瑤藥天鉆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

張亞洲，樊蘭蘭，覃山丁，李典鵬（.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園天然藥物化學(xué)中心，南寧 530023；2.廣西壯族自治區(qū)/中國科學(xué)院桂林植物研究所，廣西桂林 54006）

瑤藥天鉆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

張亞洲1，2＊，樊蘭蘭1，覃山丁1，李典鵬2#（1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園天然藥物化學(xué)中心，南寧 530023；2.廣西壯族自治區(qū)/中國科學(xué)院桂林植物研究所，廣西桂林 541006）

目的：建立瑤藥天鉆藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：分別對(duì)天鉆藥材進(jìn)行顯微鑒別和薄層色譜（TLC）鑒別；按照《中國藥典》方法進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物檢查；采用高效液相色譜法測(cè)定藥材中馬兜鈴酸的含量：色譜柱為Phenomenex Gem iniC18（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈-水（含0.34%三乙胺、0.94%乙酸，梯度洗脫），檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果：天鉆藥材的顯微特征明顯；TLC圖中能清晰顯現(xiàn)與馬兜鈴酸A對(duì)應(yīng)的點(diǎn)；馬兜鈴酸A的質(zhì)量濃度在1.703～109.000μg/m l范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.999 9），平均加樣回收率分別為97.54%、101.16%、101.15%，RSD分別為0.22%、0.63%、0.39%（n＝3）。結(jié)論：所建標(biāo)準(zhǔn)可用于天鉆藥材的質(zhì)量控制。產(chǎn)自廣西、云南的11批天鉆藥材在顯微、外觀等方面質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，但馬兜鈴酸A的含量差異較大。

天鉆；馬兜鈴酸A；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；瑤藥

＊助理研究員，博士。研究方向：天然藥物的活性成分和代謝。E-mail：yazhou_zhang2009@163.com

#通信作者：研究員，碩士研究生導(dǎo)師，博士。研究方向：藥物資源功能物質(zhì)開發(fā)。E-mail：ldp@gxib.cn

瑤藥天鉆是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物廣西馬兜鈴Aristolochia kwangsiensisChun etHow ex C.F.Liang的塊根[1]，別名金銀袋、大總管、蘿卜防己、大青木香，原植物主要分布于浙江、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地的山谷林中[1-3]。文獻(xiàn)研究顯示，從天鉆中分離出了尿囊素、馬兜鈴酸、β-谷甾醇、6-甲氧基去硝基馬兜鈴酸甲酯、6-甲氧基馬兜鈴酸A甲酯及木蘭花堿[2-3]。藥理研究發(fā)現(xiàn)：（1）其總生物堿具有解痙、鎮(zhèn)痛作用[3-4]；（2）馬兜鈴酸主要有抗腫瘤、致突變與腎臟毒性作用[2-5]；（3）天鉆提取物對(duì)臨床各種疾患所致平滑肌痙攣性腹痛的止痛效果較好[6]。目前，天鉆常作為抗腫瘤、止痛藥物使用，但是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未見研究報(bào)道。鑒于此，筆者對(duì)天鉆藥材中可引起腎毒性的成分馬兜鈴酸A的薄層色譜（TLC）鑒別方法和高效液相色譜（HPLC）含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究，制定了其含量限度，并完成了其他檢查項(xiàng)目，以期科學(xué)、有效地控制藥材質(zhì)量，保證其臨床療效和安全性。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，含紫外檢測(cè)器等（美國Agilent公司）；HD-1024A型超聲儀（寧波市恒大超聲設(shè)備有限公司，功率：1 200 W，頻率：25～28 kHz）。

1.2 試劑

馬兜鈴酸A對(duì)照品（筆者自制，經(jīng)HPLC法測(cè)定純度＞98%）；硅膠G（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

天鉆藥材共11批（樣品信息見表1），均經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院方鼎研究員鑒定其來源為廣西馬兜鈴。完成樣品收集后，將所有11批樣品（約100 g）進(jìn)行粉碎處理，并統(tǒng)一過40目篩，備用。

表1 天鉆藥材樣品信息Tab 1 Information of A.kwangsiensis sam p le

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀與顯微、TLC鑒別

2.1.1性狀鑒別 天鉆塊根肥大，呈紡錘形，長30～60 cm。表面棕褐色，有時(shí)有須根或須根痕。質(zhì)堅(jiān)而硬，斷面類白色，木部寬廣，淡黃或白色，氣微香特異，味苦。

2.1.2 顯微鑒別 ①塊根橫切面：木栓層由10余列長方形細(xì)胞組成，栓化并木化，皮層中有單個(gè)或數(shù)個(gè)成群散在的石細(xì)胞；韌皮部寬廣，韌皮部薄壁細(xì)胞中含有大量的淀粉粒，形成層不明顯；木質(zhì)部寬廣，射線寬1～3列細(xì)胞，導(dǎo)管大小不一，多單個(gè)呈徑向排列。②本品粉末棕色；淀粉粒眾多，類圓形、類球形或不規(guī)則，單?；驈?fù)粒，復(fù)粒由2～8個(gè)單粒組成，單粒直徑為6～36μm，層紋明顯；石細(xì)胞眾多，類方形或多角形，黃色，單個(gè)散在或多個(gè)成群，孔溝明顯，直徑20～60μm；草酸鈣簇晶常見，直徑5～12μm；木栓細(xì)胞類方形，內(nèi)含棕色物，直徑8～15μm；具緣紋孔導(dǎo)管多破碎，直徑20～40μm；纖維束偶見，長40～200μm。

顯微鑒別要點(diǎn)：淀粉粒眾多，黃色石細(xì)胞孔溝明顯，單個(gè)或聚集成群，可見草酸鈣簇晶，這是其顯微鑒別的主要特征。顯微鑒別圖見圖1、圖2。

圖1 天鉆塊根橫切面的顯微全貌圖1.木栓層；2.石細(xì)胞；3.韌皮部；4.淀粉粒；5.形成層；6.木質(zhì)部；7.木射線；8.髓Fig 1 M icrograph of the transaction of the roots of A.kwangsiensis1.phellem layer；2.lithocyte；3.phloem；4.starch grain；5.cambium layer；6.xylem；7.xylem rays；8.pith

圖2 天鉆粉末的顯微鑒別圖Fig 2 M icrograph of the powder of A.kwangsiensis

2.1.3 TLC鑒別 取本品粉末0.5 g，加石油醚（60～90Ⅱ）50 m l，超聲提取30min，濾過，殘?jiān)蛹状?0m l，再超聲提取30 min，濾過，濾液濃縮至干，用甲醇2m l使溶解，作為供試品溶液。另取馬兜鈴酸A對(duì)照品，加甲醇制成每1m l含2mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照TLC法[7]試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-乙酸（4∶1∶2滴）飽和8min為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。天鉆的TLC圖見圖3。

圖3天鉆的TLC圖S.馬兜鈴酸A對(duì)照品；1～11.天鉆藥材樣品Fig 3 TLC of A.kwangsiensisS.aristolochic acid A control；1-11.A.kwangsiensis samples

2.2 檢查

2.2.1 水分 照水分測(cè)定法[7]測(cè)定，可得11批樣品的水分含量均在16.0%以下。考慮到該藥材為南方所產(chǎn)，而南方氣候較為濕潤，因此將本品水分限度擬定為不得過16.0%。

2.2.2 總灰分 照灰分測(cè)定法[7]測(cè)定，可得11批樣品的總灰分含量均在6.0%以下，故將本品總灰分限度擬定為不得過6.0%。

2.2.3 酸不溶性灰分 照灰分測(cè)定法[7]測(cè)定，可得11批樣品的酸不溶性灰分含量均在2.0%以下，故將本品酸不溶性灰分限度擬定為不得過2.0%。

2.2.4 浸出物 查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知，天鉆中的活性成分聚集在乙酸乙酯部位，且該成分為脂溶性成分[2-6]。因此，初步考慮采用醇溶性浸出物來考察天鉆中所含的活性成分；而加熱提取一方面有利于化學(xué)成分的溶出，另一方面又節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間，最終確定采用熱浸法進(jìn)行試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)還比較了50%乙醇與95%乙醇作為提取溶劑的提取效果，結(jié)果表明，50%乙醇的提取效果較優(yōu)（以TZ-1為供試品，前者浸出物含量為15.36%，后者浸出物含量為11.40%），故最終確定以50%乙醇為提取溶劑。照醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法[6]測(cè)定，可得本品11批浸出物的含量均在8.0%以上，故將本品浸出物含量限度擬定為不少于8.0%。

2.3 含量測(cè)定[8-9]

2.3.1色譜條件 色譜柱：Phenomenex GeminiC18（250mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（含0.34%三乙胺、0.94%乙酸），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1m l/min；檢測(cè)波長：260 nm；柱溫：室溫。色譜見圖4。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradientelution process

圖4 高效液相色譜圖A.馬兜鈴酸A對(duì)照品；B.天鉆藥材樣品Fig 4 HPLC chromatogram sA.aristolochic acid A control；B.A.kwangsiensis sample

2.3.2線性關(guān)系考察 精密稱取馬兜鈴酸A對(duì)照品21.8mg，置于100m l量瓶中，用甲醇超聲溶解后放至室溫，再用甲醇稀釋至刻度，得溶液①。取溶液①5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液②。取溶液①25m l，置于100m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液③。取溶液③5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液④。取溶液④5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液⑤。取溶液⑤5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液⑥。取溶液⑥5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液⑦。取溶液⑦5m l，置于10m l量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得溶液⑧。取以上②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧溶液各20μl，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積積分值（y）為橫坐標(biāo)，對(duì)照品質(zhì)量濃度（x）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為x＝0.009 8y+0.050 7（r＝0.999 9，n＝7）。結(jié)果顯示，馬兜鈴酸A的質(zhì)量濃度在1.703～109.000μg/m l范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3供試品溶液的制備 精密稱取樣品約0.5 g，置于50m l量瓶中，用甲醇超聲30min溶解后放至室溫，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，以0.45μm微孔濾膜濾過，即得。取20μl進(jìn)樣。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品（編號(hào)：TZ-6）0.23 g，平行9份，每3份為一組，分別加入已知樣品中馬兜鈴酸A含量的125%、100%、75%的對(duì)照品，按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 馬兜鈴酸A的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab 3 Resultsof recovery testsof aristolochic acid A（n＝3）

2.3.5 樣品含量測(cè)定 取各批天鉆藥材粉末約0.5 g，分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中馬兜鈴酸A的含量，結(jié)果見表4。

表4 各批天鉆藥材中馬兜鈴酸A的含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）Tab 4 Results of content determ ination of aristolochic acid A in A.kwangsiensis（%，n＝3）

3 討論

文獻(xiàn)中用于馬兜鈴酸A含量測(cè)定的檢測(cè)波長有387、304、260 nm[7-9]，筆者通過對(duì)天鉆藥材的色譜圖進(jìn)行比較后，確定檢測(cè)波長為260 nm。后又對(duì)色譜柱、流動(dòng)相進(jìn)行了篩選，最終確定文中色譜條件，且分離效果較好。

關(guān)于天鉆中化學(xué)成分的研究較少，均完成于20世紀(jì)90年代以前，其有效成分至今尚未明確。本研究中，筆者選擇天鉆中含有腎毒性成分的馬兜鈴酸A作為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定，目的在于提示在天鉆使用過程中應(yīng)注意用藥的安全性。本研究發(fā)現(xiàn)，購買的天鉆藥材中馬兜鈴酸A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于千分之一，這是否因放置時(shí)間太長或是受地域因素的影響，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，所建標(biāo)準(zhǔn)可用于天鉆藥材的質(zhì)量控制。

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Quality Study of Yao M edicineAristolochia kwangsiensis

ZHANG Ya-zhou1，2，F(xiàn)AN Lan-lan1，QIN Shan-ding1，LIDian-peng2（1.Natural Pharmaceutical Chem istry Center，Guangxi Zhuang Autonomous Region Medicinal Botanical Garden，Nanning 530023，China；2.Guangxi Zhuang Autonomous Region Guilin Botany Institute，Chinese Academy of Sciences，GuangxiGuilin 541006，China）

OBJECTIVE：To establish quality control of Yao medicineAristolochia kwangsiensis.METHODS：The samples were identified by m icroscopic identification and TLC；according to the method ofChinese Pharmacopoeia，moisture，total ash，acid-insoluble ash and extract were detected；the content of aristolochic acid was determ ined by HPLC.The separation was performed on Phenomenex Gem ini C18（250 mm×4.6 mm，5μm）column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-water（containing 0.34%triethylam ine，0.94%acetic acid，gradient elution）at detection wavelength of 260 nm.RESULTS：M icroscopic characteristics ofA.kwangsiensiswere distinctive；TLC spots were clear；the linear range of aristolochic acid A were 1.703-109.000μg/m l（r＝0.999 9）w ith average recoveries of 97.54%（RSD＝0.22%，n＝3），101.16%（RSD＝0.63%，n＝3）and 101.15%（RSD＝0.39%，n＝3）.CONCLUSIONS：Established standard can be used for quality control ofA.kwangsiensis.The m icroscopy and appearance of 11 batches ofA.kwangsiensisfrom Guangxi and Yunnan province have kept stable，but there is great difference in the content of aristolochic acid A.

Aristolochia kwangsiensis；Aristolochic acid A；Quality standards；Yaomedicine

R284.1；R917

A

1001-0408（2014）11-1034-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.11.26

廣西食品藥品監(jiān)督管理局瑤族習(xí)用藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目（No.MZY2012009）