尖嘴林檎葉的化學成分

盧 靜， 楊豐慶， 夏之寧

(重慶大學 化學化工學院，重慶400044)

林檎，屬于薔薇科蘋果屬植物。據《中國植物志》［1］的分類，目前我國分布的有尖嘴林檎Malus melliana (Hana-Mazz)Rehd 和臺灣林檎Malus formosana (Kawak，Kooidz)Kawak，主要分布于我國江西、湖南、福建、廣西、云南、貴州及臺灣等地區(qū)。廣西所謂的“大果山楂”、“廣山楂”、湖南江華俗稱的“冬梨子”和蘭山俗稱的“花紅”均屬臺灣林檎［2］。

林檎葉中含有許多有益人體健康的營養(yǎng)成分(蛋氨酸，蘇氨酸，維生素C 及維生素E 等)［3］，以及黃酮類、甾醇類、萜類、皂苷和有機酸等多種化學成分［4］，具有防癌、降壓、抗氧化、保肝［5］、提高免疫［6］等多種功效，并對一些細菌、霉菌和酵母有抑制作用［7］。在我國廣西、湖南等省(區(qū))地區(qū)和少數民族地區(qū)群眾有利用林檎葉作茶飲的習慣，從1988 年起，就已有多個科研項目對其進行過研究，并加工制作了林檎保健茶、東力神保健茶和林檎保健茶系列飲料產品［8］，但產品仍未得到廣泛的推廣和利用。我國林檎葉資源廣闊，價格低，但利用率不高。目前國內對林檎葉進行的相關研究也主要集中在開發(fā)其保健功能方面，對其植物化學方面的研究較少，不清楚其主要化學成分，且不明確發(fā)揮活性作用的化學物質，未能得到很好的推廣和應用。

本課題組已經通過過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARS)模型測定了林檎葉石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水提醇沉及水提物去多糖這5 個粗提物部位的PPARS 活性，實驗結果表明林檎葉乙酸乙酯部位的PPARβ 與PPARγ 活性約為陽性藥0.9倍，有較好的抗糖尿病作用。另外，本課題組還利用AB-8 大孔吸附樹脂富集純化林檎葉總黃酮，結合DPPH 自由基清除法和鐵離子還原能力法測定了總黃酮的抗氧化能力，實驗結果表明林檎葉總黃酮與維生素c 相比有明顯的抗氧化活性。因此為尋找林檎葉的活性成分，本實驗對廣西柳州市售的尖嘴林檎干燥葉進行了化學成分的研究，從乙酸乙酯部位分離得到9 個化合物，其中有2 個甾醇類化合物，3 個五環(huán)三萜類化合物和4 個黃酮類化合物。9 個化合物均為首次從該植物中分離得到，并根據實際分離得到的單體化合物的量計算(化合物的質量/干燥葉的質量)，推測根皮苷(約5.3‰)與三葉苷 (約3.3‰)為尖嘴林檎葉的主要化學成分。

1 儀器和材料

X-4 型顯微熔點儀(上海精密科學儀器有限公司);川儀LC-900B 型高效液相色譜儀;薄層硅膠(GF254，青島海洋化工有限公司);Sephadex LH-20 凝膠(德國merk);柱色譜用硅膠均購至青島裕民源硅膠試劑廠;Bruker Avance 500 型核磁共振(1H-NMR 和13C-NMR)譜儀，TMS 為內標;試劑均為分析純。

尖嘴林檎干燥葉于2010 年10 月購于廣西柳州市融水縣市場，經重慶市中藥研究院生藥室秦松云副研究員鑒定為尖嘴林檎Malus melliana (Hana-Mazz)Rehd. 的干燥葉。

2 提取與分離

剪碎的干燥林檎葉750 g，石油醚60 ℃回流提取3 次(每次1 h)，料液比1 ∶8。殘渣用70%乙醇水溶液80 ℃回流提取3 次(每次1 h)。合并提取液，減壓濃縮得浸膏200 g，浸膏再用乙酸乙酯萃取4 次。各部分經減壓濃縮，得石油醚部分10.0 g，乙酸乙酯部分150.0 g。取乙酸乙酯部分浸膏140.0 g，經硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，按照TLC 特征合并相似成分，共得12 個餾分(Fr.1-Fr.12)。Fr.3 靜置一段時間后析出白色針狀結晶，多次結晶得化合物1(50 mg)，剩余部分經過重復硅膠柱分離得到化合物2 (15 mg);Fr.4 經熱甲醇溶解后，分為可溶部分和沉淀部分，再分別對這兩部分進行硅膠柱分離及用95%乙醇反復結晶得到化合物3 (70 mg)和4 (200 mg)，化合物3、4 為同分異構體;Fr.6 經重復硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯洗脫(7 ∶3)，得到化合物5 (20 mg);Fr.7 經硅膠柱色譜分離后得到Fr.7 (A-E)5 個部分，其中Fr.7D經Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫得化合物6 (30 mg);Fr.9 采用硅膠柱分離，以石油醚-乙酸乙酯 (1 ∶1)到100%乙酸乙酯梯度洗脫，得6 個餾分Fr.9 (AF)，Fr.9B 經重復硅膠柱色譜分離得化合物7 (約4.0 g)，Fr.9E 經重復硅膠柱色譜分離得化合物8(約2.5 g)，化合物7、8 為同分異構體;Fr.10 經多次Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇(1 ∶1)洗脫得化合物9 (25 mg)。

3 結構鑒定

化合物1:白色粉末，mp 139 ～141 ℃。13CNMR (125 Hz，CDCl3)δ:37.4 (C-1)，26.2 (C-2)，72.0 (C-3)，42.4 (C-4)，140.9 (C-5)，121.9(C-6)，33.9 (C-7)，31.8 (C-8)，50.3 (C-9)，36.7 (C-10)，21.3 (C-11)，40.0 (C-12)，42.5(C-13)，56.9 (C-14)，24.5 (C-15)，29.3 (C-16)，56.2 (C-17)，19.2 (C-18)，12.0 (C-19)，36.3 (C-20)，18.4 (C-21)，32.1 (C-22)，28.4(C-23)，46.0 (C-24)，29.3 (C-25)，12.2 (C-26)，19.6 (C-27)，23.2 (C-28)，19.0 (C-29)。以上數據與文獻［9］報道的基本一致，故確定化合物1 為β-谷甾醇.

化合物2:白色粉末，mp 276 ～278 ℃。1HNMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.32 (1H，s，H-6)為烯氫質子，4.21 (1H，d，J=7.5 Hz，H-1')為糖上端基質子，3.11 (1H，q，J = 4.7 Hz，H-4')，3.04 (2H，q，J =5.0 Hz，H-3'，2')，2.88 (1H，m，H-5')分別為葡萄糖環(huán)上質子，3.42 (1H，dd，J=5.2，10.8 Hz，H-6')，3.41 (2H，m，H-6')為葡萄糖C-6'上質子信號，3.63 (1H，m，H-3α);0.64，0.95 分別為兩個甲基單峰。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:36.8 (C-1)，29.3 (C-2)，76.9(C-3，C-5')，41.8 (C-4，C-13)，140.4 (C-5)，121.2 (C-6)，31.4 (C-7，8)，49.6 (C-9)，36.2(C-10)，20.6 (C-11)，38.3 (C-12)，56.2 (C-14)，23.9 (C-15)，27.8 (C-16)，55.4 (C-17)，11.7 (C-18)，19.1 (C-19)，35.5 (C-20)，18.6(C-21)，33.3 (C-22)，25.4 (C-23)，45.1 (C-24)，28.7 (C-25)，19.7 (C-26)，18.9 (C-27)，22.6 (C-28)，11.8 (C-29)，100.8 (C-1')，73.4(C-2')，76.7 (C-3')，70.0 (C-4')，76.9 (C-5')，61.0 (C-6')。以上數據與文獻［10-11］報道的基本一致，故確定化合物2 為胡蘿卜苷。

化合物3:白色粉末，mp 308 ～310 ℃，香草醛-濃硫酸顯紅色。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.12 (1H，br s，H-12)為一個三取代烯鍵信號，2.99 (1H，t，J =4.5 Hz，H-3)，2.10 (1H，d，J=11.5 Hz，H-18)，1.03 (3H，s，H-27)，0.91 (3H，d，J=7.5 Hz，H-30)，0.89 (3H，s，H-23)，0.86(3H，s，H-25)，0.81 (3H，d，J=6.5 Hz，H-29)，0.74 (3H，s，H-26)，0.67 (3H，s，H-24)為7 個甲基氫信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:38.4(C-1)，27.0 (C-2)，76.8 (C-3)，38.5 (C-4，-8)，54.8 (C-5)，17.0 (C-6)，36.3 (C-7)，52.4 (C-9)，38.3 (C-10)，18.0 (C-11)，124.6 (C-12)，138.2 (C-13)，41.6 (C-14)，27.6 (C-15)，21.1(C-16)，47.0 (C-17)，39.1 (C-18)，46.8 (C-19)，36.5 (C-21)，30.2 (C-22)，28.3 (C-23)，16.1 (C-24)，15.2 (C-25)，16.9 (C-26)，23.8(C-27)，178.3 (C-28)，32.7 (C-29)，23.3 (C-30)。以上數據與文獻［12］報道的基本一致，故確定化合物3 為齊墩果酸。

化合物4:白色粉末，mp 287 ～288 ℃，香草醛-濃硫酸顯紅色。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.12 (1H，br s，H-12)為一個三取代烯鍵信號，2.99 (1H，t，J=4.5 Hz，H-3)，2.10 (1H，d，J=11.5 Hz，H-18)，1.03 (3H，s，H-27)，0.91 (3H，d，J=7.5 Hz，H-30)，0.89 (3H，s，H-23)，0.86(3H，s，H-25)，0.80 (3H，d，J=6.5 Hz，H-29)，0.74 (3H，s，H-26)，0.67 (3H，s，H-24)為7 個甲基氫信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:38.3(C-1 )，27.0 (C-2)，76.9 (C-3)，38.4 (C-4)，54.8 (C-5)，18.0 (C-6)，30.2 (C-7 )，39.1 (C-8)，47.0 (C-9)，36.6 (C-10)，23.8 (C-11)，124.6 (C-12)，138.2 (C-13)，41.6 (C-14)，32.7(C-15)，22.9 (C-16)，46.8 (C-17)，52.4 (C-18)，38.5 (C-19)，39.0 (C-20)，27.6 (C-21)，36.3 (C-22)，28.3 (C-23)，16.9 (C-24)，16.1(C-25)，15.2 (C-26)，23.3 (C-27)，178.3 (C-28)，17.0 (C-29)，21.1 (C-30)。以上數據與文獻［13］報道的基本一致，故確定化合物4 為熊果酸。

化合物5:白色粉末(CH2Cl2-MeOH)，mp 175～176 ℃，香草醛-濃硫酸顯紅色。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:5.23 (1H，br s，H-12)為一個三取代烯鍵信號，3.12 (1H，t，J =4.5 Hz，H-3)，2.17 ～2.23 (1H，m，H-18)，0.67 (3H，s，H-24)，0.71 (3H，s，H-26)，0.88 (3H，s，H-25)，0.90(3H，s，H-23)，0.92 (3H，d，J =7.5 Hz，H-30)，1.24 (3H，s，H-27)，0.84 (3H，d，J =12.0 Hz，H-29)為7 個甲基氫信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:44.7 (C-1)，67.1 (C-2)，82.2 (C-3)，37.8 (C-4)，54.9 (C-5)，18.2 (C-6)，32.4 (C-7)，41.2 (C-8)，47.3 (C-9)，37.8 (C-10)，23.2(C-11)，122.2 (C-12)，143.5 (C-13)，41.2 (C-14)，28.4 (C-15)，23.2 (C-16)，46.7 (C-17)，43.2 (C-18)，80.1 (C-19)，34.9 (C-20)，28.8(C-21)，32.3 (C-22)，24.4 (C-23)，24.1 (C-24)，16.2 (C-25)，17.0 (C-26)，27.2 (C-27)，179.2 (C-28)，24.5 (C-29)，24.1 (C-30)。以上數據與文獻［14］報道的基本一致，故確定化合物5 為阿江酸。

化合物6:淡黃色棱柱行結晶(甲醇)，mp 285 ～286 ℃。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:8.06(2H，d，J = 7.5 Hz，H-2'，H-6' )，7.55 ～7.62(3H，m，H-3'，H-4'，H-5')，6.96 (1H，s，H-3)，6.52 (1H，s，H-8)，6.22 (1H，s，H-6)。13C-NMR(125 Hz，DMSO-d6)δ:163.2 (C-1)，105.2 (C-3)，181.9 (C-4)，161.5 (C-5)，99.0 (C-6)，164.5 (C-7)，94.1 (C-8)，157.5 (C-9)，104.0(C-10)，130.7 (C-1 )，126.4 (C-2 ，C-6 )，129.2(C-3 ，C-5 )，132.0 (C-4 )。以上數據與文獻［15］報道的基本一致，故確定化合物6 為白楊素。

化合物7:淡黃色針狀結晶，mp 113 ～114 ℃。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:2.80 (2H，t，J =7.5Hz，H-β)，3.19-3.74 (8H，m，glucose H and H-α)，4.95 (1H，d，J = 7.5 Hz，anomeric H)，4.62 (1H，t，J =6.0 Hz，carbohydrate OH)，5.07(1H，d，J=5.5 Hz，carbohydrate OH)，5.17 (1H，d，J = 4.0 Hz，carbohydrate OH)，5.31 (1H，d，J=5.0 Hz，carbohydrate OH)，5.95 (1H，d，J =2.0 Hz，H-5')，6.15 (1H，d，J=2.0 Hz，H-3')，6.66 (2H，d，J =8.0 Hz，H-3，H-5)，7.05 (2H，d，J=8.5 Hz，H-2，H-6，9.11，10.59 (2 br s，phenolic OH )，13.53 (s，6-OH)。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:131.6 (C-1)，129.3 (C-2，C-6)，115.1 (C-3，C-5)，155.3 (C-4)，45.1 (C-α)，29.1 (C-β)，105.2 (C-1')，160.9 (C-2')，96.9(C-3')，165.5 (C-4')，94.4 (C-5')，164.5 (C-6')，204.8 (CC =O)，100.9 (CG-1)，73.3 (CG-2)，76.8 (CG-3)，69.5 (CG-4)，77.3 (CG-5)，60.6 (CG-6)。以上數據與文獻［16］報道的基本一致，故確定化合物7 為根皮苷。

化合物8:白色針狀結晶，mp 168 ～169 ℃。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:6.97 (2H，d，J =8.5 Hz，H-2，H-6)，6.62 (2H，d，J =8.5 Hz，H-3，H-5 )，6.10，5.92 (2H，2s，H-3'，H-5')，4.96(1H，d，J=7 Hz，anomeric H)，3.16 ～3.73 (8H，m，glucose H and H-α)，3.92，3.94，3.95，3.96(4H，4s，carbohydrate OH)，2.74 (2H，t，J =7.0 Hz，H-β)。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:133.3(C-1)，130.5 (C-2，C-6)，155.6 (C-4)，116.6(C-3，C-5)，46.0 (C-α)，30.1 (C-β)，206.5(CC= O)，106.6 (C-1')，166.2 (C-2'，C-6')，95.5 (C-3'，C-5')，165.1 (C-4')，101.2 (CG-1)，74.1 (CG-2)，77.4 (CG-3)，70.5 (CG-4)，77.6(CG-5)，62.7 (CG-6)。以上數據與文獻［17］報道的基本一致，故確定化合物8 為三葉苷。

化合物9:黃色粉末，沒有確定的熔點，260 ℃以上變黑。1H-NMR (500 Hz，DMSO-d6)δ:11.23(1H，br s，5-OH);9.68 (1H，br s，7-OH)，9.30(2H，br s，2'-OH，4'-OH)，7.41 (1H，s，H-6')，7.20 (1H，d，J=7.5 Hz，H-3)，6.82 (1H，d，J=8.0 Hz，H-3')，6.51 (1H，s，H-8)，6.39 (1H，s，H-6)，4.63 (1H，s，H-1″)，3.16 ～3.67 之間的多重峰為葡萄糖上的質子信號。13C-NMR (125 Hz，DMSO-d6)δ:167.4 (C-2)，116.1 (C-3)，178.8(C-4)，157.0 (C-5)，97.6 (C-6)，167.5 (C-7)，92.4 (C-8)，147.8 (C-9)，103.7 (C-10)，117.8(C-1')，145.6 (C-2')，110.8 (C-3')，145.7 (C-4')，124.4 (C-5')，123.5 (C-6')，99.7 (CG-1)，73.0 (CG-2)，76.6 (CG-3)，69.4 (CG-4)，77.2(CG-5)，60.5 (CG-6)。以上數據與文獻［18］報道的基本一致，故確定化合物9 為isoetin 5'-glucoside.

［1］ 中國科學院植物研究所數字植物項目組. 中國植物志:36卷［M］. 北京:科學出版社，1974:400-402.

［2］ 鄧毓芳，劉顯旋，鐘海雁，等. 林檎生物學特性及開發(fā)利用前景的研究［J］. 中南林學院學報，1996，16(4):24-27.

［3］ 曾曉雄，譚淑宜，羅澤民. 林檎葉保健茶主要化學成分分析［J］. 湖南農學院學報，1993，19(5):474-476.

［4］ 陳 勇，甄 漢，陸雪梅. 廣山楂主要化學成分的定量研究［J］. 中藥研究與信息. 2000，2(11):18-19，21.

［5］ 潘 瑩，張林麗. 大果山楂黃酮提取物對四氯化碳致大鼠慢性肝損傷的保護作用［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2008，19(2):318-319.

［6］ 李忠海，鐘海雁，魏元青，等. 林檎葉提取成分對小鼠免疫功能的影響［J］. 中南林學院學報，2003，23(4):28-31.

［7］ 鄧芳席，黃祖法. 林檎葉抑菌作用的研究［J］. 食品科學，1996，17(3):47-50.

［8］ 王融初，尚本清，黃祖法，等. 林檎葉的綜合利用研究［J］.湖南農學院學報. 1994，20(4):345-350.

［9］ 徐潤生，袁 珂，殷明文，等. 羽芒菊化學成分研究［J］.中草藥，2009，40(7):1015-1018.

［10］ 李文武，丁立生，李伯剛. 苧麻根化學成分的初步研究［J］. 中國中藥雜志，1996，21(7):427-428.

［11］ 陳國慶，劉艷麗，謝 茜，等. 苧麻根化學成分研究［J］.中草藥，2009，40(5):683-686.

［12］ Werner S，Nebojsa S，Weis R，et al. Complete assignments of1H and13C-NMR resonances of oleanolic acid，18a-oleanolic acid，ursolic acid and their 11-oxo derivatives［J］. Magn Reson Chem，2003，41(8):636 -638.

［13］ Silva M G，Vieira I P，Mendes F P，et al. Variation of ursolic acid content in eight Ocimum species from northeastern Brazil［J］. Molecules，2008，13(10):2482-2487.

［14］ 李延芳，胡立宏，樓鳳昌. 野薔薇根化學成分的研究［J］.中國藥學雜志，2003，38(5):336-338.

［15］ Chen L J，David E G，Jonathan J. Isolation and identification of four flavonoid constituents from the seeds of Oroxylum indicum by high-speed counter-current chromatography［J］. J Chromatogr A，2003，998(1):95-105.

［16］ Dick A J，Redden P R，DeMarco A C，et al. Flavonoid glycosides of Spartan Apple Peel［J］. J Agric Food Chem，1987，35(4):529-531.

［17］ 肖坤福，廖曉峰. 多穗柯黃酮類化合物的分離及鑒定［J］.林產化學與工業(yè)，2006，23(3):85-87.

［18］ Marco J A，Barbera O，Rodriguze S，et al. Flavonoids and other phenolics from Artemzsia Hispanica［J］. Phytochemistry，1988，27(10):3155-3159.