鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的改善作用

王姍姍，周曉春，李秀秀，薛長(zhǎng)湖，王靜鳳*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨密度降低、骨組織微結(jié)構(gòu)改變而導(dǎo)致骨脆性和骨折危險(xiǎn)性增高為特征的全身性骨骼疾病，其產(chǎn)生原因與骨重建過(guò)程中成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的平衡失調(diào)有關(guān)[1]。骨質(zhì)疏松癥已成為一個(gè)世界范圍內(nèi)越發(fā)嚴(yán)重的社會(huì)健康問(wèn)題，據(jù)估計(jì)目前全世界患者人數(shù)已超過(guò)2 億，其發(fā)病率已躍居常見(jiàn)病、多發(fā)病的第7位。骨質(zhì)疏松癥患者預(yù)計(jì)到2050年將增加到2.2 億，其中 一半以上將發(fā)生在亞洲，絕大多數(shù)將在我國(guó)[2]。目前，市場(chǎng)上用于預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的藥物主要包括雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙磷酸鹽類、降鈣素、氟制劑和VD及其活性代謝物類藥物等[3]，但長(zhǎng)期服用具有較強(qiáng)的毒副作用，因此尋找安全有效的防治骨質(zhì)疏松癥的生物活性物質(zhì)已成為目前的研究熱點(diǎn)。

魚卵是水產(chǎn)加工的主要廢棄物之一[4]。它含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)和多種維生素等，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]，但對(duì)魚卵的高值化加工利用主要集中在功能脂質(zhì)方面[6]。有關(guān)魚卵糖蛋白的研究主要集中在胚胎發(fā)育[7]、分離純化[8]、生化特性[9]、模式識(shí)別和作為污染標(biāo)志物等發(fā)育生物學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)方面，但在食品加工方面的研究和應(yīng)用目前尚無(wú)發(fā)現(xiàn)。前期采用MC3T3-E1成骨細(xì)胞對(duì)不同水產(chǎn)動(dòng)物卵進(jìn)行活性篩選，研究結(jié)果表明，其唾液酸含量與增殖活性成正相關(guān)，其中鯽魚卵的作用效果最好。上述調(diào)查研究可知鯽魚卵具有潛在的利用價(jià)值和較大的開(kāi)發(fā)空間。

本研究通過(guò)摘除雙側(cè)卵巢的方法建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，從鯽魚卵中提取唾液酸糖蛋白研究其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的改善作用并探討其作用機(jī)制，旨在為鯽魚卵的高值化利用和抗骨質(zhì)疏松癥的藥物開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與動(dòng)物

鮮活雌性鯽魚購(gòu)于青島大連路水產(chǎn)品市場(chǎng)。

健康SD大鼠，雌性，體質(zhì)量（200±20）g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 試劑

阿侖膦酸鈉片 石家莊石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司；鈣測(cè)定試劑盒 北京中生北控生物科技股份有限公司；磷、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRACP）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；雌二醇（estradiol，E2）、脫氧吡啶啉（deoxypyridinoline，DPD）、組織蛋白酶K（cathepsin-K，Cath-K）、骨源性堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Ⅰ型前膠原羧基端前肽（propeptide carboxy-terminal procollagen，PICP）、骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）、核因子κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）、核因子κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒美國(guó)R&D公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；ALPHA 1-4 LO型凍干機(jī) 德國(guó)Christ公司；GL-20M型高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Agilent 1100高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白的制備和化學(xué)成分分析

活體雌性鯽魚處死后取出新鮮成熟魚卵，在低溫條件下除雜、勻漿、冷凍干燥。干物加入95%乙醇脫脂，冷風(fēng)干燥得脫脂鯽魚卵。將脫脂鯽魚卵干物按1∶30（m/V）的料液比加水，于4℃攪拌水提過(guò)夜，離心，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，得鯽魚卵唾液酸糖蛋白。采用二極管陣列串聯(lián)高效液相色譜法檢測(cè)鯽魚卵唾液酸糖蛋白中唾液酸含量為5.89%，苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量為7.94%，福林-酚法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量為44.25%，鉬藍(lán)比色法檢測(cè)磷含量為1.78%。

1.3.2 骨質(zhì)疏松癥模型的建立及動(dòng)物分組

采用雙側(cè)卵巢摘除法建立骨質(zhì)疏松癥模型。將雌性SD未交配大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為去卵巢組和假手術(shù)組，腹腔注射3.3 mL/kg的10%水合氯醛麻醉大鼠，去卵巢組摘除大鼠雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組切除大鼠腹腔內(nèi)一小塊脂肪，術(shù)后連續(xù)3 d注射慶大霉素抗感染治療，術(shù)后90 d大鼠尾靜脈取血，檢測(cè)E2含量、TRACP和ALP活性，以去卵巢組與假手術(shù)組相比大鼠血清E2水平顯著降低（P＜0.01），TRACP和ALP活性顯著升高（P＜0.01）判定大鼠成模。

將成模大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、鯽魚卵唾液酸糖蛋白組，每組10只。鯽魚卵唾液酸糖蛋白組灌胃400 mg/（kg·d）鯽魚卵唾液酸糖蛋白，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃1 mg/（kg·d）的阿侖膦酸鈉，模型對(duì)照組和假手術(shù)組灌胃生理鹽水。灌胃體積1 mL/100 g，每天1次，連續(xù)灌胃90 d。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料，每3 d稱量一次大鼠體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 d將大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，離心取上清，備用。于末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h，經(jīng)乙醚麻醉后腹主動(dòng)脈采血，分離血清，備用。

1.3.3 尿液脫氧吡啶啉、鈣、磷含量的測(cè)定

具體操作方法參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書。

1.3.4 血清Cath-K、TRACP活性的測(cè)定

具體操作方法參照相應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說(shuō)明書。

1.3.5 血清骨源性ALP活性和OCN、PICP含量的測(cè)定

具體操作方法參照相應(yīng)ELISA試劑盒說(shuō)明書。

1.3.6 血清OPG、RANK、RANKL含量的測(cè)定

具體操作方法參照相應(yīng)ELISA試劑盒說(shuō)明書。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異顯著，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠尿液DPD、Ca、P含量的影響

表1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

表1 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table1 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the indexes of bone absorption (± s,, n = 1100))

注：# #.與假手術(shù)組相比，差異極顯著（P＜0.01）；*.與模型對(duì)照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與模型對(duì)照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。下同。

組別 DPD含量/（nmol/L） Ca含量/（mmol/L） P含量/（mmol/L） TRACP活力/（U/L） Cath-K含量/（pg/mL）假手術(shù)組 43.43±8.55 0.4 3±0.03 31.17±5.82 19.98±2.58 1 273.54±104.85模型對(duì)照組 82.20±8.09## 1.29±0.24## 53.51±2.74## 42.18±1.67## 2 450.90±153.01##陽(yáng)性對(duì)照組 64.02±6.15** 0.93±0.23** 41.29±2.06** 30.80±1.26** 1 558.6±114.02**唾液酸糖蛋白組 60.69±5.92** 0.69±0.09** 33.32±1.62** 22.97±2.84** 1 489.32±118.80**

由表1可知，DPD是Ⅰ型膠原的分解產(chǎn)物，是反映骨吸收的特異性指標(biāo)。模型對(duì)照組大鼠尿液DPD含量較假手術(shù)組顯著升高；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，DPD含量顯著降低，與模型對(duì)照組相比降低了26.16%（P＜0.01）。去卵巢大鼠骨吸收增加，溶骨活性增強(qiáng)，骨中Ca、P釋放進(jìn)入血液循環(huán)，經(jīng)腎臟后以尿液形式排出，因此尿液中Ca、P含量一定程度上反映骨鹽丟失情況。模型對(duì)照組大鼠尿液Ca、P含量較假手術(shù)組顯著升高；與模型對(duì)照組相比，灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后Ca、P含量顯著降低，分別降低了46.87%（P＜0.01）和37.73%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白的作用效果較陽(yáng)性對(duì)照組藥物作用效果更顯著。結(jié)果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可有效抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收，防止骨礦鹽丟失。

2.2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清TRACP、Cath-K活性的影響

由表1可知，TRACP由破骨細(xì)胞合成并分泌，它參與骨基質(zhì)中固體鈣磷礦化底物的降解；Cath-K是由破骨細(xì)胞分泌的一種能水解Ⅰ型膠原的蛋白酶，二者都是敏感的特異性骨吸收標(biāo)志物。模型對(duì)照組大鼠血清TRACP、Cath-K活性較假手術(shù)組顯著升高。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后二者活性均顯著降低，與模型對(duì)照組相比，分別降低了45.55%（P＜0.01）和39.23%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白作用效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照組的藥物作用效果。結(jié)果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收。

2.3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量的影響

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨生成指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

表2 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨生成指標(biāo)的影響（±s，n==1100）Table2 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on serum indexes associated with bone formation (± s,, n = 1100))

組別 BALP活力/（U/L） OCN含量/（ng/mL） PICP含量/（ng/mL）假手術(shù)組 85.08±3.45 3.46±0.45 6.25±0.36模型對(duì)照組 190.01±6.65## 6.25±0.46## 8.61±0.53##陽(yáng)性對(duì)照組 113.53±4.24** 3.85±0.32** 6.40±0.37**唾液酸糖蛋白組 103.97±4.93** 3.70±0.58** 6.45±0.25**

由表2可知，BALP是成骨細(xì)胞分泌的胞外酶，參與骨的礦化過(guò)程，可反映成骨細(xì)胞活性。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組大鼠血清BALP活性升高了123.35%（P＜0.01）；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，BALP活性顯著降低，與模型對(duì)照組相比降低了45.28%（P＜0.01）。OCN是由成骨細(xì)胞合成并分泌的骨組織中最豐富的非膠原蛋白。模型對(duì)照組與假手術(shù)組大鼠相比血清OCN含量升高了80.94% （P＜0.01）；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后OCN含量降低了40.85%（P＜0.01）。

PICP與骨基質(zhì)的重要組成成分Ⅰ型膠原的合成成正相關(guān)。與假手術(shù)組相比，模型對(duì)照組PICP含量顯著升高；灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，PICP含量顯著降低，與模型對(duì)照組相比降低了25.17%（P＜0.01）。結(jié)果表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白能有效抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠高骨轉(zhuǎn)換速率，防止骨丟失。

2.4 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清OPG、RANK、RANKL含量的影響

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影響（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

表3 鯽魚卵唾液酸糖蛋白對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠血清OPG、RANNKK和RANKL含量的影響（±s，n==1100）Table3 Effect of sialoglycoprotein from Carassius auratus spawn on the contents of OPG, RANK and RANKL in serum (± s,, n = 1100))

組別 OPG含量/（pg/mL） RANK含量/（pg/mL） RANKL含量/（pg/mL） RANKL/OPG假手術(shù)組 12.47±1.45 34.44±3.09 15.75±1.01 1.27±0.14模型對(duì)照組 7.01±1.08## 36.27±5.82# 29.42±3.07## 4.29±0.86##陽(yáng)性對(duì)照組 9.23±1.18** 30.77±4.16* 21.72±1.81** 2.37±0.28**唾液酸糖蛋白組 10.97±0.62** 28.70±2.65* 19.80±1.86** 1.77±0.11**

由表3可知，OPG和RANKL由成骨細(xì)胞分泌，RANK由破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分泌，OPG通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，可阻斷RANKL與RANK的相互作用，抑制破骨細(xì)胞增殖分化，因此RANKL和OPG的比值決定了骨吸收的程度。模型對(duì)照組血清OPG含量顯著低于假手術(shù)組，RANK、RANKL含量顯著高于假手術(shù)組，且模型對(duì)照組RANKL/OPG比值與假手術(shù)組相比升高了236.37%（P＜0.01）。灌胃鯽魚卵唾液酸糖蛋白后，與模型對(duì)照組相比，OPG含量降低了56.50%（P＜0.01），RANK含量降低了20.87%（P＜0.05），RANKL含量降低了32.69%（P＜0.01），RANKL/OPG比值降低了58.74%（P＜0.01），且鯽魚卵唾液酸糖蛋白作用效果優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥物的作用效果。結(jié)果證明鯽魚卵唾液酸糖蛋白能通過(guò)下調(diào)RANKL/OPG比值來(lái)抑制破骨細(xì)胞形成，從而抑制骨吸收。

3 討 論

切除卵巢是復(fù)制骨質(zhì)疏松癥模型的經(jīng)典方法，與臨床上絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥極為相似。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型是由Saville[10]于1969年首先用大鼠建立的，由于大鼠去卵巢后的骨丟失與婦女絕經(jīng)后的骨丟失有許多相似之處，故去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥模型已成為標(biāo)準(zhǔn)化的、公認(rèn)的研究絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)典病理模型[11]，目前已在國(guó)內(nèi)外廣泛的應(yīng)用[12-13]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)切除大鼠雙側(cè)卵巢建立骨質(zhì)疏松癥模型，以鯽魚卵唾液酸糖蛋白為受試物研究其對(duì)骨質(zhì)疏松癥的改善作用，測(cè)定骨吸收、骨生成指標(biāo)和OPG、RANK、RANKL含量，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。結(jié)果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收和骨生成指標(biāo)，改善大鼠高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)，顯著下調(diào)血清RANKL含量，上調(diào)OPG含量，降低RANKL/OPG比值。

骨代謝主要以骨重建形式進(jìn)行，在調(diào)節(jié)激素和局部細(xì)胞因子等協(xié)同作用下，不斷吸收舊骨，生長(zhǎng)新骨，周而復(fù)始，循環(huán)進(jìn)行，形成了體內(nèi)骨骼相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收相對(duì)增強(qiáng)，或者成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成相對(duì)減弱，使骨凈吸收增加，骨微結(jié)構(gòu)紊亂，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[14]。在骨吸收發(fā)生時(shí)，骨的Ⅰ型膠原會(huì)分解生成DPD，釋放到血液中并以原形直接經(jīng)腎臟以尿液形式排出[15]。Ca、P主要作用是促進(jìn)骨基質(zhì)的合成和骨礦沉積，當(dāng)骨丟失嚴(yán)重時(shí)，尿液中Ca、P含量升高。TRACP由破骨細(xì)胞合成并直接分泌進(jìn)入血液循環(huán)，半衰期長(zhǎng)，穩(wěn)定性好，可反映破骨細(xì)胞活性和骨吸收狀況[16]。Cath-K是破骨細(xì)胞分泌的一種半胱氨酸蛋白酶，能水解Ⅰ型膠原等骨基質(zhì)蛋白，是重要的破骨細(xì)胞分子標(biāo)記物和骨吸收標(biāo)志性指標(biāo)[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低去卵巢大鼠尿液DPD、Ca、P含量，顯著抑制血清Cath-K、TRACP活性。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收，防止骨礦鹽丟失的作用。

當(dāng)骨中鈣鹽沉積不足時(shí)，成骨細(xì)胞對(duì)BALP的分泌增多，BALP是評(píng)價(jià)骨礦化障礙的最佳指標(biāo)[18]。OCN可用于直接反映骨生成的速率[19]，它是骨組織中最豐富的非膠原蛋白，骨更新速率越快，成骨細(xì)胞分泌OCN越多。Ⅰ型膠原是骨基質(zhì)的重要組成成分，PICP與Ⅰ型膠原的合成呈正相關(guān)[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著降低去卵巢大鼠血清BALP活性和OCN、PICP含量。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制骨質(zhì)疏松癥大鼠高骨轉(zhuǎn)換速率，防止骨丟失的作用。

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是成骨細(xì)胞作用于破骨細(xì)胞的重要途徑，是目前骨質(zhì)疏松癥防治的一個(gè)重大突破[21]。OPG和RANKL主要由成骨細(xì)胞分泌，其中，RANKL通過(guò)與破骨細(xì)胞表面靶信號(hào)受體RANK作用，促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖、分化、成熟和活化，引起骨吸收。而OPG可競(jìng)爭(zhēng)性地與RANKL結(jié)合，從而阻斷骨吸收信號(hào)的傳遞。因此，RANKL/OPG的比例是骨吸收的關(guān)鍵因素之一[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鯽魚卵唾液酸糖蛋白可顯著上調(diào)去卵巢大鼠血清OPG含量，下調(diào)RANKL含量，降低RANKL/OPG比值。表明鯽魚卵唾液酸糖蛋白具有抑制破骨細(xì)胞增殖分化，防止骨吸收的功能。

綜上所述，鯽魚卵唾液酸糖蛋白能顯著調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨代謝，抑制高骨轉(zhuǎn)換速率，防止骨丟失。其抗骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制可能與RANKL/OPG比值下調(diào)相關(guān)，但其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]KAKU M, ROCABADO J M R, KITAMI M, et al.Royal jelly affects collagen crosslinking in bone of ovariectomized rats[J].Journal of Functional Foods, 2014, 13(7): 398-406.

[2]楊希重.番茄紅素對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥防治作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].青島: 青島大學(xué), 2008.

[3]史傳道, 樊曉晨, 鄧海東.抗疏健骨顆粒對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠骨密度和骨生物力學(xué)的影響[J].河南中醫(yī), 2012, 32(7): 831-833.

[4]陸麗麗, 陳舜勝.鯉、鯽卵的脂質(zhì)和脂肪酸特性[J].食品科學(xué), 2007,28(12): 100-104.

[5]代忠波, 丁卓平, 劉承初, 等.三種淡水養(yǎng)殖魚魚卵的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2007, 29(1): 103-104.

[6]陳文娟.大黃魚魚卵磷脂的提取、鑒定及抗氧化活性研究[D].福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2010.

[7]黃金善, 范兆廷, 賈忠賀, 等.沉性大卵徑魚卵的觀察方法與虹鱒的胚胎發(fā)育[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2006, 9(4): 235-238.

[8]宋川, 李艷芳, 任陽(yáng)陽(yáng), 等.鰱魚卵高分子質(zhì)量 CPI-I 的純化與鑒定[J].食品科學(xué), 2012, 33(13): 100-103.

[9]岳振宇, 蔣一珪, 單仕新.雌核發(fā)育和兩性融合發(fā)育魚卵調(diào)控精核受精發(fā)育的生化特性研究[J].水生生物學(xué)報(bào), 1996, 20(2): 164-172.

[10]SAVILLE P D.Changes in skeletal mass and fragility with castration in th e rat; a model of osteoporosis[J].Journal of the American Geriatrics Society, 1969, 17(2): 155-166.

[11]廖進(jìn)民, 黃連芳, 陳艷, 等.己烯雌酚防治去卵巢大鼠股骨頸骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床解剖學(xué)雜志, 2009, 27(5): 573-576.

[12]XIA Bingjiang, XU Bing, SUN Yan, et al.The effects of liuwei dihuang on canonial Wnt/β-catenin signaling pathway in osteoporosis[J].Journal of Ethnopharmacology, 2014, 153(1): 133-141.

[13]邢志軍, 陳德喜, 趙景明.壯骨顆粒對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的影響[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥, 2014, 21(6): 8-10.

[14]劉明, 潘薇, 陳德才.甲狀旁腺激素治療骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展[J].中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志, 2012, 5(2): 151-156.

[15]程敏, 王慶偉, 劉雪英, 等.女貞子治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(2): 229-233.

[16]汪四海, 劉健, 張金山, 等.按不同臨床因素分組比較強(qiáng)制性脊柱炎患者血清骨鈣素、抗酒石酸酸性磷酸酶的變化[J].中國(guó)臨床保健雜志, 2013, 16(6): 587-590.

[17]唐全勇, 賈志宇, 趙云轉(zhuǎn), 等.咖啡酸對(duì)破骨細(xì)胞形成及組織蛋白酶K基因表達(dá)的抑制[J].中國(guó)組織工程研究, 2012, 16(46): 8561-8565.

[18]肖恩.骨質(zhì)疏松骨代謝生化指標(biāo)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志,2008, 14(3): 212-216.

[19]魏雙平, 李蒙, 李瑞玉, 等.傳統(tǒng)中藥對(duì)成骨細(xì)胞及骨鈣素合成的影響[J].中國(guó)組織工程研究, 2013, 17(11): 2083-2090.

[20]陳樹清, 周厚明, 孫保國(guó), 等.補(bǔ)腎方對(duì)去卵巢大鼠血清中PICP、ICTP 的影響[J].中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志, 2009, 17(3): 13-14.

[21]VIJAYAN V, KHANDELWAL M, MANGLANI K, et al.Homocysteine alters osteoprotegerin/RANKL system in the osteoblast to promote bone loss: pivotal role of redox regulator forkhead O1[J].Free Radical Biology and Medicine, 2013, 61: 72-84.

[22]ALCANTARA E H, SHIN M Y, SOHN H Y, et al.Diosgenin stimulates osteogenic activity by increasing bone matrix protein synthesis and bone-specific transcription factor Runx2 in osteoblastic MC3T3-E1 cells[J].The Journal of Nutritional Biochemistry, 2011,22(11): 1055-1063.