不同采收期老翹中化學(xué)成分含量測定

王進(jìn)明，范圣此，趙艷，陳婷婷，孫斌，楊霞

（山西振東道地藥材開發(fā)有限公司，山西長治047100）

老翹為木犀科植物連翹 [Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]的干燥果實(shí)，果實(shí)熟透時(shí)采收，曬干，除去雜質(zhì)，習(xí)稱“老翹”[1]。連翹為常用大宗藥材品種以及被列為國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種，其化學(xué)成分復(fù)雜多樣，其中主要是苯乙醇及其苷（連翹酚、連翹苷及連翹酯苷 A、B、C、D、E 等）、木質(zhì)素類（2，3-二芐基丁內(nèi)酯型木脂素、辛烷型木脂素等）、黃酮類（槲皮素、蘆丁、異槲皮素等）、五環(huán)三萜類（白樺酯酸、齊墩果酸、熊果酸等）、生物堿（物堿suspensineA（1）、（-）-7′-O-methylege 等）及揮發(fā)油[2]等。連翹具有清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱之功效[3-5]，也是預(yù)防和治療非典型性肺炎、禽流感、甲型H1N1流感等流行性疾病的主要成分。雖然以前的一些研究學(xué)者對老翹中連翹苷、連翹酯苷A的含量也有些研究，但是他們的研究未明確定義老翹樣品采集時(shí)間與取樣方式（如市場購買、山上采集等）等，也沒有對老翹在某個(gè)時(shí)期內(nèi)的含量變化進(jìn)行整體研究比較；此外，老翹的采收期延遲或提前、采收標(biāo)準(zhǔn)不一，導(dǎo)致老翹品質(zhì)也無法界定，而這些現(xiàn)象在出現(xiàn)如流感等流行性疾病導(dǎo)致老翹價(jià)格攀升的年份則尤為嚴(yán)重，老翹采收期和采收標(biāo)準(zhǔn)的不確定造成其品質(zhì)差異較大，這必然導(dǎo)致以老翹為原料的中成藥投料受到影響，進(jìn)而影響到中成藥制劑的療效。該研究比較了不同采收期老翹果實(shí)中連翹酯苷A、連翹苷及浸出物的含量，旨在為中藥老翹的質(zhì)量控制和老翹適宜采收期的確定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)下N。老翹樣品于2012年10月10日開始采集于山西振東集團(tuán)定植的36株連翹植株，至2013年3月15日結(jié)束合計(jì)采集11次樣品，每次采集樣品的時(shí)間間隔為10 d，并且以固定的每12株為一個(gè)混合試驗(yàn)樣品。連翹植株經(jīng)山西大學(xué)張立偉教授鑒定為木犀科植物連翹 [Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl]。

1.1.2 儀器與試劑。Aglient1260高效液相色譜儀（四元泵，紫外檢測器，在線脫氣機(jī)，柱溫箱）；BSA124S電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；HY-3A多功能調(diào)速振蕩器（江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；FW80高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

試驗(yàn)用水為雙蒸水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；連翹苷對照品（批號(hào)：110821-201112，含量為96.8%）、連翹酯苷A對照品（批號(hào)：111810-201103，含量為92.9%），供含量測定用，均購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 方法

1.2.1 條件。色譜柱為Luna5uC18（2）100A（250 mm×4.6 mm，5 μm），連翹苷測定流動(dòng)相為乙腈-水（25∶75，V∶V），檢測波長為 277 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min；連翹酯苷A測定流動(dòng)相為乙腈-0.4%冰醋酸溶液（15∶85，V∶V），檢測波長為 330 nm，柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min。HY-3A多功能調(diào)速振蕩器頻率為125 Hz。

1.2.2 對照品溶液的制備。精密稱取連翹苷對照品11.47 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；精密稱取連翹酯苷A對照14.97 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（臨用配制）。

1.2.3 供試品溶液的制備。連翹苷供試品溶液制備：取老翹不同采收期樣品粉末（過三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 mL，稱定重量，浸漬過夜，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）25 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，蒸至近干，加中性氧化鋁0.5 g拌勻，轉(zhuǎn)移至中性氧化鋁柱（100～120 目，1 g，內(nèi)徑為 1.0～1.5 cm）上，用 70%乙醇 80 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

連翹酯苷A供試品溶液制備：取老翹不同采收期樣品粉末（過三號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇15 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 線性關(guān)系考察。分別精密量取濃度為1.110 30 mg/mL的連翹苷、1.390 71 mg/mL連翹酯苷A對照品溶液 3、5、8、10、12、15 μL 進(jìn)樣分析，測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得連翹苷回歸方程為（y=2219.4x+591.86，R2=0.9997），表明連翹苷進(jìn)樣量在3.33～13.32 μg具有良好的線性關(guān)系；連翹酯苷A回歸方程為（y=1 771x+599.59，R2=0.999 7），線性范圍在 4.17～6.69 μg具有良好的線性關(guān)系。

1.2.5 精密度試驗(yàn)。精密吸取對照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，連翹苷峰面積的RSD為0.8%，連翹酯苷A峰面積的RSD為0.1%，表明該方法的精密度良好。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)。取供試品（同一批號(hào)），按供試品溶液的制備方法制備6份供試液，分別進(jìn)樣10 μL，連翹苷的RSD結(jié)果為1.6%，連翹酯苷A的RSD結(jié)果為0.3%。

1.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取同一種供試品溶液在0、4、6、8、10、12 h 內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣 6 次，每次 10 μL，計(jì)算連翹苷峰面積的RSD值為1.5%，連翹酯苷A的峰面積為0.2%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.8 加樣回收率試驗(yàn)。取已測含量的供試品溶液5份，分別精密加入定量的連翹苷、連翹酯苷A對照品，依法測定其結(jié)果見表1～2。

表1 連翹苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 連翹酯苷A加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

1.2.9 樣品測定。取需要測定供試品，按照第“1.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，依法測定，以外標(biāo)法計(jì)算測定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期老翹中連翹酯苷A測定結(jié)果

由表3可以看出，老翹中連翹酯苷A的含量在2012年10月10日采集的樣品中最高，為2.44%，2013年2月25日的樣品最低，為0.16%，同時(shí)在2012年12月30日以前的樣品中連翹酯苷A的含量都達(dá)到了中華人民共和國2010版藥典標(biāo)準(zhǔn)0.25%的規(guī)定，在以后的幾個(gè)樣品測定結(jié)果中，連翹酯苷A的含量則達(dá)不到藥典的標(biāo)準(zhǔn)。從整個(gè)采集老翹樣品中連翹酯苷A含量的測定結(jié)果來看，其含量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

表3 不同采收期老翹中連翹酯苷A、連翹酯苷及浸出物含量%

2.2 不同采收期老翹中連翹苷測定結(jié)果

由表3可以看出，連翹苷從老翹樣品采集開始到采集結(jié)束的測定結(jié)果中均達(dá)不到2010版中華人民共和國藥典不得低于0.15%標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，這與侯莉等[9]采用RP-HPLC法測定不同來源連翹藥材中連翹苷的含量試驗(yàn)結(jié)果中連翹苷含量普遍低于2000版藥典規(guī)定的0.15%結(jié)果相一致。在該試驗(yàn)測定結(jié)果中連翹苷含量最高的僅為0.108%，最低的為0.039%，同時(shí)在整個(gè)老翹采收樣品試驗(yàn)測定結(jié)果中，雖然2012年11月—2013年1月的幾個(gè)樣品中連翹苷含量測定趨于平穩(wěn)，但是從整體試驗(yàn)測定結(jié)果的趨勢上看，老翹中連翹苷則呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

2.3 不同采收期老翹中浸出物測定結(jié)果

由表3可以看出，老翹采收樣品中浸出物的測定結(jié)果在2013年1月20日之前采收均達(dá)到了2010版中華人民共和國藥典規(guī)定不得少于16%的規(guī)定，浸出物含量最高的為2012年10月10日采收的25.32%，最低的為2013年2月25日采收的樣品，為15.63%，而且從整個(gè)老翹采集樣品測定結(jié)果中可看出浸出物的含量變化與連翹苷、連翹酯苷A同樣呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。

3 結(jié)論與討論

老翹為連翹果實(shí)熟透時(shí)采收、曬干、除去雜質(zhì)的產(chǎn)品。而長期以來無論是研究學(xué)者還是連翹主產(chǎn)區(qū)采收時(shí)間與農(nóng)忙季節(jié)的沖突，在老翹采收的時(shí)間上都沒有明確的研究結(jié)果或標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，有些產(chǎn)地老百姓在老翹的采收時(shí)間上從每年的10月份以后持續(xù)到第2年的連翹開花之前，而這種現(xiàn)象特別是在遇到流感年份導(dǎo)致老翹價(jià)格大幅上漲時(shí)尤為突出，同時(shí)老百姓經(jīng)常會(huì)將往年不能及時(shí)采集、漏采的老翹以及多年由于價(jià)格影響沒有出售的老翹摻入新老翹中出售，其中不乏有些百姓遇到高價(jià)格年份時(shí)摻入連翹枝條出售，而以上這些現(xiàn)象直接導(dǎo)致老翹品質(zhì)沒有一個(gè)統(tǒng)一的考察標(biāo)準(zhǔn)，老翹質(zhì)量混亂，從而影響到以老翹為原料的中成藥療效，因此，對老翹的采收期和品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)等研究迫在眉睫[6]。

（1）從以上所有老翹樣品中連翹苷、連翹酯苷A、浸出物3種成分含量的測定結(jié)果看，連翹酯苷A與浸出物2種成分在某一個(gè)時(shí)期內(nèi)均達(dá)到了2010版中華人民共和國藥典的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，而連翹苷卻在整個(gè)采收試驗(yàn)含量測定結(jié)果中始終沒有達(dá)到藥典的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，這表明對老翹的品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，連翹苷也許已經(jīng)不能作為老翹品質(zhì)的一個(gè)重要質(zhì)控指標(biāo)，同時(shí)需對正在修訂的2015版中華人民共和國藥典中老翹的品質(zhì)評(píng)價(jià)進(jìn)行重新修訂。連翹酯苷A不但是從連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌活性最強(qiáng)的成分之一，同時(shí)也是連翹的主要特征性成分[7-8]，在評(píng)價(jià)連翹及以抗菌為主要功效的制劑質(zhì)量時(shí)發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A優(yōu)于連翹苷，因此建議在對老翹進(jìn)行品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)控時(shí)應(yīng)以連翹酯苷A和浸出物2種評(píng)價(jià)指標(biāo)為主進(jìn)行評(píng)價(jià)，或采用多指標(biāo)成分進(jìn)行老翹質(zhì)量的評(píng)價(jià)更為合適[9]。

（2）從該試驗(yàn)結(jié)果看，老翹中的連翹苷含量在整個(gè)采收期的試驗(yàn)結(jié)果中均沒有達(dá)到2010版藥典的規(guī)定，如果僅從老翹中連翹酯苷A和浸出物含量這2個(gè)指標(biāo)來考察老翹的品質(zhì)，則老翹的采收期應(yīng)該為每年的10月—11月下旬，但在此時(shí)期內(nèi)百姓由于受秋季農(nóng)作物收獲的影響，延遲老翹的采收期，同時(shí)也會(huì)因延長采收期而給上山采摘人員帶來一定的危險(xiǎn)。

（3）在筆者試驗(yàn)期間常出現(xiàn)降雨、降雪等現(xiàn)象，而該期的老翹也將要開裂或已開裂，這種現(xiàn)象是否為雨水對老翹內(nèi)部的浸透提供了便利，從而影響到老翹中連翹苷、連翹酯苷A、浸出物3種成分含量的降低，以及這3種成分的含量測定結(jié)果在后期出現(xiàn)不同程度的升高后又降低是否與降雪有關(guān)，仍需進(jìn)一步的研究確定。

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