Mus81和GEN1基因在肺癌組織中的表達及其臨床意義

喻光懋 吳云路 錢 穎 董學君

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)生率逐年增加，其療效一般均較差，除手術難以清除外，術后化療耐藥是重要原因。腫瘤化療耐藥尚無理想的對策，其重要原因在于耐藥機制及重要分子不甚明了，因此是當前研究的熱點之一。對于通過損傷DNA來殺死腫瘤細胞的藥物，其耐藥性與DNA損傷修復相關分子及其表達有關，并得到普遍認同。Mus81和GEN1是近年被發(fā)現(xiàn)的與DNA修復相關的新基因。李嬋媛等［1］報道，Mus81在喉癌中表達下調，并認為Mus81下調與喉癌發(fā)生具有顯著相關性。本研究組以往對乳腺癌的研究結果表明，乳腺癌患者病灶組織Mus81表達明顯低于相應的癌旁組織，有研究發(fā)現(xiàn)Mus81表達異常與耐藥性相關［2］。Turnbull等［3］報道，GEN1基因在乳腺癌病灶組織和相應癌旁組織表達無顯著差異。而Kuligina等［4］認為，GEN1突變是乳腺癌易感的隱性標志。

由此可見，Mus81和GEN1基因在部分腫瘤中表達有特異性改變，并顯示其改變與化療耐藥相關，但肺癌中的相關研究報道較少。本研究目的是了解肺癌組織中，Mus81和GEN1是否與其他腫瘤一樣有表達上的改變，并探討其對肺癌診斷和治療的潛在臨床價值及二者表達是否存在相關性。

材料與方法

1．材料:(1)臨床資料:收集肺癌患者手術標本30例(包括病灶組織和相應的癌旁組織)。所有標本均來源于筆者醫(yī)院心胸外科，肺癌患者年齡41～80歲，平均年齡64歲?；颊咝g前均未經放化療，病理診斷均經兩位病理醫(yī)師確診。(2)主要儀器:NANO DROP2000分光光度計購自美國Thermo公司，Anthos 2010酶標儀購自英國Anthos公司，瓊脂糖電泳儀購自上海復日科技公司，凝膠電泳成像系統(tǒng)購自美國Gibco公司，定性PCR儀、Western blot電泳儀電源、垂直電泳儀、轉移電泳槽均購自美國 Bio-Rad公司。(3)主要試劑:E．Z．N．A．?Total DNA/RNA/Protein Kit購自美國Omega公司，Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自北京Solarbio公司，cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒均購自美國 Biomiga公司，β-actin、Mus81、GEN1上下游引物均委托上海生工生物工程股份有限公司合成，β-actin鼠抗人一抗、Mus81鼠抗人一抗、GEN1兔抗人一抗、HRP兔抗鼠二抗、HRP羊抗兔二抗均購自英國Abcam公司，ECL化學發(fā)光A、B液購自上海Beyotime公司。

2．方法:(1)標本處理:標本用裝有一次性無菌袋的0℃保溫瓶收集，收集后20min內用生理鹽水沖洗、分裝，并立刻置于液氮中速凍，之后迅速轉存于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?2)Mus81和GEN1 mRNA達表的檢測:1)組織總RNA的抽提:取大約500mg新鮮組織加入液氮充分研磨后，按說明書加入 E．Z．N．A．?Total DNA/RNA/Protein Kit(Omega)，提取組織總RNA。提取出的總RNA用Thermo NANO DROP2000分光光度計測定濃度及純度，OD260/OD280在1．8～2．0之間為最佳。2)RT-PCR:按照cDNA第一鏈合成試劑盒(Biomiga)說明書，將5μg總RNA反轉錄成cDNA，之后進行 PCR反應。所用引物序列如下:Mus81上游引物:5'-TGTGGACATTGGCGAGAC-3'，下游引物:5'-GCTGAGGTTGTGGACGGA-3'(產物長度319bp);GEN1上游引物［5］:5'-CCACATGACTATGAATACTGCTGTCCTT-3'，下游引物:5'-TGGGAATCCCTCACAACAGCAAGC-3'(產物長度116bp);β-actin上游引物:5'-ACCCACACTGTGCCCATCTAC-3'，下游引物:5'-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3'(產物長度 108bp)。PCR 反應體系 20μl，包括 Taq MasterMix 10μl、上下游引物各1μl、cDNA 1μl、去離子水 7μl。PCR 反應條件:94℃ 預變性90s，然后 94℃30s、55℃30s、72℃1min，30 個循環(huán)，最后 72℃ 終延伸5min。取5μl PCR終產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。使用ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)進行灰度掃描、Quantity One-4．6．2分析結果。以同一標本Mus81以及GEN1基因mRNA條帶與內參基因β-actin mRNA條帶的光密度比值作為該基因的相對表達量。(3)Mus81和GEN1基因蛋白表達的檢測:取新鮮組織約500mg按照說明書加入 E．Z．N．A．?Total DNA/RNA/Protein Kit(Omega)，提取組織總蛋白。使用Anthos 2010酶標儀結合Bradford蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio)測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調整每孔蛋白上樣量，使每孔總蛋白量保持一致。100V恒壓，SDS-PAGE電泳2h;300mA恒流，轉膜1h。轉膜完成后用麗春紅染液(Solarbio)染色5min，蒸餾水洗去殘留染液。1×TBST洗膜5分/次×3次后，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，1×TBST洗膜15分/次×3次，然后分別加入β-actin鼠抗人抗體(1∶3000，Abcam)、Mus81 鼠抗人抗體(1∶1000，Abcam)、GEN1羊抗兔抗體(1∶75，Abcam)，4℃孵育過夜。棄一抗，1×TBST洗膜15分/次×3次。β-actin和Mus81組加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鼠二抗(1∶10000，Abcam)，GEN1組加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(1∶20000，Abcam)，室溫孵育1h。棄二抗，1×TBST洗膜15分/次 ×3次。最后滴加ECL化學發(fā)光A、B液(Beyotime)，曝光、顯影、定影。使用ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)進行灰度掃描、Quantity One-4．6．2分析結果，以同一標本Mus81以及GEN1蛋白條帶與β-actin蛋白條帶的光密度比值作為該蛋白的相對表達量。

3．統(tǒng)計學方法:采用統(tǒng)計軟件SPSS 17．0分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示。t檢驗比較癌組織、癌旁組織Mus81及GEN1表達量的差異。Spearman相關分析檢測Mus81和GEN1表達水平的相關性。所有檢驗均采用雙側檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．肺癌病灶組織及癌旁組織Mus81 mRNA和蛋白的表達:在肺癌組織中，Mus81 mRNA的平均相對表達量(0．365 ±0．098)低于相應癌旁組織(0．455 ±0．123)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3．529，P ＜0．05)(圖1、圖3)。Mus81蛋白平均相對表達量(1．046±0．121)低于相應癌旁組織(1．341 ±0．190)，差異有統(tǒng)計學意義(t=-4．273，P ＜0．05，圖2、圖4)。

2．肺癌病灶組織和癌旁組織GEN1 mRNA和蛋白的表達:肺癌組織中，GEN1 mRNA的平均相對表達量(0．420 ±0．111)與相應癌旁組織(0．455 ±0．123)相比，差異無統(tǒng)計學意義(t=-2．006，P ＞0．05，圖1、圖3)。GEN1蛋白平均相對表達量(0．769±0．188)同相應癌旁組織(0．719±0．148)相比，差異無統(tǒng)計學意義(t=0．957，P ＞0．05，圖2、圖4)。

圖1 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1 mRNA表達水平

圖2 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1蛋白表達水平

圖3 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1 PCR電泳結果

3．肺癌Mus81和GEN1表達的相關性:Spearman相關分析得出，30例肺癌組織中，Mus81表達水平和GEN1表達水平無直線相關關系(P＞0．05)，但在Mus81高表達的6例肺癌組織中，Mus81的表達水平和GEN1的表達水平呈正相關。

討 論

現(xiàn)有的研究認為，Mus81是一種抑癌基因，其編碼的蛋白屬于XPF核酸內切酶家族，在DNA修復及分解霍利迪連接體上具有重要作用［6］。本組30例肺癌病灶組織及癌旁組織的對照研究結果，Mus81 mRNA表達，肺癌病灶組織顯著低于癌旁組織(P＜0．05)，Mus81蛋白表達的結果也有統(tǒng)計學差異(P＜0．05)，表明Mus81可能與肺癌的發(fā)生相關。Mus81具有DNA修復功能，因此推測可能的機制為Mus81表達下調降低了對正常細胞損傷DNA的修復，細胞不能及時識別處理受損DNA，導致細胞癌變，這與己明確DNA損傷可致癌的理論相符。喉癌、乳腺癌、肺癌中均見到類似結果，提示Mus81表達下調導致腫瘤發(fā)生可能是不同腫瘤的共同現(xiàn)象，但具體的機制尚不明確，因此，進一步了解Mus81在細胞中的作用機制，對了解腫瘤的發(fā)生過程具有十分重要意義。

圖4 肺癌組織和癌旁組織中Mus81以及GEN1 Western blot結果

近年研究發(fā)現(xiàn)，GEN1作為XPG家族的新成員，具有分解霍利迪連接體，進而保證DNA順利修復的功能，并且GEN1和Mus81存在著密切關系，兩者共同影響細胞中霍利迪連接體的分解及DNA修復［7，8］。Wood 等［9］運用“基因組地形”技術，發(fā)現(xiàn) 2例乳腺癌患者的GEN1基因存在突變，并認為GEN1可能是一種新的抑癌基因。Turnbull等［3］通過分析乳腺癌患者以及對照組GEN1的表達認為，GEN1的表達情況和乳腺癌的發(fā)生沒有明顯關系。與此不同，Kuligina等［4］認為，GEN1在單側乳腺癌患者的體內表達較對照組高(P=0．031)，但雙側乳腺癌患者同對照組比差異無統(tǒng)計學意義。尚未發(fā)現(xiàn)GEN1在肺癌中表達情況的相關報道。鑒于GEN1和Mus81存在著密切關系，為此本研究進行這二基因的聯(lián)合分析，結果顯示，GEN1 mRNA和蛋白的表達水平，在肺癌和相應的癌旁組織中無統(tǒng)計學差異，這一結論和Turnbull等［3］的報道相一致，提示在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，GEN1的作用可能并不是主要的，而之前也有學者認為GEN1作為Mus81的替代基因而存在［10］。本研究30例肺癌組織中，Mus81和GEN1的表達沒有明顯的相關性，可能的原因是Mus81和GEN1之間，尚有其他中間相關因子發(fā)揮作用。但是在Mus81高表達的6例肺癌組織中，Mus81的表達水平和GEN1的表達水平呈正相關，這一結論或許可以從側面證明Mus81和GEN1共同影響著細胞DNA的修復［8］。

綜上所述，肺癌組織中Mus81的表達低于癌旁組織，提示Mus81的表達下調可能和肺癌的發(fā)生有關;結合之前相關報道，提示Mus81表達下調可能是不同腫瘤普遍存在的現(xiàn)象;GEN1在肺癌組織中的表達水平同癌旁相比無統(tǒng)計學差異，這提示GEN1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中并未起主要作用。Mus81表達水平和GEN1表達水平無明顯相關性。本研究觀察到Mus81異常表達與乳腺癌化療耐藥相關，但在肺癌中的相關性有待于進一步驗證。

1 李嬋媛，王淑云，袁海明，等．Mus81基因在喉癌中的突變和表達［J］．中華醫(yī)學遺傳學雜志，2008，25(5):560-565

2 錢穎，張帆，倪曉妍，等．Mus81基因在乳腺癌中的表達及其意義［J］．中華實驗外科雜志，2013，30(6):1313

3 Turnbull C，Hines S，Renwick A，et al．Mutation and association analysis of GEN1 in breast cancer susceptibility［J］．Breast Cancer Res Treat，2010，124(1):283-288

4 Kuligina ES，Sokolenko AP，Mitiushkina NV，et al．Value of bilateral breast cancer for identification of rare recessive at-risk alleles:evidence for the role of homozygous GEN1 c．2515_2519delAAGTT mutation［J］．Fam Cancer，2013，12(1):129-132

5 Wechsler T，Newman S，West SC．Aberrant chromosome morphology in human cells defective for Holliday junction resolution［J］．Nature，2011，471(7340):642-646

6 Agmon N，Yovel M，Harari Y，et al．The role of Holliday junction resolvases in the repair of spontaneous and induced DNA damage［J］．Nucleic Acids Res，2011，39(16):7009-7019

7 Ishikawa G，Kanai Y，Takata K，et al．DmGEN，a novel RAD2 family endo-exonuclease from Drosophila melanogaster［J］．Nucleic Acids Res，2004，32(21):6251-6259

8 Rass U，Compton SA，Matos J，et al．Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein［J］．Genes Dev，2010，24(14):1559-1569

9 Wood LD，Parsons DW，Jones S．The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers［J］．Science，2007，318(5853):1108-1113

10 Ho CK，Mazón G，Lam AF，et al．Mus81 and Yen1 promote reciprocal exchange during mitotic recombination to maintain genome integrity in budding yeast［J］．Mol Cell，2010，40(6):988-1000