人參皂苷Rb1激活Nrf2/ARE通路對術(shù)后疲勞綜合征老年大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷的影響

毛翔宇 莊成樂 陳偉哲 劉 舒 朱 江 吳天添 張昌靜 陳必成 余 震

術(shù)后疲勞綜合征(postoperative fatigue syndrome，POFS)為手術(shù)后常見的一種并發(fā)癥，多發(fā)生于腹部大手術(shù)，它的產(chǎn)生對患者的術(shù)后康復(fù)速度和質(zhì)量的影響很大［1］。老年患者因其特殊的生理代謝狀態(tài)以及較高的慢性疾病發(fā)生率使其抵御有害刺激的能力相對較弱。通過臨床觀察，筆者發(fā)現(xiàn)這類人群腹部大手術(shù)后疲勞感甚為突出，術(shù)后康復(fù)時間增加，質(zhì)量下降［3］?；诖?，減輕老年人POFS，加速術(shù)后恢復(fù)一直是外科領(lǐng)域研究的突出點。本課題組前期研究表明，人參皂苷Rb1可以通過降低骨骼肌氧化應(yīng)激損傷并提高抗氧化酶活性及增強骨骼肌能力而產(chǎn)生抗術(shù)后疲勞效果，但其具體機制并不為人所知［3］。Nrf2/ARE是至今發(fā)現(xiàn)的最重要的一條抗氧化通路，激活該通路可使機體產(chǎn)生相應(yīng)抗的氧化酶和Ⅱ相藥物代謝酶，從而加強細胞清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的能力，保持氧化還原平衡，減低氧化損傷。有研究報道，在人多巴胺能細胞中，通過激活Nrf2/ARE，人參皂苷Rb1能降低6-OHDA所致的氧化應(yīng)激損傷［5］。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，欲進一步探究Nrf2/ARE通路在人參皂苷Rb1減輕POFS老年大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷中的具體效應(yīng)，挖掘人參皂苷Rb1的抗疲勞機制。

材料與方法

1．材料:(1)藥物與試劑:人參皂苷Rb1(純度≥98．0%)(同田生物技術(shù)有限公司)，MDA、SOD測試盒(建成生物工程研究所)。RT、SYBR Green試劑盒(TOYOBO公司)，Trizol(life technology公司)，兔抗Nrf-2 GAPDH lamin B1多克隆抗體(Abcam公司)，山羊抗兔 IgG/HRP二抗(Biosharp公司)，兔二步法檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒(中杉金橋有限公司)，其余試劑購于金山試劑有限公司，均為分析純。(2)動物:SPF級老年雄性SD大鼠，體重650～750g，購自維通利華實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)外科學(xué)實驗室至22個月齡。本研究通過溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核，全程遵守《實驗動物管理條例》。

2．方法:(1)動物分組與模型制備:96只大鼠被隨機分為3組，分別為假手術(shù)對照組，POFS模型組和人參皂苷Rb1干預(yù)組，每組再按時間點分為術(shù)后6h，第1、3、7天4小組，共12組。對照組大鼠進腹腔后翻動腸袢后關(guān)腹，模型組和干預(yù)組大鼠行70%中段小腸切除以制作POFS大鼠模型［7］。(2)給藥:干預(yù)組大鼠術(shù)前3天知道取材當(dāng)天，以4ml/kg體重比，每日腹腔內(nèi)注射1次的人參皂苷Rb1(生理鹽水稀釋至3．75g/L)。對照組和模型組則腹腔內(nèi)注射相同比例生理鹽水。(3)疲勞評估:采用曠場實驗［8］。實驗裝置大小為 150cm×150cm×60cm，內(nèi)面黑色的木制無蓋方箱，底部劃為30cm×30cm的方格。實驗在安靜，微光的房間進行。將大鼠放于中心方格并開始記錄其經(jīng)過的格子數(shù)，直立次數(shù)、修飾時間、休息時間，整個過程歷時3min。(4)標(biāo)本采集:各組完成曠場實驗后，按照3．5ml/kg體重予2%戊巴比妥鈉腹部皮下注射，麻醉完成后立即取左下肢腓腸肌若干并于4℃預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈，濾紙吸干，分裝于液氮中，30min后轉(zhuǎn)至-80℃超低溫冰箱保存。(5)指標(biāo)測定:1)超氧化物歧化酶 (SOD)活性和丙二醛(MDA)含量檢測:取出部分待測骨骼肌組織，稱重。以質(zhì)量體積比1∶9加生理鹽水，制備10%組織勻漿，2000r/min離心10min后取上清液。然后根據(jù)試劑盒說明書，用生理鹽水將上清液按不同指標(biāo)稀釋成最佳測試濃度并檢測。勻漿蛋白濃度的測定采用BCA測定法。2)RT-PCR檢測骨骼肌Nrf2及Nqo1 mRNA表達水平:取出部分待測骨骼肌組織，稱重，Trizol等提取RNA，紫外分光光度法測RNA量及其純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟行反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)。所得cDNA于RT-PCR儀上進行反應(yīng)。β-actin引物序列:正義引物5'-GACAGGATGCAGAAGGAGATTACT-3'，反義引物5'-TGATCCACATCTGCTGGAAGGT-3';Nrf2引物序列:正義引物5'-ATGAGTCGCTTGCCCTGG-3'，反義引物 5'-CTTGTTTTCCGTATTAAGACACTGTAA-3';Nqo1引物序列:正義引物 5'-CTTGCTTTCCATCACCACCG-3'，反義引物 5'-GACGCTTCTTCCACCCTTCC-3'。反應(yīng)條件為:95℃ 1min;40個循環(huán)(95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s)，總延伸結(jié)束后，進行融解曲線分析，產(chǎn)物電泳。統(tǒng)計△△Ct值并比較各組 mRNA的表達情況。3)Western blot檢測:取出部分待測骨骼肌組織，根據(jù)核蛋白試劑盒提取核蛋白，RIPA法提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣30μg，8%SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，封閉。膜于5%脫脂牛奶中的一抗中4℃孵育過夜。然后洗膜并將其置入二抗稀釋液中室溫孵育1h。ECL試劑加入后曝光，顯影，定影，凝膠成像分析儀分別測算目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值，并將其比值作為蛋白表達量。

3．統(tǒng)計學(xué)方法:SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組間比較用單因素方差分析，組間的兩兩比較，方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane's T2檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1．人參皂苷Rb1干預(yù)對POFS老年大鼠行為學(xué)的影響:相比于對照組，模型組于術(shù)后第1、3天穿越格子數(shù)降低(P＜0．05)，第7天開始恢復(fù)，第 1、3、7天休息時間增加(P＜0．05)。相比于模型組，干預(yù)組于術(shù)后第1、3天穿越格子數(shù)開始增加(P＜0．05)，第7天恢復(fù)至模型組水平。

2．人參皂苷Rb1干預(yù)對POFS老年大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量的影響:相比于對照組，模型組SOD活性于術(shù)后第1天有增加趨勢，第3、7天明顯增加(P＜0．05)，MDA含量于術(shù)后6h有增加趨勢，于第1、3、7天明顯增加(P ＜0．05);相比于模型組，干預(yù)組SOD活性于術(shù)后6h，第1天有增高趨勢，并于第3、7天開始明顯增高(P＜0．05)，MDA 含量術(shù)后6h基本一致，第1天有降低趨勢，并于第3、7天明顯下降(P ＜0．05)。

3．人參皂甙Rb1對Nrf2及其下游靶基因 Nqo1 mRNA表達水平的影響:相比于對照組，模型組大鼠骨骼肌Nrf2 mRNA表達量于第1、3天時增加，第7天時恢復(fù)至對照組水平，下游靶基因Nqo1 mRNA在6h時表達量降低(P＜0．05)，并于第1、3天時有增加趨勢(P＞0．05)，第7天恢復(fù)至對照組水平。相比于模型組，干預(yù)組Nrf2 mRNA表達水平于術(shù)后6h及第1、3天時增高(P＜0．05)，第7天恢復(fù)至模型組水平，而Nqo1 mRNA于術(shù)后6h及第1天明顯增加(P＜0．05)，第3、7天時恢復(fù)至模型組水平，結(jié)果見表1。

表1 人參皂苷Rb1對POFS大鼠骨骼肌Nrf2及Nqo1 mRNA表達的影響(±s，n=8)

表1 人參皂苷Rb1對POFS大鼠骨骼肌Nrf2及Nqo1 mRNA表達的影響(±s，n=8)

與對照組同期相比，*P＜0．05;與模型組同期相比，#P＜0．05

組別 時間 Nrf2(2-△△CT) Nqo1(2-△△CT )6h 1．07 ±0．44 1．02 ±0．23術(shù)后第1 天 1．06 ±0．37 1．05 ±0．37術(shù)后第3 天 1．05 ±0．35 1．05 ±0．31術(shù)后第7 天 1．06 ±0．48 1．03 ±0．26模型 術(shù)后6h 0．97 ±0．34 0．62 ±0．25*術(shù)后第1 天 3．30 ±0．84* 1．34 ±0．46術(shù)后第3 天 1．61 ±0．48* 1．45 ±0．48術(shù)后第7 天 0．99 ±0．25 1．04 ±0．25人參皂苷 術(shù)后6h 1．53 ±0．49# 1．06 ±0．32#Rb1干預(yù) 術(shù)后第1天 5．72±1．37# 2．67±0．76#術(shù)后第3 天 2．45 ±0．70# 1．41 ±0．57術(shù)后第7天對照 術(shù)后0．95 ±0．37 0．94 ±0．26

4．人參皂苷Rb1對 骨骼肌Nrf2活化與轉(zhuǎn)位的影響:相比于對照組，模型組大鼠骨骼肌核內(nèi)Nrf2蛋白術(shù)后各個時間點表達量均增加(P＜0．05)，總Nrf2蛋白于術(shù)后6h，第1、3天表達量明顯增加(P＜0．05)，第7天時恢復(fù)至對照組水平;相比于模型組，干預(yù)組核內(nèi)Nrf2蛋白術(shù)后6h，第1、3天表達量明顯增加(P＜0．05)，第7天恢復(fù)至模型組水平;總Nrf2蛋白術(shù)后6h，第1天表達量開始增加(P＜0．05)，第3、7天時恢復(fù)至模型組水平。結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 人參皂苷Rb1對核內(nèi)nrf2蛋白表達的影響

圖2 人參皂苷Rb1對總nrf2蛋白表達的影響

討 論

術(shù)后疲勞綜合征其按部位分為外周疲勞和中樞疲勞，其中外周疲勞主要表現(xiàn)為骨骼肌功能下降［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌ROS的過度生成使得骨骼肌運動功能降低，它是骨骼肌疲勞的重要產(chǎn)生原因［9］。MDA是機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，是間接反映氧自由基對機體的損傷程度的重要指標(biāo)。而SOD作為其中一種重要的抗氧化酶，其活力則間接說明機體抗氧化能力的強弱。本課題組前期研究結(jié)果顯示，POFS大鼠骨骼肌存在著顯著的氧化應(yīng)激性導(dǎo)致的損傷，而通過提高抗氧化酶活性，減輕氧化應(yīng)激損傷等作用，人參皂苷Rb1增強了骨骼肌功能從而發(fā)揮其抗疲勞的作用［3］。

本實驗研究結(jié)果表明，模型組大鼠術(shù)后穿越格子數(shù)減少，休息時間增加;干預(yù)組大鼠穿越格子數(shù)增加，表明老年大鼠在小腸切除術(shù)后出現(xiàn)記憶力學(xué)習(xí)力減退的癥狀，處于顯著的疲勞狀態(tài)，與臨床上術(shù)后病人出現(xiàn)的體力下降，倦怠不適等疲勞癥狀較為相似，而人參皂苷Rb1則可明顯改善上述癥狀。模型組大鼠MDA含量在術(shù)后增加，SOD活性同時增加，干預(yù)組大鼠較模型組MDA含量明顯降低，SOD活性則明顯增加。這說明大鼠術(shù)后骨骼肌抗氧化應(yīng)激能力下降并伴隨明顯的氧化應(yīng)激所致的損傷，而人參皂苷Rb1則對此種氧化損傷具有明顯保護作用。這與本課題組前期研究結(jié)果相似。

Nrf2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能促使細胞活性氧降低并抵御有害的外來刺激。在生理狀態(tài)下，胞質(zhì)中的Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Keap1)聯(lián)結(jié)在Nrf2上，使之失活，而 Nrf2再被誘導(dǎo)激活后，其與Keap1分離并轉(zhuǎn)入細胞核，識別并結(jié)合一系列抗氧化反應(yīng)元件(ARE)，ARE能啟動下游相應(yīng)的Ⅱ相解毒酶基因等的表達，這類基因的表達上升能誘導(dǎo)細胞內(nèi)一些重要抗氧化物質(zhì)(如SOD、CAT、GSH等)的表達，這進而提升了外源性毒性物質(zhì)和自由基的清除與代謝［11］。而作為Nrf2驅(qū)動的重要下游靶基因之一，NAD(P)H醌氧化還原酶(Nqo1)是抗氧化應(yīng)激損傷的代表性組成部分［12］。

研究表明，白藜蘆醇能夠上調(diào)Nrf2表達來促進SOD、CAT等抗氧化酶的水平，這些反應(yīng)能減輕大鼠原代肝細胞的氧化應(yīng)激損傷［12］。還有研究發(fā)現(xiàn)，在氟中毒早期，機體能通過啟動Nrf2/ARE通路，增加SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的表達，從而提高細胞抵御氧化應(yīng)激的能力，最終減少機體的氧自由基［13］。本實驗研究結(jié)果表明，在術(shù)后一定時間內(nèi)，模型組大鼠骨骼肌Nrf2 mRNA表達顯著增加，Nrf2核蛋白與總蛋白表達量均增加，而核蛋白尤為顯著，而Nqo1 mRNA表達有一定增加趨勢，這表明了在POFS所產(chǎn)生的應(yīng)激狀態(tài)下，機體在Nrf2/ARE及其下游通路被激活后抗氧化能力增強，這可能是一種機體自身的代償性保護機制。人參是一種著名的中藥，在抗疲勞、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)及物質(zhì)代謝等多方面均有顯著功效［15］。人參皂苷Rb1是其具有顯著抗氧化作用的重要的有效成分之一。有研究顯示，通過啟動Nrf2/ARE通路，人參皂苷Rb1能夠減少小腸缺血再灌注所致的腎臟損傷［16］。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，干預(yù)組大鼠骨骼肌Nrf2 mRNA表達于術(shù)后明顯增加，Nrf2核內(nèi)蛋白與總蛋白表達量均增加，而尤以核蛋白增加較為顯著，而Nqo1 mRNA表達明顯增加，證實人參皂苷Rb1可上調(diào)POFS大鼠骨骼肌Nrf2/ARE通路及其下游基因的表達，發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激損傷和細胞保護的作用。

綜上所述，術(shù)后一段時間內(nèi)，通過激活 Nrf2/ARE通路，人參皂苷Rb1能降低POFS老年大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激所致的損傷，從而發(fā)揮抗術(shù)后疲勞作用。

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