共抑制分子在膿毒癥中的作用研究進(jìn)展

潘婷婷 劉嘉琳 瞿洪平 (上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，上海 200025)

根據(jù)Kevin Lafferty 提出的關(guān)于T 細(xì)胞激活的雙信號假說，T 細(xì)胞的激活不僅需要MHC-肽-TCR提供的第一信號，而且需要細(xì)胞膜上的共信號分子所傳遞的第二信號。其中共刺激分子傳遞正性信號促進(jìn)T 細(xì)胞的活化，而共抑制分子將傳遞負(fù)性信號引發(fā)T 細(xì)胞的無應(yīng)答、耐受或細(xì)胞凋亡。近年研究發(fā)現(xiàn)，共抑制分子如程序性死亡因子(PD-1)、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原-4(CTLA-4/CD152)及B/T 淋巴細(xì)胞弱化因子(BTLA)等在自身免疫性疾病、腫瘤、慢性感染等多種疾病中發(fā)揮作用。

膿毒癥后期，機(jī)體常處于持續(xù)的免疫抑制狀態(tài)［1］，病人往往表現(xiàn)體溫降低、白細(xì)胞減少，并且容易發(fā)生難治的感染。檢測膿毒癥患者外周血發(fā)現(xiàn)［2-4］，多種免疫細(xì)胞亞群，如T 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞上的PD-1、CTLA-4 及BTLA 表達(dá)升高，表明共抑制分子在膿毒癥中發(fā)揮著重要作用。現(xiàn)將對PD-1、CTLA-4 及BTLA 在膿毒癥中的作用進(jìn)行闡述。

1 PD-1

程序性死亡因子(Programmed death-1，PD-1)及其配體［5］屬于B7:CD28 免疫球蛋白超家族成員，它的胞外區(qū)為IgV 樣結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)區(qū)的N 端氨基酸有殘基具有ITIM 結(jié)構(gòu)域(Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)，通過募集SHP1 及SHP2(Src homology region 2 domain-containing phosphatase-1)抑制淋巴細(xì)胞的增殖、活化［6］。PD-1 主要表達(dá)于活化的CD4+和CD8+T 細(xì)胞、NK T 細(xì)胞、單核細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞。PD-1 有兩種配體，PD-L1 (B7-H1;CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)，兩者在表達(dá)上存在差異。PD-L1 主要表達(dá)于T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞以及骨髓(BM)衍生的肥大細(xì)胞，還可表達(dá)在一些非淋巴組織細(xì)胞上，如內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞及胰島細(xì)胞。PD-1 與其配體結(jié)合可以抑制細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生及其細(xì)胞毒性作用。而PD-L2 的表達(dá)則相對局限，主要表達(dá)于DC、巨噬細(xì)胞及骨髓衍生的肥大細(xì)胞。

以往研究發(fā)現(xiàn)［7］，與野生型小鼠相比，PD-1 基因敲除小鼠在盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(Cecal ligation and puncture，CLP)等誘導(dǎo)的膿毒癥模型中存活率明顯升高，同時Zhang 等［2］的研究中，在CLP 術(shù)前用PD-1 抗體預(yù)處理或者術(shù)后給予PD-1 抗體，其存活率都比對照組高，表明抗PD-1 對膿毒癥有保護(hù)作用。

臨床中也發(fā)現(xiàn)［8］，膿毒癥休克患者單核細(xì)胞上PD-L1 表達(dá)升高，體外阻斷PD-1 通路后，用LPS 刺激，促炎因子TNF-α 和IL-6 的分泌均明顯增加，而抑炎因子IL-10 的分泌減少。同樣用PD-L1 抗體將小鼠體內(nèi)PD-1 通路阻斷［2］，與對照組相比，TNF-α和IL-6 分泌增加，IL-10 的水平下降。單核細(xì)胞上PD-L1 的表達(dá)可能與其分泌功能減退有關(guān)，而這點在膿毒癥后期免疫抑制中發(fā)揮重要作用。血漿中IL-10 的水平升高往往提示膿毒癥休克的預(yù)后不佳［9］。檢測膿毒癥休克病人外周血IL-10 及白細(xì)胞PD-1/PD-L1 表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)［10］，IL-10 水平與單核細(xì)胞PD-1 的表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)，聯(lián)合檢測PD-1及IL-10 的表達(dá)可能對膿毒癥的預(yù)后更有提示作用。

淋巴細(xì)胞的凋亡在膿毒癥免疫抑制中發(fā)揮重要作用，抑制淋巴細(xì)胞凋亡可改善膿毒癥的預(yù)后。Zhang 等［2］研究發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥小鼠中，用PD-L1 抗體處理阻斷PD-1 通路，其胸腺淋巴細(xì)胞的凋亡比未用PD-L1 抗體處理明顯減少，并且比對照組相比，外周血、胸腺及脾臟的淋巴細(xì)胞數(shù)升高。同樣，在體外誘導(dǎo)膿毒癥患者外周血淋巴細(xì)胞凋亡時發(fā)現(xiàn)［8］，阻斷PD-L1 可明顯減少淋巴細(xì)胞凋亡，表明PD-1是淋巴細(xì)胞凋亡的重要參與者。膿毒癥中淋巴細(xì)胞增殖往往受到抑制，研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者的淋巴細(xì)胞增殖程度與CD4+T 細(xì)胞的PD-1 的表達(dá)水平呈明顯的負(fù)相關(guān)，因而PD-1 在膿毒癥中不僅可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡而且抑制淋巴細(xì)胞增殖。在Brahmamdam 等［11］的研究中發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-1/PD-L1 通路不僅對淋巴細(xì)胞有保護(hù)作用，對NK 細(xì)胞、DC 也有保護(hù)作用，說明PD-1/PD-L1 通路不僅調(diào)控淋巴細(xì)胞的凋亡及增殖，還可能作用于NK 細(xì)胞、DC，這有待進(jìn)一步的研究證實。

嚴(yán)重膿毒癥的發(fā)展與巨噬細(xì)胞功能障礙有密切關(guān)系。Huang 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，在CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中，腹腔巨噬細(xì)胞的噬菌能力降低，巨噬細(xì)胞PD-1 的表達(dá)升高。然而在PD-1 基因敲除的膿毒癥小鼠中，其噬菌能力沒有降低，表明PD-1 在巨噬細(xì)胞的功能障礙中發(fā)揮作用。IFN-γ 作為一種重要的炎癥因子，可以活化巨噬細(xì)胞;巨噬細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá)下降往往預(yù)示膿毒癥預(yù)后不佳。在膿毒癥小鼠中發(fā)現(xiàn)，將PD-1/PD-L1 阻斷，不僅可以逆轉(zhuǎn)真菌血癥中IFN-γ 的分泌，而且MHC Ⅱ的表達(dá)也有所恢復(fù)［12］。

在Ⅰ期臨床試驗中［13］，PD-1 抗體在黑色素瘤患者中具有較好的耐受性及抗腫瘤活性，PD-1 抗體在膿毒癥患者中的臨床療效及安全性尚無臨床試驗支持。

2 CTLA-4

細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原-4(CTLA-4/CD152)屬于B7:CD28 免疫球蛋白超家族成員［14］。CTLA僅表達(dá)在活化的T 細(xì)胞上，在靜息和活化初期沒有表達(dá)。CTLA-4 是由兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的同源二聚體，在Ig 樣V 區(qū)與CD28 具有相似性。CTLA-4 與CD28 都是抗原遞呈細(xì)胞表面B7 分子家族(CD80，CD86)的受體，兩者與CD80、CD86競爭性地結(jié)合，向T 細(xì)胞傳遞抑制或刺激信號，從而抑制或促進(jìn)T 細(xì)胞活化。

Inoue 等［15］研究中，CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠T細(xì)胞凋亡明顯增加的同時，CD4+、CD8+T 細(xì)胞上CTLA-4 的表達(dá)升高。術(shù)后給予CTLA-4 抗體處理發(fā)現(xiàn)，CD4+、CD8+T 細(xì)胞的凋亡比未給予抗體處理組減少近一半，表明在膿毒癥中抗CTLA-4 對T 細(xì)胞有保護(hù)作用。Roger 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥休克的患者T 細(xì)胞的CTLA-4 表達(dá)升高，單核細(xì)胞表面CD86 表達(dá)下降，同時血漿中IL-2 的水平降低。早些研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CTLA-4 可以抑制CD3/CD28 誘導(dǎo)的IL-2 的合成［16，17］，而IL-2 可以抑制T 細(xì)胞的凋亡。此外，膿毒癥休克患者中Treg 細(xì)胞的CTLA-4表達(dá)升高［18］，表明CTLA-4 可能通過Treg 細(xì)胞參與了膿毒癥免疫抑制的發(fā)生。

用CTLA-4 抗體處理CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥模型時，低劑量(33 μg/小鼠)時可明顯改善生存，但高劑量(200 μg/小鼠)時生存率下降，原因可能是高劑量抗體阻斷CTLA-4 引起大量T 細(xì)胞活化，從而導(dǎo)致過度的細(xì)胞死亡。CTLA-4 單抗易普利姆瑪已經(jīng)經(jīng)過美國FDA 批準(zhǔn)，用于治療惡性黑色素瘤，然而CTLA-4 抗體在膿毒癥中合適的治療劑量及治療時間還需要進(jìn)一步探究。

3 BTLA

B/T 淋巴細(xì)胞弱化因子(BTLA)和PD-1、CTLA-4 一樣屬于B7:CD28 免疫球蛋白超家族成員［19］，在T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、DC 及巨噬細(xì)胞等表面表達(dá)。與PD-1、CTLA-4 不同的是，BTLA 組成性的表達(dá)在靜止T 細(xì)胞上，T 細(xì)胞活化后表達(dá)逐漸增加，而PD-1、CTLA-4 不表達(dá)在靜止T 細(xì)胞上。BTLA 的配體是腫瘤壞死因子受體家族的皰疹病毒輔助受體(HVEM，herpesvirus entry mediator)，兩者結(jié)合后傳遞抑制信號，抑制T 細(xì)胞活化和增殖。研究發(fā)現(xiàn)［20］，BTLA 在T 細(xì)胞活化的起始和早期階段發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。

在Kobayashi［21］研究中發(fā)現(xiàn)，BTLA 參與IκB-α降解，胞內(nèi)NF-κB1 及ERK1/2 的磷酸化和RelA 的轉(zhuǎn)位，除此之外，還參與了IRF-3 的轉(zhuǎn)位，因而BTLA可以通過MyD88 及TRIF 通路抑制TLR4 信號。

Shubin 等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在CLP 誘導(dǎo)的膿毒癥中，腹腔巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、成熟及未成熟DC 的BTLA 表達(dá)均升高，并且BTLA-/-小鼠與野生型相比死亡率顯著降低，腎臟損傷較輕，腹腔細(xì)菌負(fù)荷量降低，提示BTLA 通過調(diào)節(jié)固有免疫在膿毒癥的發(fā)展中發(fā)揮作用。進(jìn)一步證實BTLA 可以影響固有免疫細(xì)胞的活化和募集。BTLA-/-小鼠腹腔灌洗液中IL-10 的濃度比野生型低，表明BTLA 不僅可以抑制細(xì)胞活化，還可能通過IL-10 促進(jìn)免疫細(xì)胞向免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)化。

4 TIM-3

Th1 型細(xì)胞特異性膜蛋白TIM-3［22］，作為特異的Th1 細(xì)胞的表面標(biāo)志，產(chǎn)生抑制信號從而誘導(dǎo)Th1、Tc1 的凋亡。此外，TIM-3 還表達(dá)在一些樹突狀細(xì)胞上表達(dá)，參與吞噬細(xì)胞的凋亡及免疫耐受。膿毒癥患者與健康人相比，外周血淋巴細(xì)胞TIM-3的表達(dá)水平明顯升高，提示其在膿毒癥中發(fā)揮一定作用。然而在嚴(yán)重膿毒癥患者中其水平卻明顯低于膿毒癥患者中的水平，表明淋巴細(xì)胞TIM-3 的表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。Yang 等［23］的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞上Tim-3 的過表達(dá)可以通過增強PI3K-AKT 磷酸化抑制LPS-TLR4 介導(dǎo)的NF-kappaB的活化，從而負(fù)性調(diào)控固有免疫反應(yīng)，所以嚴(yán)重膿毒癥中TIM-3 的表達(dá)水平降低將不足以抑制其失控的炎癥反應(yīng)，從而引起器官損傷及死亡率的升高。該研究指出嚴(yán)重膿毒癥中TIM-3 的表達(dá)水平降低可能是由于LPS 的持續(xù)刺激引起的。

然而，研究發(fā)現(xiàn)［24］，巨噬細(xì)胞上TIM-3 一方面可以促進(jìn)TNF-α、IL-6 的表達(dá)增強非特異免疫反應(yīng)，同時可以通過調(diào)節(jié)CD80、CD86 的表達(dá)增強抗原呈遞功能，增強抗炎癥反應(yīng)。Yang 等的研究發(fā)現(xiàn)可能是基于膿毒癥病人特殊的免疫狀態(tài)，TIM-3 分子到底在膿毒癥中發(fā)揮怎樣的作用，以及是否可以作為評估疾病嚴(yán)重程度和免疫狀態(tài)的指標(biāo)還需要更多的實驗證實。

此外，該研究中指出，用抗體拮抗膿毒癥小鼠中TIM-3 分子，失控的炎癥反應(yīng)將會繼續(xù)放大，存活率會明顯下降。這一點與PD-1 抗體、低劑量CTLA-4抗體阻斷相應(yīng)通路及BTLA-/-小鼠的膿毒癥預(yù)后結(jié)果相反，考慮與實驗動物模型中的免疫狀態(tài)相關(guān)，當(dāng)機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)時，阻斷共抑制分子通路將會刺激免疫反應(yīng)，利于機(jī)體清除病原體，相反當(dāng)機(jī)體處于過度的炎癥反應(yīng)狀態(tài)時，阻斷共抑制分子通路可能會進(jìn)一步加劇失控的炎癥反應(yīng)，從而造成組織器官的損傷和預(yù)后不良。所以，應(yīng)用共抑制分子治療膿毒癥首先應(yīng)判斷膿毒癥患者的免疫狀態(tài)。

5 結(jié)語

本文主要闡明了共抑制分子的表達(dá)參與了膿毒癥的疾病發(fā)展，在動物實驗中阻斷共抑制分子可以影響膿毒癥的預(yù)后。但是共抑制分子在膿毒癥中具體的作用機(jī)制仍不清楚，治療膿毒癥的合適時間及劑量還需要進(jìn)一步摸索。根據(jù)共抑制分子的免疫抑制作用，通過阻斷共抑制分子的作用通路，從而緩解膿毒癥后期的免疫抑制狀態(tài)。因此，有理由推測，共抑制分子抗體未來可能輔助膿毒癥的免疫治療。

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