慢性乙型肝炎患者抗病毒治療前后體內(nèi)TFH細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化*

黃春燕， 鄧 洪△， 朱建蕓， 陳祿彪， 謝冬英， 高志良

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染科，廣東廣州510630;2中山大學(xué)熱帶病防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510080;3廣東省肝臟疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510630)

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是一種 常見的危害公眾健康的慢性感染性疾病。CHB的治療中抗病毒治療是關(guān)鍵［1］，而目前對(duì)于療效方面缺乏基線及早期的臨床預(yù)測(cè)指標(biāo)［2］，究其原因可能是造成乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)持續(xù)感染的因素十分復(fù)雜，涉及病毒本身和宿主免疫狀態(tài)等多個(gè)方面。CHB的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸以及臨床預(yù)后都與患者的免疫狀態(tài)相關(guān)，體液免疫在機(jī)體的抗病毒機(jī)制中也發(fā)揮了重要作用。2000年研究發(fā)現(xiàn)濾泡輔助性 T細(xì)胞(follicular helper T cells，TFH)表面特異性標(biāo)志為CD4+CXCR5+，可分泌白細(xì)胞介素21(interleukin-21，IL-21)等多種細(xì)胞因子［3］。TFH細(xì)胞以及其分泌的IL-21在體液免疫應(yīng)答中的重要作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在免疫激活的CHB患者中外周血CD4+CXCR5+TFH細(xì)胞顯著升高，CHB的免疫激活可能與TFH細(xì)胞有關(guān)［4］，而已有大量的臨床研究證實(shí)處于免疫激活狀態(tài)的CHB患者抗病毒療效較佳［5-6］。但TFH細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子在CHB抗病毒治療前后的動(dòng)態(tài)變化尚不清楚。本研究旨在探討CHB患者抗病毒治療對(duì)TFH細(xì)胞數(shù)量、功能的影響以及TFH與抗病毒療效的關(guān)系。

材料和方法

1 研究對(duì)象

35例CHB患者均來自2012年4月至2013年8月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院的門診病例，年齡在18～41歲之間，抗病毒治療的適應(yīng)癥符合2010《慢性乙型肝炎防治指南》［1］，乙肝 e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)陽性者，乙肝病毒DNA(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid，HBV-DNA)＞2 ×107IU/L，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)＞2倍正常上限(upper limit of normal，ULN)，干擾素治療組ALT≤10 ULN，總膽紅素(total bilirubin，TBil)＜2 ULN，同時(shí)排除合并其它類型肝炎病毒感染、人類免疫缺陷病毒感染、酒精性肝病、未經(jīng)控制的自身免疫性疾病、失代償期肝硬化、腫瘤、孕婦和其它重要臟器病變(嚴(yán)重甲亢、心臟病等)。治療過程規(guī)律監(jiān)測(cè)和隨訪。

2 主要試劑和儀器

BD FACS LSRII型流式細(xì)胞儀。熒光標(biāo)記小鼠抗人單克隆抗體anti-CD3-PE、anti-CD4-PB、anti-CXCR5-Alexa 488、anti-IL-21-Alexa Fluor 647 及同型IgG1(κ isotype)-Alexa Fluor 647、佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)、離子霉素(ionomycin)和固定破膜劑＆阻斷劑brefeldin A均購自BD;淋巴細(xì)胞分離液購自Sigma，胎牛血清購自HyClone，RPMI-1640培養(yǎng)液購自Gibco。

3 方法

3.1 樣本收集 采用Ficoll分層液法對(duì)外周血血漿及單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)進(jìn)行分離備用，分別凍存于-80℃低溫冰箱和液氮中。

3.2 細(xì)胞內(nèi)染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 步驟簡述如下:用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整樣本PBMC密度為1×109/L，毎樣本管加入刺激物(含 BD GolgiPlugTM)2 μL并置于37 ℃、5%CO2孵箱中4 h。收集細(xì)胞先加入anti-CD3-PE、anti-CD4-PB和anti-CXCR5-Alexa 488標(biāo)記的單克隆抗體，于4℃避光靜置30 min進(jìn)行胞外染色，然后用固定破膜劑，根據(jù)說明書對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破膜處理，破膜洗液洗滌2次后加入anti-IL-21-Alexa Fluor 647標(biāo)記的單克隆抗體及其同型IgG1于4℃ 避光靜置30 min進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(intracellular cytokine staining，ICS)，破膜洗液洗滌2次后，用300 μL的PBS重懸，應(yīng)用流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞，獲得的數(shù)據(jù)用Flow-Jo軟件分析。

3.3 生化及病毒學(xué)指標(biāo) ALT和TBil采用常規(guī)生化檢測(cè)，乙肝兩對(duì)半采用化學(xué)發(fā)光法(Roche)，HBVDNA定量采用熒光定量PCR方法(ABI)檢測(cè)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

流式數(shù)據(jù)采用FlowJo 7.6.2流式分析軟件分析，SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用GraphPad Prism 5 Demo統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)描述，兩組間非參數(shù)比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間非參數(shù)比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 患者基本情況

35例CHB患者均來自2012年4月至2013年8月中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院的門診病例(表1)，其中聚乙二醇干擾素α-2a治療21例，替比夫定治療14例?；颊呋€HBeAg均為陽性，治療前(0周)年齡、性別、HBV-DNA和ALT差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，治療24周中僅有2例發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換，治療隨訪過程中患者未見嚴(yán)重不良反應(yīng)。

表1 抗病毒治療過程中病人基本資料Table 1.Clinical characteristics of the study subjects with antiviral therapy(Mean±SD)

2 外周血T淋巴細(xì)胞中IL-21主要由TFH細(xì)胞分泌

從PBMC中圈出CD3和CD4雙陽性細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)IL-21的表達(dá)主要是 CD3+CD4+T細(xì)胞，CD3+CD4-群的細(xì)胞(主要是CD8+T細(xì)胞)幾乎不表達(dá)，IL-21在CD4+CXCR5+T細(xì)胞中高表達(dá)(2.89% ±2.83%)，見圖1。

Figure 1.Analysis of IL-21-producing TFHcells by intracellular cytokine staining and flow cytometry.Intracellular IL-21 was produced mainly by CD4+CXCR5+TFHcells.圖1 胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+CXCR5+T細(xì)胞及其胞內(nèi)IL-21的表達(dá)

3 不同抗病毒治療對(duì)TFH細(xì)胞和其胞內(nèi)IL-21的表達(dá)水平的影響無明顯差異

CHB患者在2種抗病毒治療24周中，TFH細(xì)胞表達(dá)水平均有所波動(dòng)，但不同時(shí)點(diǎn)(0周、治療12周和24周)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TFH細(xì)胞分泌IL-21的水平呈下降趨勢(shì)(但P＞0.05)(圖2A、B);TFH細(xì)胞的表達(dá)水平在替比夫定(n=14)和干擾素(n=21)抗病毒治療中(0周、12周、24周)，兩者之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2C、D)。

4 發(fā)生病毒學(xué)應(yīng)答(virological response，VR)與病毒學(xué)應(yīng)答不佳(no virological response，NVR)患者TFH細(xì)胞及胞內(nèi)IL-21表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)變化

VR(定義為48周內(nèi)HBV-DNA＜1×105IU/L)組和NVR(定義為48周內(nèi)HBV-DNA＞1×105IU/L)組治療前HBV-DNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);VR組治療12周及24周HBV-DNA較NVR組顯著下降(P＜0.01)，見圖3A。TFH細(xì)胞在NVR組呈持續(xù)上升趨勢(shì)(但P＞0.05);VR組治療前和治療12周TFH細(xì)胞表達(dá)水平均顯著高于NVR組(分別P＜0.01和P＜0.05)，見圖3B。VR組治療前IL-21表達(dá)水平顯著高于NVR組(P＜0.05)，見圖3C。

討 論

目前認(rèn)為免疫發(fā)病機(jī)制是CHB發(fā)病的主要機(jī)制。前期我們研究證實(shí)細(xì)胞免疫在CHB中起著重要作用［7-8］，而近期有研究顯示，在慢性病毒性感染的動(dòng)物模型中IL-21對(duì)特異性細(xì)胞免疫功能的維持起重要作用［9］。亦有研究提示在CHB患者中替比夫定抗病毒治療12周血清IL-21可以預(yù)測(cè)CHB患者的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換［10］。因IL-21是TFH細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)因子，從而推測(cè)TFH細(xì)胞在CHB中發(fā)揮了一定的免疫調(diào)節(jié)功能。而我們研究發(fā)現(xiàn)CHB患者使用核苷類似物(替比夫定)或干擾素治療12周及24周后，2組患者TFH細(xì)胞水平變化無明顯差別，因兩者抗病毒機(jī)制不同，故我們推測(cè)替比夫定和干擾素對(duì)CHB患者TFH細(xì)胞影響均是間接作用，或者可能是一種伴隨現(xiàn)象。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)VR組隨著抗病毒治療HBV-DNA持續(xù)下降的同時(shí)TFH細(xì)胞也隨之下降，與之相反，NVR組中TFH細(xì)胞持續(xù)升高，提示抑制病毒復(fù)制可能可以部分恢復(fù)TFH細(xì)胞的水平。

Figure 2.The levels of TFHcells(A，C)and intracellular IL-21(B，D)during antiviral therapy.A，B:overall effects of antiviral therapy(n=35);C，D:respective effects of telbivudine(LDT)and interferon(IFN).Mean±SD.圖2 治療過程中TFH細(xì)胞和胞內(nèi)IL-21的變化

Figure 3.Changes of HBV-DNA(A)，TFHcells(B)and intracellular IL-21(C)in virological response(VR)group(n=22)and no virological response(NVR)group(n=13)in 24 weeks.Mean±SD.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NVR.圖3 24周內(nèi)HBV-DNA、TFH細(xì)胞和胞內(nèi)IL-21水平在病毒學(xué)應(yīng)答組和病毒學(xué)應(yīng)答不佳組的變化

有文獻(xiàn)報(bào)道IL-21對(duì)于控制病毒持續(xù)感染至關(guān)重要［9］，在小鼠動(dòng)物模型中也發(fā)現(xiàn)了 IL-21可促進(jìn)HBV抗原清除［11］。而在本研究中發(fā)現(xiàn)VR組TFH細(xì)胞在治療前、治療12周和24周均高于NVR組，且治療前VR組IL-21也高于NVR組，提示了治療前高水平表達(dá)的TFH細(xì)胞及IL-21將有助于HBV的清除，從而推測(cè)TFH細(xì)胞通過分泌IL-21促進(jìn)體液免疫使HBV得到控制，與前面的研究結(jié)果一致。近期有研究報(bào)道外周血CD4+CXCR5+T細(xì)胞通過IL-21使慢性HBV感染患者的e抗原血清轉(zhuǎn)換受益［15］。其機(jī)制可能是由于TFH細(xì)胞持續(xù)表達(dá)CXCR5，在CXCR13的趨化下遷移到B細(xì)胞濾泡并同時(shí)高表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞共刺激分子、Bcl-6(B-cell leukemia/lymphoma 6 protein)和程序性死亡蛋白1，分泌IL-21，執(zhí)行輔助B細(xì)胞的功能［12-15］，并協(xié)助激活B細(xì)胞，調(diào)節(jié)體液免疫反應(yīng)，并進(jìn)一步增強(qiáng)HBV特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，最終促進(jìn)HBV的病毒清除。

總之，TFH細(xì)胞的表達(dá)水平與CHB抗病毒療效相關(guān)，測(cè)定患者治療前TFH細(xì)胞及其胞內(nèi)IL-21的表達(dá)水平將有助于治療時(shí)機(jī)的選擇及療效預(yù)測(cè)。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)［J］.中華肝臟病雜志，2011，19(1):13-24.

［2］Janssen HL，Reijnders JG.Treatment with nucleos(t)ide analogues in chronic hepatitis B:where does the roadmap lead us?［J］.J Hepatol，2009，51(1):1-3.

［3］Breitfeld D，Ohl L，Kremmer E，et al.Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5，localize to B cell follicles，and support immunoglobulin production［J］.J Exp Med，2000，192(11):1545-1552.

［4］Feng J，Lu L，Hua C，et al.High frequency of CD4+CXCR5+TFHcells in patients with immune-active chronic Hepatitis B［J］.PLoS One，2011，6(7):e21698.

［5］Lau GK，Piratvisuth T，Luo KX，et al.Peginterferon Alfa-2a，lamivudine，and the combination for HBeAg-positive chronic hepatitis B［J］.N Engl J Med，2005，352(26):2682-2695.

［6］Buster EH，Hansen BE，Lau GK，et al.Factors that predict response of patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B to peginterferon-alfa［J］.Gastroenterology，2009，137(6):2002-2009.

［7］鄧 洪，崇雨田，韓曉燕，等.慢性乙型肝炎患者特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的變化［J］.中華肝臟病雜志，2006，14(10):721-724.

［8］王 姣，鄧 洪，謝冬英，等.HBV特異性CTLs表面CD244和PD-1共表達(dá)與慢性乙型肝炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性［J］.中國病理生理雜志，2012，28(12):2254-2260.

［9］Fr?hlich A，Kisielow J，Schmitz I，et al.IL-21R on T cells is critical for sustained functionality and control of chronic viral infection［J］.Science，2009，324(5934):1576-1580.

［10］Ma SW，Huang X，Li YY，et al.High serum IL-21 levels after 12 weeks of antiviral therapy predict HBeAg seroconversion in chronic hepatitis B［J］.J Hepatol，2012，56(4):775-781.

［11］Publicover J，Goodsell A，Nishimura S，et al.IL-21 is pivotal in determining age-dependent effectiveness of immune responses in a mouse model of human hepatitis B［J］.J Clin Invest，2011，121(3):1154-1162.

［12］Kim CH，Rott LS，Clark-Lewis I，et al.Subspecialization of CXCR5+T cells:B helper activity is focused in a germinal center-localized subset of CXCR5+T cells［J］.J Exp Med，2001，193(12):1373-1381.

［13］Rasheed AU，Rahn HP，Sallusto F，et al.Follicular B helper T cell activity is confined to CXCR5hiICOShiCD4 T cells and is independent of CD57 expression［J］.Eur J lmmunol，2006，36(7):1892-1903.

［14］Bryant VL，Ma CS，Avery DT，et al.Cytokine-mediated regulation of human B-cell differentiation into Ig-secreting cells:predominant role of IL-21 produced by CXCR5+T follicular helper cells［J］.J Immunol，2007，179(12):8180-8190.

［15］Li Y，Ma S，Tang L，et al.Circulating chemokine(C-X-C motif)receptor 5+CD4+T cells benefit hepatitis B e antigen seroconversion through IL-21 in patients with chronic hepatitis B virus infection［J］.Hepatology，2013，58(4):1277-1286.