冬蟲夏草無性型發(fā)酵技術研究進展

秦 鵬，趙玉卉，王 龍，2 *，路等學

（1.甘肅省科學院 生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅農業(yè)大學 草業(yè)學院，甘肅 蘭州 730070）

過去冬蟲夏草一直被認為麥角菌科（Clavicinitaccac）、蟲草屬（Cordyceps）真菌，拉丁學名為Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.，近幾年有關研究從分子生物學角度證實冬蟲夏草屬線蟲草科（Ophiocordycipitaceae）、線蟲草屬（Ophiocordyceps）真菌，合法名為Ophiocordyceps sinensis（Berk.），野生冬蟲夏草為冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲后長出的子座與僵蟲體構成的復合體，其具有抗腫瘤、抗病毒等功效[1]。目前，只有中國、布丹、尼泊爾和印度四個國家存在野生資源[2]，而其他國家分布野生冬蟲夏草的報道所指為非野生型資源[3]，我國的野生資源僅分布于青藏高原3 000～5 000 m的草甸中且野生資源日益減少。故冬蟲夏草有性型研究一直以來是國內外研究的熱點[4]且是難點和空白點，雖通過人工模擬培養(yǎng)可獲得較滿意的僵蟲率，但都沒有進入有性階段[5]。隨發(fā)酵技術的日趨成熟，冬蟲夏草發(fā)酵技術已成為其資源開發(fā)利用的重要途徑[6]，不同冬蟲夏草無性型作為發(fā)酵原料，為發(fā)酵技術的評價帶來了困難。研究主要就冬蟲夏草無性型相關類群展開，以目前綜述較少的中國被毛孢及其同種異名和同物異名菌種為原料，對固體、液體發(fā)酵技術研究現(xiàn)狀展開綜述。

1 冬蟲夏草無性型

蟲草菌是蟲草屬真菌的統(tǒng)稱[7]，目前，全球記載蟲草菌的有500多種[8]，中國記載的蟲草有120種[9]。楊濤等[1]從冬蟲夏草分離出冬蟲夏草無性型菌株且經反復培養(yǎng)得到了與野生冬蟲夏草完相同的子囊孢子，此后在專利NO.85101971（1985）中命名為冬蟲夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）；劉錫琎等[10]從四川采集了大量冬蟲夏草并分離出相同菌株，首次命名并證實中國被毛孢（Hirsutella sinensis）是冬蟲夏草的無性型；印象初等[11]將冬蟲夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）重新命名為中華束絲孢（Synnematium sinense）；張顯恥等[12]用冬蟲夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchongxiacae）進行液體發(fā)酵試驗，將該菌定名為蝙蝠蛾多毛孢（Hirsutella hepiali）。顯然，冬蟲夏草頭孢菌（Cephalosporium dongchong xiacae）、中華束絲孢（Synnematium sinense）和蝙蝠蛾多（被）毛孢（Hirsutella hepiali）屬同物異名。此外，研究人員分離獲得其他冬蟲夏草新種，如中國擬青霉（Paecilomyces sinensis）、蝙蝠蛾被孢霉（Mortierella hepialid）、蝙蝠娥擬青霉（Paecilomyces hepialid）等。但是，除中國被毛孢和中華束絲孢（即冬蟲夏草頭孢或蝙蝠蛾多毛孢）以外，其他新種均與冬蟲夏草全DNA相似率差別較大[13-17]，而且根據國際植物命名法則的條款、原則和優(yōu)先率，只有中國被毛孢和中華束絲孢為合格名，中國被毛孢和中華束絲孢屬同種異名[18]，國際公認的冬蟲夏草無性型為只有中國被毛孢（Hirsutella sinensis）。目前，雖然冬蟲夏草無性型的種類很多，“一名稱對應一真菌”將成為以后真菌命名的趨勢[19]，但發(fā)酵原料的不同會給發(fā)酵條件帶來很大的影響，以中國被毛孢或其同種異名或同物異名菌種作為發(fā)酵原料對發(fā)酵技術予以綜述。

2 固體發(fā)酵技術

固體發(fā)酵具有成本低、環(huán)保、過程易控等特點。固體發(fā)酵研究主要以菌絲體生物量為指標，李春如等[20]以菌絲長勢為指標，確定最佳氮源為奶粉＞黃豆粉＞酵母粉＞麩皮，碳源對菌絲生長影響較小，適宜碳源為葡萄糖、蔗糖以及果糖，30%接種量對菌絲生長有顯著的影響，CMC和玻璃珠能限制菌絲生長；張安寧等[21]以生長面積和生長情況為標準篩選出最佳氮源為脫脂奶粉、蛋白胨、酵母膏，最佳碳源為蔗糖、葡萄糖；周宇爝等[22]以中國被毛孢的菌絲體生物量為指標，發(fā)現(xiàn)氮源對菌絲體生物量的影響從大到小依次為：黃粉蟲蛹粉、牛肉蛋白胨、黃粉蟲粉，蛋白胨、大豆效果最差，故中國被毛孢優(yōu)先選擇與蝙蝠蛾幼蟲相似的動物性蛋白。

以功能成分為指標的研究相對較少，葛飛等[23]以中國被毛孢總核苷類物質為指標，最佳營養(yǎng)需求為酵母浸出粉3%、KH2PO40.2%、奶粉1%、葡萄糖2%、MgSO4·7H2O 0.1%，可顯著提高總核苷類物質的含量，此后，葛飛等[24]以中國被毛孢為原料，以麥角甾醇含量為指標篩選出最佳培養(yǎng)基：玉米粉2 g、大米5 g、蠶蛹粉1 g、麩皮2 g，料層厚度2 cm且無光照、培養(yǎng)溫度為20 ℃、料水比1∶1.5。

綜上所述，冬蟲夏草的固體發(fā)酵技術報道較少，碳源對菌絲體生物量的影響較小，碳源用葡萄糖、玉米粉、大米和麩皮，氮源對菌絲體生物量的影響較大，動物性氮源優(yōu)于植物性氮源，而且添加蝙蝠蛾科幼蟲相似的動物性氮源效果最好，發(fā)酵溫度為20～25 ℃且無光照、適宜無機鹽添加量有利于菌絲體生長，料水比各有差異，但均趨向于料水比為1∶1.5。雖然冬蟲夏草菌固體發(fā)酵技術取得了好的進展，但研究大多以菌絲體生物量為指標考察發(fā)酵參數，以冬蟲夏草菌功能成分為指標的研究很少，有研究者從廢棄的蛹蟲草大米培養(yǎng)基中提取得到蟲草素并進行了純化工藝的研究[25]，為冬蟲夏草固體發(fā)酵產有效成分的開發(fā)利用開辟了新的途徑，而目前沒有利用中國被毛孢侵染蝙蝠蛾科幼蟲獲得功能成分的研究，亦希望相關研究能在這一方面取得突破。

3 液體發(fā)酵技術

液體發(fā)酵具有生產周期短、發(fā)酵產物易于開發(fā)利用、發(fā)酵參數易于控制、生產效率高等優(yōu)點。而以菌絲體生物量為指標的液體發(fā)酵多，功能成分為指標的研究很少。

以冬蟲夏草頭孢菌為原料的液體發(fā)酵較多。鐘士清等[26]以冬蟲夏草頭孢菌改良菌株A10為原料，以菌絲體生物量為指標，優(yōu)化發(fā)酵條件：葡萄糖4%、酵母粉1%、MgSO4·7H2O 0.05%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%，發(fā)酵溫度為26～28 ℃，pH 5.0～7.0，接種量為5%，菌絲體對溶氧量要求不高，試驗中轉速為200 r/min；陳濟琛等[27]以冬蟲夏草頭孢菌為原料，在1%葡萄糖中分別加入2%玉米粉、2%麩皮、20%馬鈴薯，以2%米糠為空白對照，pH6.0～7.0，含有2%麩皮培養(yǎng)基中菌絲體生物量最大；楊淑全等[28]配制4種液體培養(yǎng)基，以菌絲體干質量為指標，于25 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)9 d后測菌絲體干質量，確定D組比其他組的菌絲體干質量顯著增加，D組培養(yǎng)基組分為葡萄糖2.5%、玉米漿0.5%、酵母粉0.5%、蛋白胨0.7%、CaCO30.15%、KH2PO40.15%、pH自然；趙潤等[29]以冬蟲夏草菌為原料，發(fā)酵溫度為24 ℃，發(fā)酵192 h后測菌絲體干質量，篩選出優(yōu)化培養(yǎng)基為蔗糖1.25%、葡萄糖1.25%、酵母粉0.0625%、蛋白胨0.02%、KH2PO40.025%、MgSO4·7H2O 0.0125%、VB10.0025%、pH自然；吳彩琴等[30]以菌絲體干質量為指標，篩選出最佳發(fā)酵條件為溫度26 ℃、接種量5%、發(fā)酵時間為4 d、溶氧條件為1 L/min。

以中國被毛孢為原料的液體發(fā)酵研究較少。王祖華等[31]以青海采集的冬蟲夏草菌索提取得到的冬蟲夏草菌為原料，經形態(tài)學鑒定為中國被毛孢，在20 ℃發(fā)酵192 h測干質量，篩選出最佳發(fā)酵條件為蔗糖7.5%、葡萄糖7.5%、酵母粉0.375%、蛋白胨0.12%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.075%、VB10.015%、pH自然；劉欣等[32]從青海野生冬蟲夏草中分離得到冬蟲夏草菌，經中科院微生物所鑒定為中國被毛孢，以菌絲體干質量為指標，在18 ℃、120 r/min、pH6.8條件下，篩選出最佳培養(yǎng)基組分：葡萄糖2.71%、牛肉水60%、蛋白胨20%、KH2PO40.23%，氮源和碳源均對菌絲體生物量有正效應，氮源含量＞60%，KH2PO4對菌絲體生物量為負效應，應適當添加，效應大小依次為：牛肉水＞蛋白胨＞葡萄糖；DONG C H等[33-34]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有蔗糖、維生素B、鋅、鈣及碳氮比12∶1條件下最有利于菌絲體生長，培養(yǎng)溫度為15～18 ℃，超過25 ℃便停止生長。

綜上所述，氮源和碳源對菌絲體生物量都有正效應，氮源的影響大于碳源的影響，適宜碳源為葡萄糖和其他碳源的復合碳源，氮源為酵母粉和蛋白胨復合氮源，鋅、鈣、VB1能促進菌絲體生長，KH2PO4對菌絲體生物量有負效應，應適宜添加，液體發(fā)酵溫度為20～28 ℃，僅少數研究報道15～18 ℃且＞25 ℃停止生長、＞30 ℃菌株死亡，轉速為120～150 r/min，發(fā)酵pH值為5.0～7.0。提高蟲草素含量的方法較多，除了改善發(fā)酵條件外，添加蟲草素合成的前體物及其協(xié)同氨基酸[35-36]、激發(fā)子等可顯著提高蟲草素產率[37]。而在有性型人工培育方面，蛹蟲草全世界分布廣泛且可人工大范圍栽培，冬蟲夏草人工栽培尚未成功，兩者功能成分的差異決定人工栽培的成功與否是需要明確的關鍵問題之一。曲鴻雁等[38]利用冬蟲夏草和蛹蟲草融合子進行了發(fā)酵試驗，從該研究可拓展冬蟲夏草有性型人工培育的新思路，是否可利用中國被毛孢和滅活的蛹蟲草菌復合體以補充中國被毛孢功能成分，進行冬蟲夏草有性型人工培養(yǎng)測試。

4 展望

（1）冬蟲夏草發(fā)酵技術的評價指標體系尚不成熟，以菌絲體干質量或發(fā)酵產物中單一有效成分作為評價指標，無法全面系統(tǒng)的評價發(fā)酵技術，而且以不同菌株為發(fā)酵原料，篩選出的最佳發(fā)酵條件會有很大差異，因此，冬蟲夏草發(fā)酵技術的評價指標體系有待進一步完善。

（2）在有效成分開發(fā)利用方面，液體發(fā)酵有著諸多優(yōu)勢，對核苷類、甾醇、蛋白類等有效成分的開發(fā)利用有很大的幫助，冬蟲夏草菌液體發(fā)酵產有效成分的研究成為其資源開發(fā)利用的趨勢，而蛹蟲草菌有望取代冬蟲夏草菌，成為更可靠、高效的產有效成分的液體發(fā)酵原料。

（3）雖然發(fā)酵技術作為冬蟲夏草資源開發(fā)利用的有效途徑，但期望有關研究能取得重大突破，人工培育出冬蟲夏草有性型。

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