子宮內(nèi)膜異位癥動物模型研究進(jìn)展

馮 雪,黃 薇

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院，成都 610041)

子宮內(nèi)膜異位癥(簡稱內(nèi)異癥)是育齡期婦女的常見病及多發(fā)病，主要表現(xiàn)為慢性盆腔疼痛、痛經(jīng)和不孕等，但病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。由于實(shí)際操作和倫理學(xué)方面的約束，在人體進(jìn)行內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制和治療研究受到限制，因此，動物模型被廣泛地運(yùn)用于內(nèi)異癥的基礎(chǔ)和臨床研究中。動物涉及大鼠、小鼠、家兔、獼猴、狒狒、巴馬香豬、雞胚絨毛膜尿囊膜(CAM)等，其中以嚙齒類、靈長類動物模型研究最多，本文就這兩類最常見的內(nèi)異癥動物模型研究進(jìn)展進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)和綜述。

1 嚙齒類模型

嚙齒類動物繁殖能力強(qiáng)，動情周期短而規(guī)律，約4～5 d，因無內(nèi)膜脫落，不能自發(fā)形成異位病灶，但是，將內(nèi)膜組織移植到宮外如腹腔部位則可形成病灶。依據(jù)移植組織來源分為自體移植模型和異體移植模型兩類。

1．1 自體移植模型

1.1.1 自體移植模型的特點(diǎn)：自體移植指將自體或同源性子宮內(nèi)膜移植于到同種自體或異體免疫活性動物中，常用動物是性成熟的雌性大鼠及小鼠。常見的大鼠有SD或Wistar，小鼠有BALB/C、C57BL等品種。造模方法：切除自體或同種異體子宮，并切成小塊，移植到腹腔內(nèi)。大多數(shù)研究未分離子宮內(nèi)膜和肌層，而是將兩部分一起移植；也有研究將漿膜、肌層去除，僅移植子宮內(nèi)膜層的[1]。張春斌等[2]發(fā)現(xiàn)大鼠造模后8周異位子宮內(nèi)膜形態(tài)和結(jié)構(gòu)與在位子宮內(nèi)膜基本相同，病灶外觀呈囊泡狀，并與周圍組織有不同程度的粘連。Korbel等[3]發(fā)現(xiàn)移植物的大小會影響病灶的形成和發(fā)展，盡管直徑3 mm子宮內(nèi)膜組織比2 mm組織生長慢，但形成病灶大且囊腫更多。

1.1.2 自體移植模型的應(yīng)用：有關(guān)內(nèi)異癥類固醇激素及相關(guān)調(diào)節(jié)的研究多采用自體移植模型，為消除大鼠/小鼠發(fā)情周期的差異，往往去勢后給予肌注外源性雌激素造模。Burns等[4]發(fā)現(xiàn)雌激素受體(ER)α敲除小鼠的異位病灶小且數(shù)量少，而ERβ敲除小鼠的異位病灶與野生型小鼠差別不大，說明ERα在介導(dǎo)內(nèi)異癥的發(fā)生過程中占主導(dǎo)地位，ERα和ERβ相互作用可能會對內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)揮作用。

此外，自體移植模型也是研究內(nèi)異癥免疫炎癥機(jī)制及治療的良好模型。Umezawa等[5]通過微點(diǎn)陣分析技術(shù)檢測ICR 小鼠自體移植模型中移植物附著的腹膜(除去移植物)的早期各基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)造模后24 h～96 h，炎性因子、粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)基因呈高表達(dá)，而血管生成因子的表達(dá)降低，表明早期介導(dǎo)異位病灶形成的是粘附分子和炎癥反應(yīng)，而非血管生成。Efstathiou等[6]發(fā)現(xiàn)不同非甾體類抗炎藥抑制病灶的能力不同，塞來昔布、吲哚美辛、萘普生、布洛芬均有效，以塞來昔布作用最強(qiáng)，而阿司匹林則無效。

內(nèi)異癥對婦女生育力的影響的機(jī)制復(fù)雜，可能涉及卵泡發(fā)育、受精和著床等方面。Julie等[7]發(fā)現(xiàn)Sprague-Dawley大鼠造模后卵巢功能發(fā)生改變，形成的卵泡數(shù)量減少，黃素化未破裂卵泡增加，胚胎發(fā)育異常如染色體錯位、核與細(xì)胞質(zhì)分裂以及自發(fā)性流產(chǎn)增加。這些大鼠的雌性子代鼠也表現(xiàn)出類似的生殖異常，推測患子宮內(nèi)膜異位癥患者的后代可能存在永久的表觀遺傳變化。Lee等[8]發(fā)現(xiàn)造模后14周的CD1小鼠的在位內(nèi)膜基因表達(dá)異常，HOXA10表達(dá)下降甲基化明顯，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1(IGFBP1)表達(dá)降低，而PGR(α+β)mRNA表達(dá)增加且PGRβ/PGR(α+β)的比率增加，說明正常子宮內(nèi)膜出現(xiàn)在異常位置且形成內(nèi)異癥后，可以通過信號傳導(dǎo)途徑，導(dǎo)致在位內(nèi)膜的基因表達(dá)發(fā)生改變。

慢性盆腔疼痛是內(nèi)異癥的主要癥狀，疼痛發(fā)生機(jī)制及治療是近年來的研究熱點(diǎn)。 Alvarez等[9]將大鼠的子宮內(nèi)膜組織自體移植到腓腸肌中，鞘內(nèi)注射白介素6受體、神經(jīng)生長因子酪氨酸激酶受體和腫瘤壞死因子受體mRNA的反義寡脫氧核苷酸后，發(fā)現(xiàn)阻斷前兩個因子的表達(dá)后可有效降低移植部位的機(jī)械痛敏，表明異位病灶產(chǎn)生的痛覺介質(zhì)是導(dǎo)致內(nèi)異癥性盆腔疼痛的主要原因之一。

1.2 異體移植模型

1.2.1 異體移植模型的特點(diǎn)：異體移植是將人在位內(nèi)膜或異位組織移植到免疫缺陷動物體內(nèi)，動物包括裸鼠、SCID小鼠及NOD/SCID小鼠等。不論是增生期、分泌期還是月經(jīng)期在位內(nèi)膜都能成功地移植到裸鼠皮下或腹腔內(nèi)，形成的異位病灶在宏觀上和組織學(xué)上都類似于人異位內(nèi)膜樣病灶[10]。一般移植 5 d后即可見異位病灶與移植部位牢固粘附 ,常發(fā)生在腹壁、膀胱旁脂肪等部位,時間越長 ,病灶與裸鼠組織融合越明顯 ,盆腹腔粘連越重[11]。有研究發(fā)現(xiàn)人在位內(nèi)膜移植到SCID/NOD-SCID小鼠有更高的成活率，4周后也能更好的保持形態(tài)學(xué)特征和表達(dá)類固醇激素受體，因而，實(shí)驗(yàn)周期3周以上時宜選用SCID或NOD/SCID鼠[12]。SCID/NOD-SCID小鼠缺乏T和B淋巴細(xì)胞，但有NK細(xì)胞活力，而NOD/SCID)/γCnull(NOG)小鼠無NK細(xì)胞活力。Kikuchi-Arai M等[13]將生育期婦女的分泌期子宮內(nèi)膜移植入到去勢的NOD/SCID)/γCnull (NOG)小鼠腹腔內(nèi)，給予補(bǔ)充雌孕激素模擬人工周期，在組織學(xué)的水平上觀察到NOG小鼠在位內(nèi)膜表現(xiàn)出規(guī)律的月經(jīng)周期，類似人子宮內(nèi)膜的規(guī)律變化。

1.2.2 異體移植模型的應(yīng)用：基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中最重要的一組蛋白酶，它的周期性表達(dá)對子宮內(nèi)膜生長和重建至關(guān)重要，同時MMPs表達(dá)又受到甾體激素和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。夏玉芳等[14]研究發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜較正常內(nèi)膜MMP-2、VEGF蛋白表達(dá)增強(qiáng),TIMP-2蛋白表達(dá)減弱。

血管生成在內(nèi)異癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在異體模型中發(fā)現(xiàn)異位病灶血管發(fā)生并非來自裸鼠或SCID鼠，而來自于移植物，人子宮內(nèi)膜在黏附于宿主時保留自身的血管并發(fā)揮功能，表明異位病灶的血管生成或血管發(fā)生非?；钴S[15]。研究發(fā)現(xiàn)多巴胺激動劑卡麥角林(CB2)和喹高利特通過阻斷血管生成因子受體2(VEGFR2)發(fā)揮抗血管生成作用，從而減小異位病灶的大小[16]。

由于異體移植模型小鼠是免疫缺陷鼠，因此，不用于評估內(nèi)異癥免疫調(diào)節(jié)藥物療效的研究。

1.3 嚙齒類模型病灶檢測方法

光學(xué)成像技術(shù)利用非常靈敏的檢測儀器，可更好的定位和觀察植入組織的生長黏附、無創(chuàng)傷動態(tài)檢測異位病灶的形成和發(fā)展。目前，綠色熒光蛋白(GFP)生物發(fā)光技術(shù)在內(nèi)異癥動物模型中應(yīng)用最為廣泛，標(biāo)記子宮內(nèi)膜組織或細(xì)胞方式有2種：腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染和GFP轉(zhuǎn)基因動物。利用腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)標(biāo)記人內(nèi)膜組織，產(chǎn)生的病毒滴度高，轉(zhuǎn)染效率高，且可在體外較長期較穩(wěn)定表達(dá)，但GFP基因轉(zhuǎn)染入人子宮內(nèi)膜組織效率較低，而且熒光會隨著時間延長逐漸減弱，熒光大約3～4周后表達(dá)減退，因此該模型不太適合長期依賴熒光鑒別的組織[17]。.而增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)轉(zhuǎn)基因小鼠同系異體移植模型具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性，其移植的內(nèi)膜永久表達(dá)GFP，而且能清楚地辨別GFP標(biāo)記的內(nèi)膜組織[18]。

另外，有學(xué)者使用Vevo 770小動物超聲技術(shù)檢測小鼠腹腔子宮內(nèi)膜異位病變，該超聲探頭最高頻率達(dá)40MHZ，分辨率達(dá)到30μm，能夠很清楚的區(qū)分異位囊腫，且操作過程無創(chuàng)、可重復(fù)，是一項(xiàng)有前途的診療措施[19]。

1.4 嚙齒類模型的評價

大鼠、小鼠價格便宜、飼養(yǎng)方便、來源廣泛，可以大規(guī)模使用同基因的動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并且可以在不同的時間間隙觀察異位病灶，了解不同藥物和治療的效果，可用于研究異位病灶引起機(jī)體免疫方面的改變、藥物療效評價和副反應(yīng)的觀察，但是嚙齒類動物和人類的生殖生理有很多不同，且造模時通常將子宮內(nèi)膜和肌層一起移植，可能會影響病灶的發(fā)展。當(dāng)評價異位病灶的生長和大小時，肌層會占相當(dāng)大的部分，不能完全代表異位病灶的內(nèi)膜情形。異體移植模型可保留人類組織的形態(tài)學(xué)，對早期研究內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制、藥物治療方面更具說服力。但是，由于異體移植選用的是免疫缺陷小鼠，沒有完整的免疫系統(tǒng)，飼養(yǎng)條件高，不能耐受多次手術(shù)和采血檢測，并且仍存在不同程度的免疫應(yīng)答而對移植物發(fā)生排斥反應(yīng)，因而不適于研究環(huán)境因素及長效藥物。

2 靈長類動物模型

2.1 靈長類動物模型的特點(diǎn)

靈長類動物與人類的遺傳背景很相似，生殖生理和盆腔解剖也與人類最相近，且有規(guī)律月經(jīng)周期，有月經(jīng)內(nèi)膜脫落，是最理想的內(nèi)異癥模型。但因其價格昂貴、物種稀有，大多是受保護(hù)的瀕危動物，所以研究使用往往受到限制。

盡管目前已有靈長類動物自發(fā)性內(nèi)異癥的報(bào)道，但是發(fā)生率低，且發(fā)展緩慢，往往需要較長時間，因此一般都采用人為誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)異癥模型。靈長類模型多選擇狒狒、獼猴等。在早期的研究中，有學(xué)者將月經(jīng)血通過宮頸復(fù)位轉(zhuǎn)移進(jìn)恒河猴盆腔,或者通過閉塞宮頸增加月經(jīng)逆流誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)異癥模型[20]。目前大多采用開腹或腹腔注射將內(nèi)膜組織接種到腹腔，內(nèi)膜來源于靈長類動物的月經(jīng)期內(nèi)膜或切除其子宮來獲取內(nèi)膜組織。造模時，顆粒狀的內(nèi)膜組織較內(nèi)膜上清液成分移植成功率更高[21]。采用腹腔鏡連續(xù)觀察狒狒內(nèi)異癥病灶形成情況，發(fā)現(xiàn)移植后1月大多為紅色病灶，隨著病情進(jìn)展，病灶可變成黑色、藍(lán)色或白色等多種顏色，最終病灶可持續(xù)生長至接種后15個月[22]。

2.2 靈長類動物模型的應(yīng)用

早在1996年就有學(xué)者在狒狒模型發(fā)現(xiàn)輕度內(nèi)異癥不影響其妊娠率，而II-IV期內(nèi)異癥動物的生育力下降[23]，近年來關(guān)于異位病灶對在位內(nèi)膜的影響成為研究熱點(diǎn)。Afshar 等[24]將狒狒月經(jīng)期內(nèi)膜接種至其腹腔內(nèi)各個部位，然后于造模后1、 3、 6～7、10～12 和 15～16 月收集分泌中期在位內(nèi)膜，利用基因芯片技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)后1月即有4331 個基因表達(dá)異常；每個采樣階段均有數(shù)個信號通路失調(diào)，包括表皮生長因子、 ERK/MAPK 和 PI3/AKT等；造模后15月發(fā)現(xiàn)孕激素抵抗更加明顯。說明在位內(nèi)膜不是固有缺陷的子宮內(nèi)膜，它受到異位病灶的影響后，導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生異常。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)狒狒模型中異位病灶中端粒酶與核仁素表達(dá)增加，γ-H2AX表達(dá)缺失，6～12月后在位內(nèi)膜也出現(xiàn)同樣的改變，說明異位病灶有很強(qiáng)的增殖潛能，同時對在位內(nèi)膜產(chǎn)生了影響[25]。

靈長類動物模型也是研究內(nèi)異癥遺傳模式和環(huán)境影響因素的最佳模型。越來越多證據(jù)提出內(nèi)異癥有遺傳基礎(chǔ)，基因傾向是發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)。Zondervan等[26]對9個核心家族1602只雌性獼猴進(jìn)行內(nèi)異癥發(fā)病率的群落和系譜分析，發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥組比對照組的平均血緣系數(shù)和同胞患病率增高，說明獼猴發(fā)生內(nèi)異癥具有家族聚集性。Fakis等[27]在獼猴模型中研究芳香胺N-乙酰轉(zhuǎn)移酶2(NAT2)對多種環(huán)境毒物的乙?；饔眉昂涂贵w的結(jié)合能力，說明NAT2代謝活性的差異和某些環(huán)境污染物與內(nèi)異癥易感相關(guān)。

3 結(jié)論

綜上，靈長類動物模型仍然是最適合研究子宮內(nèi)膜異位癥的模型，因?yàn)樗罱咏祟惿硖攸c(diǎn)，包括盆腔解剖，生殖生理的特點(diǎn)和免疫特征。內(nèi)異癥動物模型對研究內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制和探索新的治療方案都有極大的價值，但現(xiàn)有的建模方法都有各自的不足之處，因此在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方法時必須衡量它們的實(shí)用性，充分發(fā)揮動物模型的優(yōu)點(diǎn)，更好地揭示內(nèi)異癥的病因及發(fā)病機(jī)制，指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

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