聚酰胺色譜法分離油茶蒲提取物中抑制5α-還原酶的活性部位

鄭茜茜，夏博能，沈 駿，吳曉琴，沈建福

（浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058）

5α-還原酶（5 alpha-reductase，EC1.3.99.5）是定位于靶細(xì)胞微粒體上的膜蛋白，依賴還原型輔酶ⅡNADPH作為供氫體，催化還原雄激素睪酮（T）轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚愿鼜?qiáng)的雙氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）[1]。5α-還原酶異常表達(dá)將會(huì)導(dǎo)致組織中DHT積聚，DHT含量過(guò)高會(huì)引起某些疾病如良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、多毛癥、男性脫發(fā)等，其中BPH 的發(fā)病率在60歲男性中為50%，80歲以上男性中高達(dá)90%[2]。目前國(guó)內(nèi)外臨床上廣泛使用非那雄胺（finasteride）、度他雄胺（dutasteride）[3]等作為治療藥物。該類(lèi)藥物的作用機(jī)制是通過(guò)抑制5α-還原酶活性，阻斷DHT合成來(lái)治療BPH，作為合成藥物不僅價(jià)格較昂貴而且會(huì)產(chǎn)生一定副作用。近些年研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物性多酚類(lèi)、三萜類(lèi)、甾體類(lèi)等化合物對(duì)5α-還原酶有較強(qiáng)抑制活 性，目前臨床已應(yīng)用的天然5α-還原酶抑制劑有鋸葉提取物棕（伯泌松）、非洲臀果木提取物（通尿靈）、油菜花粉提取物（前列康）、黑麥提取物（舍尼通）[4-6]等，從天然植物中篩選高效低毒的5α-還原酶抑制劑逐漸成為研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

油茶（Camellia oleiferaAbel.）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）木本植物，為我國(guó)重要的木本油料作物，油茶蒲為油茶果的外殼，約占油茶果總質(zhì)量的2/3，為油茶加工廢棄物[7]，在振興油茶產(chǎn)業(yè)的同時(shí)有效地開(kāi)發(fā)利用油茶蒲等副產(chǎn)物具有積極的意義。本實(shí)驗(yàn)前期研究證實(shí)油茶蒲提取物（oiltea camellia extracts，OCE）對(duì)5α-還原酶具有很強(qiáng)的抑制活性[8]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)OCE能有效改善大鼠前列腺增生癥狀[9]，是5α-還原酶的高效抑制劑。

目前從天然植物中分離提取5α-還原酶抑制活性部位的研究大多數(shù)采用硅膠色譜法[10-14]，采用聚酰胺色譜法進(jìn)行活性部位篩選的研究國(guó)內(nèi)外還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。聚酰胺色譜法[15]是指以聚酰胺為吸附劑的吸附色譜法，包括薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）和柱色譜（column chromatography，CC）兩大類(lèi)。聚酰胺（polyamide）是通過(guò)聚酰胺基聚合而成的一類(lèi)高分子化合物，分子中含有豐富的酰胺基，可與酚類(lèi)、酸類(lèi)、醌類(lèi)、硝基化合物等形成氫鍵結(jié)合而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離[16]。聚酰胺具有“雙重色譜”的性能，特別適合用于分離黃酮、酚類(lèi)和醌類(lèi)等化合物，對(duì)鞣質(zhì)具有極強(qiáng)的幾乎不可逆的吸附作用，故可作為脫鞣方法[17]。本實(shí)驗(yàn)以5α-還原酶的抑制率為指針，采用TLC和CC分離，通過(guò)HPLC檢測(cè)，篩選抑制5α-還原酶的活性部位，旨在為OCE中抑制5α-還原酶的關(guān)鍵化合物制備，及天然植物類(lèi)5α-還原酶抑制劑開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通白花油茶蒲 浙江省常山縣芳村鎮(zhèn)；AB-8型大孔樹(shù)脂 滄州寶恩樹(shù)脂有限公司；聚酰胺（100～200 目） 上海源葉生物科技有限公司；聚酰胺薄層板（10 cm×20 cm，10 cm×10 cm） 北京京京未來(lái)科技發(fā)展有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99%）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%） 比利時(shí)Acros公司；3-O-甲基鞣花酸-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖（3-O-methyl-D-glucopyranose，MEAG，純度＞95%） 實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈、甲醇（色譜純）美國(guó)Merk公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

雌性SD大鼠3 只，體質(zhì)量250～300 g 浙江大學(xué)紫金港動(dòng)物中心。

睪酮（T）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）美國(guó)Sigma公司；1,4-二硫代蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S萬(wàn)分之一電子分析天平 德國(guó)Sartorius公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；玻璃層析柱（Φ3.6 cm×40 cm）、BSZ-100自動(dòng)部分收集器上海滬西分析儀器廠；XY層析缸（10 cm×20 cm）上海暢輝化工儀器有限公司；玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管（內(nèi)徑0.3 mm） 華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；Waters 2695高效液相色譜儀（配有2996 PDA檢測(cè)器） 美國(guó)沃特世公司；Unitary Luna C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）北京華譜新創(chuàng)科技有限公司；Centrifuge 5810R高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；Himac CP-80β超高速離心機(jī)日本日立公司；T10BS25勻漿機(jī) 德國(guó)IKA公司；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 油茶蒲提取物的分離純化

1.3.1.1 油茶蒲提取物的制備

將油茶蒲干燥，粉碎至60 目，用50%（V/V）乙醇溶液85 ℃（料液比1∶10）熱回流提取2 h，過(guò)濾，濾液減壓濃縮去除乙醇后上AB-8大孔樹(shù)脂柱，以40%（V/V）乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，即可制得油茶蒲提取物（oiltea camellia extracts，OCE），總酚含量為（37.58±1.68）%。

1.3.1.2 聚酰胺薄層層析

聚酰胺薄層層析采用的展開(kāi)劑為正丁醇-甲醇-水-冰醋酸（體積比為3∶2∶2∶1）；顯色劑為0.5 g/100 mL FeCl3-乙醇溶液。

將新鮮配制的展開(kāi)劑加入到層析缸中，密閉放置15 min。用毛細(xì)管分別吸取適量供試液，以垂直方向小心接觸薄層板面，做條帶狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣基線距底邊1 cm，樣品原點(diǎn)之間距離1.5 cm。將點(diǎn)樣后的薄層板放入已達(dá)預(yù)平衡的層析缸中，密閉，上行展開(kāi)，薄層板浸入展開(kāi)劑中的深度要求溶劑的液面距原點(diǎn)約5 mm，展開(kāi)至8 cm展距后，立即取出薄層板，晾干，以備檢測(cè)。將已晾干的薄層板放入裝有顯色劑的容器中，待充分顯色后取出晾干[18]。根據(jù)比移值Rf合并相近組分，分離部位分別減壓濃縮干燥，稱量Fr干基質(zhì)量，進(jìn)而計(jì)算各Rf值相近組分的得率。

式中：L為原點(diǎn)中心到譜帶中心的距離/cm；L0為原點(diǎn)中心到溶劑前沿的距離/cm。

1.3.1.3 聚酰胺柱層析

聚酰胺預(yù)處理：用95%（V/V）乙醇溶液浸泡聚酰胺粉24 h，溶脹后濕法上柱。用3～4 倍柱體積的95%乙醇溶液洗至流出液透明為止，再依次用2.5 倍柱體積的5 g/100 mL NaOH水溶液、1 倍柱體積的蒸餾水、2.5 倍柱體積的10%（V/V）醋酸水溶液洗脫，最后用蒸餾水洗至流出液pH值呈中性，備用。

裝柱：將顆粒狀聚酰胺混懸于水中，使其充分膨脹，濕法上柱，裝柱后液面必須高于樹(shù)脂20～40 mm，讓聚酰胺自由沉降，待穩(wěn)定后用適量洗脫液沖洗樹(shù)脂柱。

上樣：將OCE充分溶解于適量洗脫 劑中，上樣至經(jīng)過(guò)預(yù)處理的聚酰胺樹(shù)脂柱。

洗脫：用正丁醇-甲醇-水-冰醋酸（3∶2∶2∶1）混合液洗脫，流速1 mL/min，流出液每5 min分管自動(dòng)收集。

1.3.2 高效液相色譜法（high performance liq uid chromatography，HPLC）檢測(cè)

1.3.2.1 進(jìn)樣液制備

OCE及Fr1～Fr7用蒸餾水配成1 mg/mL溶液，用甲醇配制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.216 mg/mL），用二甲基亞砜配制鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.223 mg/mL），用甲醇配制MEAG標(biāo)準(zhǔn)貯備液（0.226 mg/mL），過(guò)0.45 μm濾膜后進(jìn)樣檢測(cè)。

1.3.2.2 檢測(cè)色譜條件

色譜柱：Luna C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流動(dòng)相A：乙腈；流動(dòng)相B：1%乙酸水溶液；梯度洗脫：0～8 min，5%～10% A；8～16 min，10% A；16～25 min，10%～15% A；25～30 min，15% A；30～35 min，15%～20% A；35～40 min，20% A；40～45 min，20%～5% A；45～50 min，5% A。

1.3.3 5α-還原酶的抑制活性檢測(cè)

1.3.3.1 試劑的配制

睪酮溶液：精密稱取36 mg睪酮，無(wú)水乙醇定容至25 mL，濃度為5 mmol/L。

NADPH四鈉鹽溶液：精密稱取NADPH四鈉鹽42.5 mg，用蒸餾水溶解并定容至25 mL，濃度2 mmol/L。

提酶緩沖液：0.32 mol/L蔗糖，0.1 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5。

反應(yīng)液：1 mmol/L DTT，40 mmol/L磷酸鈉，pH 6.5。

1.3.3.2 大鼠5α-還原酶的制備方法

取清潔級(jí)雌性SD大鼠3 只，禁食不禁水過(guò)夜后脫頸椎處死，取出肝臟冰臺(tái)上剪碎。用預(yù)冷的緩沖液和玻璃勻漿器制成1∶5勻漿，4℃、10 000×g條件下離心15 min，取胞漿部分100 000×g條件下離心1 h，倒掉上清，沉淀即為粗微粒提取物。加入一定體積緩沖液，并用勻漿器進(jìn)行勻漿懸浮。分裝，-80 ℃冰箱保存。

1.3.3.3 5α-還原酶蛋白質(zhì)含量測(cè)定

利用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定5α-還原酶懸濁液蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度（g/L）。

1.3.3.4 5α-還原酶抑制活性測(cè)定

2 mL反應(yīng)體系中，睪酮20 μmol/mL，NADPH 40 μmol/mL，酶260 μg，在37 ℃反應(yīng)液中反應(yīng)4 min，248 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)（睪酮溶液最大吸收波長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.009 9x+0.003 5，R2=0.999 6），抑制率的計(jì)算見(jiàn)下式。

式中：A0為空白斜率（乙醇+NADPH+酶）；A1為反應(yīng)斜率（T+NADPH+酶）；A2為樣品斜率（T+NADPH+樣品+酶）。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚酰胺薄層層析結(jié)果

在薄層層析條件的摸索過(guò)程中，由于硅膠比聚酰胺對(duì)極性大的化合物吸附作用更強(qiáng)，樣品TLC檢測(cè)容易出現(xiàn)分離度不夠（Rf≤0.48）、拖尾嚴(yán)重、譜帶黏連等情況，故選擇聚酰胺色譜法。當(dāng)向展開(kāi)劑體系中添加一定比例的冰醋酸后，可明顯減少拖尾并改善譜帶形狀。原因在于冰醋酸的添加增加了展開(kāi)劑的極性，抑制了化合物中羧基解離，從而有利于羧酸類(lèi)化合物的展開(kāi)[15]，考慮到OCE總酚含量較高（37.58±1.68）%，所以推測(cè)OCE中含有一定量的酚酸類(lèi)化合物。

圖1 油茶蒲提取物柱層析分離產(chǎn)物Fr1～Fr7的TLC圖Fig.1 TLC pro file of Fr1 through FFrr7

參照1.3.1.3節(jié)柱層析方法，OCE上樣8.00 g，柱層析洗脫后共收集410 管，總體積3 026 mL，回收率36.62%，經(jīng)聚酰胺柱層析后得到7 個(gè)分離部位Fr1～Fr7。由薄層層析結(jié)果（圖1）可知，OCE分離度顯著，譜帶清晰，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象；Fr3、Fr5、Fr6只含單一譜帶，F(xiàn)r2含3 條譜帶，F(xiàn)r1、Fr4、Fr7所含化合物未得到有效分離。此外由表1可知，F(xiàn)r1得率（20.02%）顯著高于其他分離部位，F(xiàn)r2得率（6.11%）次之，F(xiàn)r4得率最低（僅為0.62%）。樣品回收率較低是因?yàn)榫埘０穼?duì)鞣質(zhì)具有極強(qiáng)的吸附作用，所以O(shè)CE中含有的大量鞣質(zhì)被吸附在聚酰胺柱上未被洗脫，由5α-還原酶抑制率檢測(cè)結(jié)果可知鞣質(zhì)類(lèi)化合物對(duì)5α-還原酶無(wú)顯著抑制作用，因此用聚酰胺進(jìn)行脫鞣處理，以利于OCE中活性成分的有效富集。

表1 油茶蒲提取物柱層析分離產(chǎn)物Fr1～Fr7Table 1 Column chromatographic separation of fractions Fr1 through Fr7 of OOCCEE

2.2 HPLC檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.2 HPLC pro file of standard substances

由圖2所知，沒(méi)食子酸（gallic acid，GA）、鞣花酸（ellagic acid，EA）、MEAG為OCE中主要特征酚類(lèi)化合物，出峰時(shí)間分別為6.783、39.559、38.541 min。

2.2.2 Fr1～Fr7的HPLC圖譜

圖3 Fr1～Fr7的HPLC圖Fig.3 HPLC pro files of Fr1 through FFrr7

由圖3可知，OCE、Fr1、Fr4、Fr7峰型多樣，顯示其組成較為復(fù)雜；Fr2、Fr3、Fr5、Fr6峰型較為單一，顯示其組成較為簡(jiǎn)單，主要化合物的純度較高；與標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖對(duì)照，發(fā)現(xiàn)Fr2中含有GA，F(xiàn)r7中含有EA，而Fr2、Fr3及Fr4均含有MEAG。

2.3 Fr1～Fr7的5α-還原酶的抑制活性

通過(guò)Fr1～Fr7對(duì)5α-還原酶抑制活性的檢測(cè)，結(jié)果表明7 個(gè)分離部位中Fr4和Fr5的抑制活性最高，抑制率分別為（73.01±2.93）%和（76.28±1.37）%，比純化前OCE的抑制率（57.79±1.67）%顯著增加，其余4 個(gè)分離部位的抑制活性都不及OCE，說(shuō)明OCE中具有高效抑制活性的關(guān)鍵化合物在Fr4和Fr5中得到了有效富集。由于Fr4得率僅為0.64%，明顯低于Fr5的得率2.10%，且HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示Fr4組成較為復(fù)雜，因此可以選擇Fr5作為活性部位進(jìn)一步制備抑制5α-還原酶的單體化合物。

圖4 Fr1～Fr7的 5α-還原酶抑制率Fig.4 Inhibition rates of Fr1 through FFrr7 on 5α-reductase

液相圖譜顯示Fr2中沒(méi)食子酸和MEAG的峰面積所占百分比分別為13.63%和80.18%，但Fr2抑制率（39.43%）低于OCE；Fr7中鞣花酸的峰面積所占百分比為35.12%，但Fr7抑制率（50.72%）也低于OCE。圖4結(jié)果表明沒(méi)食子酸、鞣花酸及MEAG的抑制率均在15%以下，顯著低于OCE的抑制率（57.79%）。由上述推測(cè)OCE中抑制5α-還原酶的關(guān)鍵化合物并不是沒(méi)食子酸、鞣花酸及MEAG。這與Hirano等[19]從娑羅雙屬樹(shù)的心材中分離得到5 種鞣質(zhì)類(lèi)化合物中沒(méi)食子酸和鞣花酸對(duì)5α-還原酶沒(méi)有抑制活性（5α-還原酶剩余活性分別為99%和97%）的結(jié)果吻合。

3 結(jié) 論

應(yīng)用聚酰胺色譜法能夠有效分離純化OCE中抑制5α-還原酶的活性部位。分離純化得到的7個(gè)部位中Fr4和Fr5抑制活性最強(qiáng)，抑制率分別為（73.01±2.93）%和（76.28±1.37）%，較OCE純化前的抑制率（57.79±1.67）%顯著增加，其中Fr5得率為2.10%，組成較為單一，這為進(jìn)一步制備OCE中抑制5α-還原酶的關(guān)鍵化合物奠定了基礎(chǔ)。

Hiipakka等[20]通過(guò)體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)5α-還原酶抑制的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)酚類(lèi)物質(zhì)（尤其異黃酮、黃豆苷、染料木黃酮和山萘酚）對(duì)5α-還原酶具有較強(qiáng)的抑制活性。油菜花粉、仙人掌、何首烏、交趾黃檀、知母、朝鮮當(dāng)歸、高良參、楊梅樹(shù)皮等提取物均分離出相應(yīng)的活性化合物[21-23]。課題組前期研究表明，OCE中多酚類(lèi)物質(zhì)含量較高（37.58±1.68）%，而且多酚類(lèi)物質(zhì)的含量與其5α-還原酶的抑制率成正相關(guān)[24]，因此OCE中5α-還原酶抑制的關(guān)鍵化合物極有可能是多酚類(lèi)物質(zhì)。

天然產(chǎn)物活性成分的層析分離技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是硅膠色譜法。硅膠吸附分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，因此極性小的混合物體系適合用硅膠柱等正相吸附劑來(lái)分離[25]。以酚酸類(lèi)化合物為主的油茶蒲提取物（OCE）極性較強(qiáng)，再加上羧基是極性很大的取代基，易解離成鹽，與硅膠吸附較強(qiáng)，所以O(shè)CE在用硅膠薄層層析（TLC）做成分預(yù)試時(shí)極易被硅膠死吸附，造成樣品損失嚴(yán)重及分離效果不理想（Rf≤0.48，譜帶黏連，嚴(yán)重拖尾）。

適合強(qiáng)極性化合物分離的吸附材料有聚酰胺、反相硅膠、葡聚糖凝膠等，但是反相硅膠、葡聚糖凝膠價(jià)格較為昂貴，對(duì)于上樣量較大的樣品分離最好選用聚酰胺。聚酰胺對(duì)于黃酮、蒽醌等多羥基酚性化合物的吸附分離效果要明顯優(yōu)于硅膠。聚酰胺吸附分離原理是通過(guò)分子中酰胺基的羰基與酚類(lèi)化合物中的羥基形成氫鍵而被吸附，與不能形成氫鍵的化合物分離，特別適合多元酚類(lèi)化合物的分離[26]。而且聚酰胺對(duì)鞣質(zhì)具有極強(qiáng)的幾乎不可逆的吸附作用，滿足本實(shí)驗(yàn)中除鞣質(zhì)的需求（沒(méi)食子酸、鞣花酸、MEAG不具有顯著5α-還原酶抑制活性），從而使活性成分得到有效富集。因此聚酰胺色譜法較硅膠色譜法更適合分離強(qiáng)極性的酚酸類(lèi)混合物體系。

[1]孫潔, 趙維, 向華, 等.非甾體類(lèi)5α-還原酶抑制劑研發(fā)近況[J].藥學(xué)進(jìn)展, 2011, 35(10): 450-455.

[2]NEELIMA D, DEEPAK B.Benign prostatic hyperplasia: an overview of existing treatment[J].Indian Journal of Pharmacology, 2011, 43(8):6-12.

[3]CONNOLLY S, ITZPATRICK J.Medical treatment of benign prostatic hyperplasia[J].Postgra duate Medical Journal, 2007, 83(3):73-78.

[4]CHO C H, BAE J S, KIM Y U.5α-Reductase inhibitory components as antiandrogens from herbal medicine[J].Journal of Acupuncture and Meridian Studies, 2010, 3(1): 116-118.

[5]JONAS A, ROSENBLAT G, KRAPT D, et al.Cactus fl ower extracts may prove beneficial in benign prostatic hyperplasia due to inhibition of 5α-reductase activity, aromatase activity and lipid peroxidation[J].Urological Research, 1998, 26(14): 265-270.

[6]HIDEAKI M, NORIKO S, MIHO Y, et al.Testosterone 5α-reductase inhibitory active constituents fromAnemarrhenae rhizoma[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2001, 24(3): 586-587.

[7]李利敏, 沈建福, 吳曉琴.八種油茶蒲提取物中活性物質(zhì)含量及其抗氧化能力的比較研究[D].杭州: 浙江大學(xué), 2013: 12-16.

[8]陳秋平.油茶蒲減肥降脂功能因子研究[D].杭州: 浙江大學(xué), 2011:2-5.

[9]羅曉偉.油茶蒲醇提取物抑制5α-還原酶及對(duì)前列腺疾病的作用[D].杭州: 浙江大學(xué), 2011: 39-45.

[10]HAN H Y, SHAN S, ZHANG Z, et al.Down-regulation of prostate specific antigen in LNCaP cells by flavonids from the pollen ofBrassica napusL.[J].Phytomedicine, 2007, 9(14): 338-343.

[11]MASTUDA H, YAMAZAKI M, MATSUO K, et al.Anti-androgenic ativity of myricae cortex-isolation of active constituents from bark of myrica rubra[J].Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2001, 24(3):259-263.

[12]陳蓮君.油菜蜂花粉活性成分的提取及結(jié)構(gòu)鑒定[D].無(wú)錫: 江南大學(xué), 2012: 8-25.

[13]LIU J, KENJI K, KUNIYOSHI S, et al.Structure-activity for inhibition of 5α-reductase by triterpenoids isolated fromGanoderma lucidum[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006, 2(14): 8654-8660.

[14]SUPHROM N, PUMTHONG G, KHORANA N, et al.Antiandrogenic effect of sesquiterpenes isolated from the rhizomes ofCurcuma aeruginosaRoxb.[J].Fitoterapia, 2012, 83: 864-871.

[15]嚴(yán)拯宇.中藥薄層色譜分析技術(shù)與應(yīng)用[M].北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2009: 1-60.

[16]徐任生, 趙維民, 葉陽(yáng).天然產(chǎn)物活性成分分離[M].北京: 科學(xué)出版社, 2012: 49-264.

[17]何麗一.平面色譜方法及其應(yīng)用[M].北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005:25-42.

[18]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典中藥材薄層色譜彩色圖集[M].北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009: 1-12.

[19]HIRANO Y, KONDO R, SAKAI K.5α-reductase inhibitory tanninrelated compounds isolated fromShorea laeviforia[J].The Japan Wood Reseaech Society, 2003, 49(4): 339-343.

[20]HIIPAKKA R A, ZHANG H Z, DAI W, et al.Structure-activity relationships for inhibition of human 5α-reductase by polyphenols[J].Biochemical Pharmacology, 2003, 63(5): 1165-1176.

[21]劉本, 常憶凌, 陳科力.5α-還原酶作為天然藥物篩選靶的研究進(jìn)展[J].藥物生物技術(shù), 2006, 13(9): 468-470.

[22]程芳, 陳光亮.植物藥治療良性前列腺增生的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥, 2009, 13(11): 1316-1317.

[23]NEWMAN D J, CRAGG G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years[J].Journal of Natural Products, 2007,70(2): 461-477.

[24]羅曉偉, 沈建福, 肖仁顯.油茶蒲提取物中次生代謝產(chǎn)物的測(cè)定[J].食品工業(yè)科技, 2011, 11(6): 451-453.

[25]薛揚(yáng), 吳唯.聚酰胺樹(shù)脂的層析分離應(yīng)用[J].化工新型材料, 2005,33(4): 50-53.

[26]方小燕.聚酰胺樹(shù)脂在分離純化黃酮中的應(yīng)用研究[J].海峽藥學(xué),2013, 25(5): 41-42.