基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用

林豪蕓，吳文苑

微生物作為多數(shù)疾病或者感染的始作俑者，對它種屬的鑒定和診斷十分必要。微生物分型就是針對不同菌株的特點、表型及基因型的相似性和差異性，對它們進行鑒定和登記入冊；為了提高微生物鑒定分型的靈敏度、分辨率、可靠性、速度及成本效益等，其方法的不斷創(chuàng)新和發(fā)展是必須的。

質(zhì)譜分析技術(shù)（Mass Spectrometry，MS）是指帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比（或質(zhì)量）的大小順序排列的圖譜。樣品離子化是進行質(zhì)譜分析的前提，但經(jīng)典的離子源通過高溫或高能電子破壞樣品分子使之汽化，會導(dǎo)致大分子物質(zhì)產(chǎn)生不可預(yù)知的降解而失去分析意義。20世紀80年代后期發(fā)展的“軟電離”技術(shù)使得質(zhì)譜分析技術(shù)能夠用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，軟電離技術(shù)能夠保持大分子或分子復(fù)合物在研究分析過程中的完整性。

基質(zhì)輔助激光解吸／電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix－assisted laser desorption／ionization time－offlight mass spectrometry，MALDI－TOF MS）是近年來發(fā)展的一種軟電離新型有機質(zhì)譜，以檢測各種特異性片段重量來測定個體，它因其快速和可靠鑒定微生物這一強大功能在常規(guī)實驗室工作中得到微生物學(xué)家和臨床工作者的重視。它通過引入基質(zhì)分子，使待測分子不產(chǎn)生碎片，解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性生物大分子解吸離子化的問題。

1 MALDI－TOF MS的基本概況

1.1 MALDI－TOF MS基本組成與原理 MALDI－TOF MS儀器主要由兩部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（Matrix－assisted laser desorption／ionization，MALDI）和飛行時間質(zhì)量分析器（Time－of－flight，TOF）。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量使樣品解吸，樣品分子通過與基質(zhì)之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而得以電離；TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，因為離子的質(zhì)荷比（M／Z）與離子的飛行時間成正比，所以不同質(zhì)量的離子因到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，形成不同的質(zhì)量圖譜。根據(jù)不同細菌所特有的蛋白，應(yīng)用MALDI－TOF MS使細胞表面蛋白質(zhì)形成不同的模式峰，與人類病原體數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)指紋圖譜進行比較，從而對該微生物的類別進行鑒定，這是一種與傳統(tǒng)鑒定方法完全不同的新型鑒定手段。

1.2 MALDI－TOFMS中的基質(zhì)化合物在MALDI－TOF MS技術(shù)中基質(zhì)化合物是快速鑒定蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物分子，保持它們完整性的必要物質(zhì)?；|(zhì)溶液為溶劑混合物，通常由水、乙醇、甲醇、乙腈和強酸，如三氟乙酸等組成，基質(zhì)溶液應(yīng)有低分子量及低揮發(fā)性等特點，酸性的基質(zhì)因其能為樣品電離提供質(zhì)子而常被使用?；|(zhì)溶液可以滲透細胞壁，使胞內(nèi)蛋白質(zhì)得以分析。當細胞懸浮液中的溶劑蒸發(fā)時，基質(zhì)晶體開始形成，而其中的蛋白質(zhì)分子和其他細胞化合物嵌入當中，被稱為“共結(jié)晶過程”。在使用的基質(zhì)化合物中，大部分是有機的、小分子量的芳族羧酸，如苯甲酸或肉桂酸衍生物。當前常使用的兩種基質(zhì)溶液是：2，5－二羥基苯甲酸和氨基－4－羥基肉桂酸。這些基質(zhì)化合物被證明在大多數(shù)情況下適用于分析鑒定各類微生物，然而為了進一步擴大MALDI－TOF MS的應(yīng)用范圍，還需繼續(xù)開發(fā)應(yīng)用于特定領(lǐng)域的基質(zhì)化合物。

1.3 MALDI－TOF MS的數(shù)據(jù)庫 數(shù)據(jù)庫中所包含的可靠全面的參考物種數(shù)據(jù)是獲得準確微生物鑒定的先決條件。出于臨床目的的考量，數(shù)據(jù)庫中應(yīng)包含全部有關(guān)致病菌及各自密切相關(guān)的菌種。由于微生物在核苷酸序列、生化特性、質(zhì)譜指紋上通常顯有一定程度的種內(nèi)變異，所以挑選的物種應(yīng)代表多個菌株，即覆蓋自然多樣性的物種；另外，數(shù)據(jù)庫中收集的菌株光譜應(yīng)來自標準化培養(yǎng)條件下的菌株。微生物鑒定中的一個重要信息就是樣品峰值列表中的質(zhì)荷比及強度，即所謂的樣品的質(zhì)譜指紋圖譜。通過與數(shù)據(jù)庫進行比較，以微生物質(zhì)譜相似程度的效值作為微生物的質(zhì)譜比較結(jié)果。從效值清單列表中，獲得樣品的分類鑒定結(jié)果。目前因 MALDITOF MS數(shù)據(jù)庫不完善，對于某些類別的菌株可能會出現(xiàn)鑒定失誤的情況。所以數(shù)據(jù)庫的不斷發(fā)展是拓寬MALDI－TOF MS在微生物診斷領(lǐng)域應(yīng)用范圍的關(guān)鍵。

MALDI－TOF MS的數(shù)據(jù)庫可由實驗室內(nèi)部人員進行修改和編輯，數(shù)據(jù)庫市售軟件定期更新。它可以建立一個用戶菌株光譜交流的開放平臺以豐富自己的參考數(shù)據(jù)庫，MALDI－TOF MS系統(tǒng)的靈活性更有利于它在各領(lǐng)域的應(yīng)用。

2 MALDI－TOF MS相比傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢與局限性

2.1 MALDI－TOF MS的優(yōu)勢 目前，病原菌的鑒定方法分為兩大類：表型鑒定法和基因型鑒定法，前者是微生物鑒定的傳統(tǒng)手段。傳統(tǒng)鑒定方法可根據(jù)實際情況優(yōu)先選擇試驗項目，其靈活性高、成本較低、易于操作，至今仍在醫(yī)院中廣泛應(yīng)用，但鑒定周期較長（24～72h左右）、依賴性強、對實驗人員的專業(yè)素養(yǎng)要求較高，對一些疑難細菌的鑒定能力較為薄弱。而以基因型為主的鑒定方法，雖能從遺傳學(xué)及種系角度來對病原菌進行鑒定分類，但因為其專業(yè)性強、所需試劑和儀器昂貴等缺點，未能在各級別醫(yī)院中廣泛應(yīng)用。和臨床微生物鑒定的常規(guī)方法（例如API微生物鑒定條、VITEK 2全自動微生物分析系統(tǒng)）相比，盡管MALDI－TOF MS設(shè)備技術(shù)高端，但使用簡單，十分易于操作。

由于每種微生物都有其獨特的蛋白質(zhì)組成，與傳統(tǒng)方法依靠微生物生理生化特性不同，蛋白質(zhì)組成很少受到環(huán)境條件的影響，主要由遺傳特性所決定，因此MALDI－TOF MS更加準確與可靠。在眾多的方法之中，MALDI－TOF MS的一個主要優(yōu)點是其鑒定微生物的普遍性。它可以同時分析大量目標且不要求選擇特定的識別抗體或引物，而對發(fā)生基因變異的微生物，MALDI－TOF MS至少可以把他們鑒定到最近的鄰居數(shù)據(jù)庫中。利用MALDITOF MS，單個樣品的分析在30s之內(nèi)就可以完成，把維護和待機的時間考慮入內(nèi)，一臺儀器每天可以分析超過1 000個樣本。通過把樣品制備過程自動化還可以進一步提高效率。MALDI－TOF MS已在直接鑒定尿液標本上取得成功，J Laura Ferreira等人[1]的研究結(jié)果表明，利用 MALDI－TOF MS可以在短時間內(nèi)直接從尿液中鑒定出細菌，這種方法精度高，尤其適合革蘭陰性菌高度參與的情況下。對于菌血癥，應(yīng)用MALDI－TOF MS以血培養(yǎng)材料直接進行菌種鑒定被證明能顯著降低診斷時間（小于29h），使得在血培養(yǎng)陽性的第1個24h內(nèi)接受適當抗生素治療的患者增加11%[2]。這對傳統(tǒng)鑒定方法而言是不可能完成的。

MALDI－TOF MS能以最少量的樣品來快速測定蛋白質(zhì)的分子量。這種全新的、簡單的方法大大地降低了耗材成本和鑒定診斷時間。通過成本計算，MALDI－TOF MS的花費要低于常規(guī)的生化鑒定方法。隨著微生物的快速診斷，過去住院時間延長帶來的開銷和昂貴的經(jīng)驗性藥物治療費用將顯著減少。其可靠性和準確性已在多個研究報告中得以證明，不同的系統(tǒng)設(shè)備已在市場銷售。目前，擁有MALDI－TOF MS的有四家商業(yè)系統(tǒng)：the MALDI Biotyper（布魯克·道爾頓，德國不來梅），AXIMA＠SARAMIS數(shù)據(jù)庫（AnagnosTec，德國波茨坦和島津，德國杜伊斯堡），以及最近的Andromas（Andromas，巴黎，法國）和VITEK MS系統(tǒng)（生物梅里埃，法國）[3]。在臨床上尚未使用大量樣本對這4種商業(yè)系統(tǒng)進行評估比較，但已有研究表明MALDI Biotyper系統(tǒng)和VITEK MS系統(tǒng)鑒定能力相當[4]。

區(qū)分表型不同的亞種將會是MALDI－TOF MS運用于微生物診斷學(xué)的一個新思路。MALDI－TOF MS已經(jīng)能夠用于區(qū)分鑒定雙歧桿菌和弗蘭克氏菌的固氮菌株的新亞種。在一項研究中[5]，研究者發(fā)現(xiàn)MALDI－TOF MS能夠區(qū)分 和近平滑念珠菌中的有生物膜和無生物膜的兩種亞型。最近對沙門氏菌[6]，無乳鏈球菌、土拉弗朗西斯菌[7]、脆弱擬桿菌[8]、鮑曼不動桿菌[9]和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[10]的研究證明MALDI－TOF MS能在亞種水平上對它們進行鑒定。

在耐藥菌株檢測方面，MALDI－TOF MS正在探究關(guān)于β－內(nèi)酰胺酶活性的檢測[11]。如通過檢測碳青霉烯類抗生素及其降解產(chǎn)物，可以有效地鑒定樣本是否為碳青霉烯類耐藥菌株[12－13]，此方法大大縮短了檢測時間，是很有前景的檢測方法。Marie Kempf[14]等人的實驗第一次表明 MALDI－TOF MS可以用來快速準確地發(fā)現(xiàn)產(chǎn)碳青霉烯酶的鮑曼不動桿菌，以防止超級細菌不可控地爆發(fā)與傳播。

2.2 MALDI－TOF MS的局限性 MALDI－TOF MS被越來越多地應(yīng)用到微生物分類上，例如，Munoz等，利用 MALDI－TOF MS揭示了高鹽環(huán)境中嗜鹽細菌的生物多樣性，篩選識別出潛在的新物種。然而目前，MALDI－TOF MS并不能為某一特定菌株定義一個具體的分離該物種的閾值，因為即使同一種屬的微生物亦存在變化，所以常用與參考數(shù)據(jù)庫比較而得的效值作為鑒定結(jié)果。如使用MALDI Biotyper 2.0software時，當分值≥2時表示待測菌株被鑒定到種水平；分值在1.7和1.9之間時；表示被鑒定到屬水平，分值＜1.7時表示鑒定失敗。

另外，雖然MALDI－TOF MS已用于種水平上的區(qū)分鑒定，但對不同類群物種復(fù)合物中的亞種進行區(qū)分仍有不少局限性?，F(xiàn)階段對于潛在亞種的分類鑒定是有限的，樣品的進一步準備、數(shù)據(jù)分析的新方法及數(shù)據(jù)庫的不斷完善可能可以增加MALDITOF MS的分辨率水平。

雖然MALDI－TOF MS已能成功檢測碳青霉烯類耐藥菌株，但檢測其他細菌耐藥性機制的能力仍受限。早前已有研究表明MALDI－TOF MS能用于細菌耐藥性的檢測，然而現(xiàn)在大多數(shù)檢測依舊處在實驗階段。有研究人員使用MALDI－TOF MS快速檢測與MRSA耐藥機制密切相關(guān)的青霉素結(jié)合蛋白2a（Penicillin－binding protein 2a，PBP2a）。一些實驗發(fā)現(xiàn)甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（Methicillin－sensitive Staphylococcus Aureus，MSSA）和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin－esistant Staphylococcus Aureus，MARS）菌株蛋白質(zhì)譜之間存在差異，可所檢測到的差異不是由于PBP2a引起，而是由于金黃色葡萄球菌株的克隆性所致。所以MALDI－TOF MS可對來自不同病區(qū)或同一病區(qū)的不同病人MRSA的克隆來源進行區(qū)分，但不能正確地區(qū)分 MRSA和 MSSA。另外，由于 MALDITOF MS的質(zhì)量檢測范圍（2～20kDa）限制以及數(shù)據(jù)庫的缺乏，對于真菌耐藥性檢測仍在探索中。相信隨著MALDI－TOF MS技術(shù)的發(fā)展，其在病原菌的耐藥監(jiān)測方面會有更大的突破。

有研究已評價了使用MALDI－TOF MS分析混合樣品，鑒定各組成部分的能力。雖然通常2種或3種細菌存在于樣品中的數(shù)量類似時，各組分可以被分離和確定，但當混合物中某一個物種數(shù)量占強烈主導(dǎo)地位時，MALDI－TOF MS的鑒定能力明顯受限。另外，限制MALDI－TOF MS使用的另一個問題來自于人體質(zhì)譜信號的干擾，無法直接檢測來自人體無菌部位的樣品（如血液、腦脊液等標本）。血液中的血紅蛋白、白蛋白和血培養(yǎng)基中的活性炭等物質(zhì)會干擾菌株本身的質(zhì)譜，所以需要額外的凈化提取步驟。目前已嘗試使用不同方法如差速離心或吸收干擾物質(zhì)等使得樣品能直接用于MALDITOF MS檢 測[15]。Olivier Clerc[16]等 人 認 為 基 于MALDI－TOF MS對血培養(yǎng)陽性標本的鑒定可能會成為血培養(yǎng)陽性病人管理中除了革蘭氏染色報告之外的第2個關(guān)鍵步驟。但尚未出臺規(guī)范化的標準程序且MALDI－TOF MS用于直接鑒定時仍存在不少問題。Chen JHK等人[17]的研究表明 MALDI－TOF MS可以直接鑒定血培養(yǎng)陽性的標本，但亦存在革蘭陽性細菌的鑒定率比革蘭陰性細菌低；莢膜細菌如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和肺炎克雷伯菌的鑒定率比其他無莢膜細菌低；細菌量不足或混合感染時鑒定率低；培養(yǎng)物其他成分嚴重影響結(jié)果分析等問題。另外，MALDI－TOF MS雖然已經(jīng)可以用于直接鑒定尿液標本，但目前對含有兩種以上細菌感染的尿液標本，MALDI－TOF MS常不能正確鑒定[18]。

目前來看，MALDI－TOF MS在對病原菌亞種上的鑒定、病原菌的耐藥檢測、人體無菌部位樣品的直接鑒定以及混合病原菌物種的鑒定方面仍有局限性。

3 MALDI－TOF MS與傳統(tǒng)方法的鑒定效率比對

實驗室研究發(fā)現(xiàn) MALDI－TOF MS對于奈瑟菌、梭狀芽胞桿菌、沙門氏菌、草綠色鏈球菌、幽門螺旋桿菌和彎曲桿菌等的鑒定準確率幾乎為100%。對于單核細胞增生李斯特氏菌、厭氧菌、拉烏爾菌、氣球菌、乳球菌、隱秘桿菌、泛菌屬、阪崎腸桿菌和結(jié)核分枝桿菌等，與傳統(tǒng)方法相比 MALDI－TOF MS更有優(yōu)勢。甚至對于某些傳統(tǒng)鑒定方法和基因型手段來說都棘手的物種，如洋蔥伯克霍爾德菌復(fù)合物，MALDI－TOF MS也可以區(qū)分[19]。目前對于核糖體蛋白序列沒有足夠差異的物種，如志賀氏菌屬和大腸桿菌或肺炎鏈球菌（肺炎球菌）和緩癥鏈球菌／口腔鏈球菌不能通過MALDI－TOF MS來區(qū)分（有研究表明[20]梅里埃的VITEK MS可以區(qū)分肺炎鏈球菌和緩癥鏈球菌／口腔鏈球菌），此時經(jīng)典生化試驗、抗原檢測或分子生物學(xué)方法是必需的。

傳統(tǒng)的表型鑒定方法往往只能鑒定出常見的念珠菌種屬，而已有研究證實MALDI－TOF MS能夠快速、準確地對常見和不常見的念珠菌種屬進行鑒定。MALDI－TOF MS在鑒定酵母方面有較高的鑒定率[21]。最近有文章[22]指出由表型鑒定方法初步鑒定為無名假絲酵母的菌株被基因型方法鑒定為季也蒙念珠菌、魯希特念珠菌、發(fā)酵型念珠菌、中間念珠菌和抗草甘膦真菌。此結(jié)果表明無名假絲酵母可能作為侵襲性真菌病因的機會并不似以前報道的那么多。以傳統(tǒng)表型鑒定方法鑒定為無名假絲酵母是不可靠的，而 MALDI－TOF MS的準確度要高很多[23]。McTaggart LR 等 人[24]的 研 究 指 出 MALDI－TOF MS對隱球菌的鑒定準確率可達100%。然而對于絲狀真菌，因為首先其?？杀憩F(xiàn)出完全不同的表型，且被分析的蛋白質(zhì)質(zhì)譜可能依賴于其生長條件或真菌菌絲體的區(qū)域；其次，絲狀真菌中蛋白質(zhì)的提取操作缺乏標準化；另外，目前市售的設(shè)備中包含的數(shù)據(jù)庫很少有其參考光譜。所以關(guān)于利用MALDI－TOF MS鑒定臨床微生物學(xué)有關(guān)的常規(guī)絲狀真菌的前瞻性研究尚未公布。但一些研究已經(jīng)顯示了MALDI－TOF MS鑒定臨床真菌的潛力，如曲霉屬，青霉屬，鐮刀菌或各種皮膚癬菌。但這些研究的建立和使用依賴于自己的參考光譜數(shù)據(jù)庫和（或）使用嚴格控制的預(yù)分析步驟（如孵化培養(yǎng)基及持續(xù)的時間）。隨著數(shù)據(jù)庫的不斷完善和提取步驟的優(yōu)化，MALDI－TOF MS會成為優(yōu)于鑒定絲狀真菌傳統(tǒng)方法的更高效的鑒定方法。

當MALDI－TOF MS與傳統(tǒng)生化鑒定方法得出結(jié)果不一致時，采用基因型鑒定方法進行分析得出的結(jié)果往往與MALDI－TOF MS的一致。高質(zhì)量的MALDI－TOF MS與基因型鑒定方法擁有同樣出色的鑒定能力。

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