bǔ)豬膀胱大范圍缺損的成功，展現(xiàn)了Silk作為膀胱擴(kuò)大修補(bǔ)材料的巨大應(yīng)用潛能，但單純致密的SF卻存在不易降解等缺點[19-20]。

因此，我們將多孔SF和BAMG復(fù)合，形成BAMG-SF雙層復(fù)合材料。其中，BAMG具有良好的生物相容性，起到較好的防水性能，而多孔SF主要為平滑肌細(xì)胞提供了生長黏附的空間，有利于平滑肌的快速長入，彌補(bǔ)了單純BAMG修補(bǔ)膀胱時因相對致密，平滑肌細(xì)胞不易長入，膀胱容量過大，易使膀胱壁擴(kuò)張變薄，憩室形成等缺點，又解決了致密SF不易降解的問題。所以，本實驗選用BAMG-SF作為支架研究對象。

本實驗中，cck-8實驗結(jié)果和生長曲線都顯示各時間點實驗組和對照組無顯著差異（P＞0.05），說明BAMG-SF浸提液不存在明顯的細(xì)胞毒性。hASCs種植于BAMG-SF支架后，經(jīng)體外、體內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞均能長入BAMG-SF支架的孔隙內(nèi)，說明BAMG-SF支架具有良好的細(xì)胞親和性。

實驗發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的細(xì)胞長入支架，可能是由于體內(nèi)環(huán)境為細(xì)胞生長提供了豐富的血供和營養(yǎng)。體外培養(yǎng)1周時，有少量細(xì)胞黏附生長在BAMG-SF支架的邊緣，可能由于細(xì)胞與材料黏附不牢，經(jīng)過石蠟包埋處理的復(fù)雜過程，部分脫落；體內(nèi)培養(yǎng)1周，細(xì)胞黏附生長在BAMG-SF支架的邊緣，且已有部分滲透到材料內(nèi)部，體內(nèi)培養(yǎng)2周后，大量細(xì)胞能滲透到材料內(nèi)部，同時細(xì)胞周圍可見大量細(xì)胞外基質(zhì)。HLA-I免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，支架材料內(nèi)部分細(xì)胞陽性表達(dá)，說明BAMG-SF支架內(nèi)的細(xì)胞來源于人，即hASCs。

綜上，BAMG-SF復(fù)合材料適合hASCs的黏附、生長和增殖。BAMG-SF可以作為理想的支架材料，進(jìn)一步用于組織工程膀胱修復(fù)的研究。

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Human Adipose-Derived Stem Cells and its Biocompatibility with Bladder Acellular Matrix Graft-Silk Fibroin Bilayer Scaffold

ZHAO Yang1,WU Jiasheng2,ZHOU Zhe1,ZHOU Juan1,ZHANG Ming1,LI Wei2,WANG Zhong1,SUN Kang2,LU Mujun1.

1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Shanghai Jiaotong University School of Materials Science and Engineering,Shanghai 200240,China.Corresponding author:LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

ObjectiveTo observe the growth of human adipose-derived stem cells(hASCs)in bladder acellular matrix graft-silk fibroin(BAMG-SF)bilayer scaffold and to analyze the biological compatibility of BAMG-SF with hASCs.Methods hASCs were isolated from human subcutaneous adipose tissue after collagenase digesting,filtrating and centrifuging,then cultured in the leaching solution of BAMG-SF.The cytotoxicity of scaffold was evaluated by CCK-8 cell viability assay,and the growth curves were also observed.Surface morphology on BAMG-SF was observed by scanning electron microscopy (SEM).The hASCs of passage 3 were seeded onto the BAMG-SF bilayer scaffolds for 1 week,then the BAMG-SF bilayer scaffolds seeded with hASCs were transplanted into nude mouse for 1 week or 2 weeks.The growth of cells in BAMG-SF biomaterials was observed by HE staining.The species origin of these cells in the BAMG-SF scaffolds cultured in vivo was detected by Immunofluorescence.ResultshASCs maintained high proliferation rate in the leaching solution of BAMG-SF and the BAMG-SF scaffolds were nontoxic absolutely.According to the growth curves of hASCs cultured in the leaching solution of the BAMG-SF and DMEM,BAMG-SF scaffolds were conducive to the growth of hASCs.The histological study found that hASCs could grow into the space of the BAMG-SF scaffolds after cultured in vitro and in vivo.There were more cells in the scaffolds cultured in vivo than in vitro.Immuno-fluorescence suggested that some of the cells inside the scaffoldswere hASCs.ConclusionBAMG-SF bilayer scaffolds are nontoxic and have a good biocompatibility with hASCs,which can be used as a vehicle for hASCs in bladder defect reconstruction.

Human adipose-derived stem cells;Bladder acellular matrix graft;Silk fibroin;Bilayer scaffold; Tissue engineering

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）06－0309－05

2014年8月21日；

2014年10月9日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.003

國家自然科學(xué)基金項目（81070605，81370860）；上海交通大學(xué)“醫(yī)工(理)交叉研究基金”（YG2011MS14）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科（趙陽，周哲，周娟，張明，王忠，盧慕峻）；200240上海市上海交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院（吳稼晟，李偉，孫康）。

盧慕峻（E-mail：lumujun@163.com）。