類風濕關節(jié)炎中血管新生調節(jié)網(wǎng)絡及其藥物研究啟發(fā)

孫 艷 安永潼 尹蓓珮 沈龍海

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國家重點實驗室，上海 200437)

類風濕關節(jié)炎是一種自身免疫性疾病，它的發(fā)病機制還未完全了解。其病理特點是:滑膜增生、血管新生以及血管翳形成。滑膜增生導致低氧，刺激血管新生，血管新生介導淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等向滑膜遷移形成血管翳，血管翳阻斷骨通過滑膜獲取營養(yǎng)，激活破骨細胞分化，導致骨和軟骨的侵蝕，關節(jié)破壞。血管生長是炎性關節(jié)炎早期極其重要的階段。治療類風濕關節(jié)炎的藥物從以前的非特異性抗炎藥轉向特異性抗炎藥(如TNF-α阻斷劑)，現(xiàn)在，又開始研發(fā)作用于炎癥信號通路的小分子藥物(如Janus激酶抑制劑)。但是存在嚴重副反應以及某些個體并不反應的缺陷。所以，了解血管新生在類風濕關節(jié)炎中的機制以及研發(fā)以此為靶點的藥物，引領類風濕關節(jié)炎治療的發(fā)展是非常必要的。

1 血管新生在類風濕關節(jié)炎中的作用

血管內皮生長因子不僅是胚胎生長、骨骼生長、生殖功能等生理血管生長的關鍵調節(jié)因子，也涉及腫瘤、類風濕關節(jié)炎和其他的疾?。?］。

近來發(fā)現(xiàn)，類風濕關節(jié)炎患者中滑液和血清中的VEGF顯著增加，而且VEGF含量與疾病的嚴重程度相關，可以說明血管新生在類風濕關節(jié)炎的發(fā)展中有著重要的作用。血管新生促進了血管翳的產(chǎn)生和促進炎癥細胞向滑膜的遷移加重炎癥。RA患者中血管新生的最顯著的作用是增加向滑膜增生和血管翳提供營養(yǎng)和氧氣?；ぴ錾鷮е禄瘸霈F(xiàn)低氧的內環(huán)境，低氧誘導因子(HIF)誘導血管生長因子的表達，促進血管新生。但是由于新生血管的間葉細胞的缺乏導致不正常的形態(tài)，并沒有完全緩解滑膜的低氧狀態(tài)，導致慢性炎癥。

其次，新生的血管可以向滑膜炎癥部位輸送炎癥細胞來維持炎癥。VEGF165激活內皮細胞產(chǎn)生趨化因子(如 MCP-1/IL-8)［2］，可以招募單核細胞，然后VEGF165的刺激下或與活化的內皮細胞直接接觸產(chǎn)生TNF-α和IL-6，然后TNF-α和IL-6作用于單核細胞分泌VEGF165，形成正反饋。血管新生時細胞因子之間的相互作用使得血管的通透性增加及內皮細胞表面黏附因子的表達，使得炎癥細胞轉移并透過血管壁進入滑膜炎癥部位，使炎癥持續(xù)［3］。

2 血管新生的分子調控網(wǎng)絡

血管生長和成熟是由一系列的配體有序的激活各種受體的過程，受各種信號的調節(jié)，其中有參與生長和延伸的，還有調節(jié)血管成熟和形態(tài)的。有促進信號，同樣有抑制信號，兩種信號的平衡調節(jié)了血管生長。

2.1 血管新生過程 當內皮細胞接受到血管生長因子(如VEGF)刺激時，基底膜外的周皮細胞首先與血管壁分離(在Ang2的刺激下)，然后內皮細胞分泌的金屬蛋白酶(MMP)將基底膜分解，導致周皮細胞徹底遠離血管壁，內皮細胞之間連接變得松散，內皮細胞屏障的通透性增加［4］，血漿中的蛋白進入并沉積在細胞外基質(ECM)，為血管生成中多種細胞遷移提供纖維支架。新生血管的前端稱為Tip細胞，其后的內皮細胞稱為Stalk細胞，兩者之間的正常比例維持血管正常的形態(tài)。參與內皮細胞遷移的因子有VEGF、趨化因子、細胞外基質成分、整合素等。在此過程中還涉及DLL4-Notch信號通路，此信號通路調節(jié)Tip細胞和Stalk細胞之間的比例，保證血管形態(tài)的正常［5］，對防止內皮細胞的無序增殖和排列有著重要的作用。

延伸血管的穩(wěn)定性需要周皮細胞和血管平滑肌細胞的支持，招募因子主要是內皮細胞產(chǎn)生的PDGF(血小板來源的生長因子)-BB，PDGF-BB通過碳末端保留模體與ECM中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結合與內皮細胞靠近，招募周皮細胞。周皮細胞和血管平滑肌細胞表面表達Ang1與表達于內皮細胞表面的Tie-2受體作用，介導血管的穩(wěn)定，但是可以被Ang2拮抗，增加BM降解和內皮細胞遷移［6］。

綜上所述，參與血管生成的細胞因子包括血管內皮生長因子(VEGF)、趨化因子、細胞外基質成分及整合素等，而 Ang1和 PDGF-BB參與血管的穩(wěn)定性。

2.2 血管內皮生長因子

2.2.1 分類及其配體 VEGF家族有 VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD 及 placenta growth factors(PGF)，其受體有Flt-1(VEGFR1)、KDR(VEGFR2)、Flt-4(VEGFR3)、NRP-1。VEGFC 和VEGFD主要與VEGFR3結合，刺激淋巴管生成。與血管新生無關。VEGFA可以結合兩種酪氨酸激酶受體-VEGFR1和VEGFR2，VEGFA通過不同的剪切形成多個異構體，其中肝素結合的VEGFA(堿性)異構體可以和 NRP-1結合，加強 VEGFR2信號［1］，而VEGFR1的作用復雜，可以和不同配體結合，產(chǎn)生不同的信號反應，其中研究認為VEGFR1是個“誘騙”受體，可以和 VEGFA結合，抑制 VEGFR2的信號［7］，所以認為VEGFR1是個負調節(jié)信號，至少在早期階段。此外，還可以促進單核細胞遷移，刺激內皮細胞分泌蛋白酶和生長因子［6］。

2.2.2 產(chǎn)生

2.2.2.1 低氧 低氧是血管新生和炎癥的關鍵調節(jié)因子，是因為它調控很多基因的表達，包括血管內皮生長因子VEGF。

滑膜增生導致滑膜處氧的消耗大于氧的供給，滑膜處呈現(xiàn)低氧的內環(huán)境。低氧誘導HIF的產(chǎn)生。HIF是異源二聚體，由HIFα和HIFβ組成，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1由氧調節(jié)的HIF-1α和組成性表達的HIF-1β亞基組成。在常氧的情況下，PHD羥化脯氨酸殘基，為von Hippel-Lindau蛋白提供結合位點，招募E3泛素蛋白連接酶，導致HIF-1α泛素化，被蛋白酶降解。FIH-1(Factor inhibiting HIF-1)將HIF-1α天冬氨酸殘基羥基化，阻止其與轉錄輔助激活劑CSP和p300的結合。低氧時PHD和FIH-1失去活性，HIF-1α含量迅速增加，與 HIF-1β結合形成HIF，與助激活劑結合，進入細胞核內，結合低氧反應元件(HRE)，啟動基因的表達［8］。

2.2.2.2 生長因子和炎癥細胞因子 實驗研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的滑膜細胞能夠在 IL-1、IL-6、IL-17、IL-18、前列腺素、TGF-β刺激下分泌VEGF，TNF-α和IL-6刺激單核細胞分泌VEGF165［3］。這些細胞因子通過炎癥信號通路或其他信號通路刺激 VEGF的產(chǎn)生。

2.2.2.3 低氧信號和炎癥信號相互作用 研究發(fā)現(xiàn)低氧信號通路與炎癥信號通路存在結合點。有些細胞因子(如 IL-1β和 TNF-α)可以通過 PI3K和MARK兩個主要的信號通路影響 HIF的含量［9］，TLR7-TLR8或TLR4的特異性配體會通過NFkB信號通路激活HIF信號通路［10］，所以炎癥因子會通過炎癥信號調節(jié)HIF，從而在常氧的環(huán)境中同樣刺激VEGF的表達。同樣，低氧條件可以直接調控NFkB信號通路，刺激炎癥因子的產(chǎn)生，研究認為PHD可以以非羥基化的形式阻斷IKK和Hsp90的相互作用，抑制了 IKKβ的磷酸化，從而降解 IkBα，抑制NFkB信號通路。而低氧時，PHD的活性抑制，脫掉對IKK的抑制，激活NFkB信號［11］。

總之，影響VEGF產(chǎn)生的信號可以單獨起作用，也可以相互作用，從而形成強大的正反饋，刺激VEGF的產(chǎn)生，促進血管新生和炎癥。

2.2.3 信號通路 VEGF-VEGFR信號通路介導內皮細胞的增殖、遷移、抗凋亡、提高血管通透性，也和DLL4-Notch1信號相互作用，共同促進血管正常形態(tài)的形成。VEGFR1經(jīng)歷弱的配體依賴的酪氨酸磷酸化，而VEGFR2有著強烈的反應，這些信號轉導性質的差異導致VEGF的不同功能，VEGFR1介導細胞遷移和分化，VEGFR2介導細胞增殖和生存。VEGF和其受體結合后，可引起受體胞內激酶區(qū)特定酪氨酸殘基的磷酸化，進而被含有SH2結構域的adaptor蛋白結合，通過蛋白磷脂酶C(PLC)-蛋白激酶 C(PKC)-Raf-MEK-MAPK旁路，活化 MAPK，MAPK作為轉錄因子可轉運至細胞核內，啟動特定基因的表達，完成VEGF相應的促增殖作用。配體-受體結合也可以通過PACK1激活PI3-K，進而作用于Akt，從而介導內皮細胞的抗凋亡，VEGF也誘導內皮細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和A1的表達［12］。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3也會介導內皮細胞的遷移以及管腔形成［13］。

VEGFA激活的信號誘導新生血管上DLL4的表達，尤其是出芽尖端的內皮細胞(Tip細胞)，DLL4激活鄰近細胞表面的Notch信號，從而抑制VEGFR的表達，抑制內皮出芽和增殖［14］。在腫瘤治療的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制DLL信號，會產(chǎn)生很多的出芽，但是血管不正常，腫瘤的血液灌流不會增加，腫瘤減小，這為出現(xiàn)VEGF耐受的腫瘤患者提供了新的治療方法［15］，所以DLL信號在控制血管出芽，保證血管正常形態(tài)的過程中起著重要作用。最近結果表明，并不只是VEGFR2調節(jié)DLL4，還存在其他調節(jié)者(如細胞基質信號)，而且 DLL4信號下調 VEGFR3，對VEGFR2的表達毫無影響，結果顯示 VEGFR2和VEGFR3通過Notch信號調節(jié)的方式不相同。Notch信號弱時，VEGFR3上調解除對血管新生的抑制，血管Notch或者VEGFR3激活的狀態(tài)可能會與患者對anti-VEGF治療沒有反應相關，這為我們選擇合適的治療方案來減少耐受產(chǎn)生有價值的信息［16］。但是對于類風濕關節(jié)炎中血管新生只會使低氧的狀態(tài)持續(xù)，從而產(chǎn)生慢性炎癥，所以我們應該了解新生血管不正常形態(tài)的原因，從而根據(jù)此原因調節(jié)通路，使生成的血管可以輸送營養(yǎng)物質，改變低氧的狀態(tài)，從而可能減輕炎癥。

2.3 其他主要細胞因子和蛋白介紹

2.3.1 血管生長素(Ang) Ang1和Tie2(內皮酪氨酸激酶受體)相互作用，促進受體的自身磷酸化(活化)，表達活化Tie2的內皮細胞吸引血管平滑肌細胞、周皮細胞等血管周圍細胞包圍、支持內皮細胞形成完整的血管壁，促進血管重塑、成熟，維持血管的完整性和調節(jié)血管功能。而Ang2對血管生成的影響和局部的微環(huán)境有關，當VEGF等促血管生長因子存在時，Ang2競爭性抑制Ang1，促進新血管形成和血管重建，形成新的毛細血管。當局部缺乏這些因子時，Ang2則通過抑制Ang1而有助于血管的消退［17］。

2.3.2 趨化因子 VEGF可以作用于內皮細胞產(chǎn)生趨化因子，VEGF/VPF可以通過激活NF-kB信號通路(通過鈣離子和PI3K)誘導內皮細胞產(chǎn)生IL-8［18］。趨化因子根據(jù)半胱氨酸殘基在結構中的位置分為三類，分別是CXC、CC、CX3C。趨化因子一方面可以趨化細胞遷移、增加黏附因子的表達，促進炎癥細胞聚集，產(chǎn)生炎癥。另一方面，可以作用于內皮細胞，產(chǎn)生一系列的信號，促進內皮細胞的分裂、遷移及抗凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，一般情況下，刺激血管新生的趨化因子包含ELR(glutamy-leucyl-arginyl)氨基酸模體，相反，不含ELR氨基酸模體的趨化因子抑制血管新生。當然也有特例，如 stromal cell-derived factor-1SDF-1/CXCL12缺乏ELR模體，卻刺激血管新生［19］。CXCR2是內皮細胞上促進血管生長的CXC因子的最重要的受體，研究發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞可表達CXC受體mRNA和蛋白，將內皮細胞和IL-8共同孵育可促進凋亡抑制基因的表達，抑制內皮細胞凋亡，還可以加強基質金屬蛋白酶 MMP2及MMP9 mRNA的表達，以利于內皮細胞遷移，從而調節(jié)血管形成。

2.3.3 整合素 整合素(也稱整聯(lián)蛋白)是一種細胞外基質受體蛋白，細胞外部分與基質蛋白結合，內部通過踝蛋白與黏著斑蛋白同肌動蛋白相連，此過程會激活黏著斑蛋白激酶(FAK)。鑒于FA介導內皮細胞對于細胞外的刺激的重要性及FAK在這個過程的重要性，對于治療含有血管生成過程的疾病，靶向FAK是有治療前景的［20］。

3 藥物研發(fā)方向分析

根據(jù)以上結果，我們看到血管新生在類風濕關節(jié)炎中的重要作用，鑒于現(xiàn)在類風濕藥物主要集中于抗炎藥物，會出現(xiàn)耐受及嚴重的副反應，我們需要研發(fā)其他靶點的藥物，開發(fā)安全有效的產(chǎn)品，所以靶向血管生長或許是一個很好的方向，至少血管生長抑制劑在腫瘤治療中呈現(xiàn)了很好的效果。

根據(jù)調控血管生長的復雜的調控網(wǎng)絡，我們可以采取多種干擾策略中斷血管生長，抑制血管新生可能會阻斷炎癥細胞的遷移，減少滑膜處血管翳的形成及炎癥的持續(xù)。抑制血管新生有以下策略:①抑制血管內皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，可以通過靶向HIF因子，阻斷其信號通路，抑制VEGF的產(chǎn)生。我們研究的方向一方面主要集中在調節(jié)PHDs和FIHI的活性，使其在低氧的時候也能破壞HIF-α的穩(wěn)定性或阻斷與助激活劑的結合，從而抑制HIF的存在，中斷信號通路。另一方面設計siRNA和DNA轉錄酶的調節(jié)直接靶向HIF的產(chǎn)生［21］。②阻斷VEGF-VEGFR信號通路。采用抗VEGF抗體或抗VEGFR抗體阻斷VEGF和VEGFR的結合，還可以設計小分子藥物靶向受體酪氨酸激酶抑制劑阻斷信號通路，抑制內皮細胞的增殖、遷移等。研究發(fā)現(xiàn)，通過篩選合成的肽數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)一個可溶性的富含Arg的六肽-RRKRRR(R代表精氨酸，K代表賴氨酸)，它可以和 VEGF結合，抑制其與受體結合［22］，另外還發(fā)現(xiàn)抗 Flt-1 的六肽，GNQWFI(Gly-Asn-Gln-Trp-Phe-Ile)，選擇性地阻斷Flt-1可能會阻斷VEGF誘導的炎癥和血管新生，并且毒性會很?。?3］。此外，研究發(fā)現(xiàn)，金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMPs)最初作為金屬蛋白酶的抑制劑，最近發(fā)現(xiàn)它可以阻斷VEGF和VEGFR2的結合，但對VEGFR1無影響［24］。最奇特的是，可以修飾編碼受體酪氨酸激酶超家族的基因，產(chǎn)生理想的剪切變異體，阻斷配體與受體的結合。③抑制參與內皮細胞遷移相關的蛋白(如金屬蛋白酶抑制劑、αvβ3整合素)等也是一種治療方案。

由于VEGF-VEGFR信號與其他信號有著緊密的相互作用，在不同階段，VEGF所承擔的作用是不同的，如果只是單一的阻斷VEGF，處于特定階段的患者可能并不會產(chǎn)生效果。對于這個問題，我們應該更加努力地研究類風濕關節(jié)炎中血管新生的復雜調控機制，從而詳細了解VEGF的多重作用，研發(fā)安全有效的藥物，避免藥物的盲目性。

此外，我們現(xiàn)在主要研究的是血管生長抑制劑類藥物，我們可能忽略了血管不正常的形態(tài)在疾病發(fā)展中的作用，我們知道低氧刺激血管新生是為了提供更多的血液灌流，保證氧的供給，但實際結果卻是導致炎癥的維持，這是因為不正常的血管失去了它的功能。我們也可以研究造成這種血管不正常的原因，從而采取措施糾正，觀察正常的血管新生對于疾病的減輕有無療效，從而可能開發(fā)新的研究思路。其中我們可以從類風濕性關節(jié)炎中DLL-Notch信號、Ang-Tie信號的變化入手進行我們的研究，因為它們主要的作用就是調控血管出芽、維持血管完整、促進血管重塑和成熟。

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