非小細胞肺癌中microRNAs與EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥機制的研究進展

段曉陽 史健

近幾年，肺癌在發(fā)達及發(fā)展中國家的發(fā)病率逐年增高，即使在發(fā)達國家，5年相對生存率也僅為16%[1]。肺癌患者中80%-85%的組織學(xué)類型為非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC），其中約70%的患者就診時已處于中晚期[2]，往往失去了手術(shù)根治的機會，只能采取以放、化療等為基礎(chǔ)的綜合治療。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，靶向治療逐漸用于臨床并獲得了良好的療效，其中，以吉非替尼（易瑞沙）、厄洛替尼（特羅凱）為代表的腫瘤表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）的應(yīng)用最為廣泛，在一段治療時間內(nèi)能夠獲得良好的療效，延長患者生存期，給許多中晚期肺癌患者帶來了新的希望，但最終均會產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，導(dǎo)致藥物敏感性差，出現(xiàn)疾病進展。目前耐藥仍是面臨的主要棘手問題之一，尋找預(yù)測肺癌患者藥物敏感性的標(biāo)記或解決耐藥性的方法是亟待需要解決的問題，研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA（microRNAs, miRNAs）為此提供了突破口，它可以影響腫瘤細胞對吉非替尼敏感性，參與EGFR-TKI耐藥。因此，進一步明確miRNAs與EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥之間的關(guān)系有很重大的臨床意義，不僅在預(yù)測藥物敏感性，提供個體化治療方面，甚至在解決耐藥問題等方面均提供了可能。

1 NSCLC與EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥機制

近年來，在NSCLC分子生物學(xué)研究發(fā)展中，EGFR是目前NSCLC臨床治療研究的重要靶點之一。EGFRTKIs在NSCLC臨床治療中，尤其是對于相對敏感的患者，無論是在一線或多線治療均可延長患者的無疾病進展生存時間及整體生存期，并且毒副反應(yīng)較輕，但是對于部分患者卻無明顯的療效，而且起初對EGFR-TKIs敏感的患者，在使用EGFR-TKIs獲得良好療效一段時間（約1年-1.5年）后，均會無一例外地出現(xiàn)疾病進展，即所謂的繼發(fā)性耐藥[3]。

EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥涉及多種作用機制，已經(jīng)明確的兩種耐藥機制是：①細胞內(nèi)EGFR基因受體結(jié)合區(qū)突變（T790M），即EGFR基因外顯子20的第790位密碼子位點的氨基酸由蘇氨酸（threonine, T）突變?yōu)榈鞍彼幔╩ethionine, M）。這種突變使EGFR的細胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)區(qū)域發(fā)生改變，增強了催化區(qū)域與ATP的結(jié)合能力，抑制了其與EGFR-TKIs的結(jié)合，導(dǎo)致下游增殖相關(guān)信號不能得到有效抑制，由此產(chǎn)生了繼發(fā)性耐藥[4]。②Met基因擴增。原癌基因Met是編碼肝細胞生長因子的受體蛋白，屬于受體酪氨酸激酶家族，具有酪氨酸激酶活性。Engelman等[5]初次發(fā)現(xiàn)，在EGFR-TKIs耐藥的肺癌樣本中，Met基因出現(xiàn)擴增的頻率較高，Met基因擴增占到22%。Met基因的擴增可不依賴于EGFR，而是通過ERBB3激活下游特定的EGFR/ERBB家族受體PI3K/AKT和RAS/ERK等信號通路，導(dǎo)致肺癌細胞對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥。

然而，仍有30%的NSCLC患者EGFR-TKIs耐藥機制不能明確。這些耐藥機制包括：①上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。上皮細胞通過特定的程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學(xué)過程，導(dǎo)致惡性腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在EMT過程中，E-鈣粘蛋白和伽馬連環(huán)蛋白等上皮連接蛋白的缺失，間充質(zhì)波形蛋白、纖粘連蛋白等間質(zhì)蛋白增多。E-鈣粘蛋白主要是激活EGFR并調(diào)控下游信號通路，增強TKI藥物敏感性。研究[6]發(fā)現(xiàn)，較上皮表型成分，間質(zhì)表型更易發(fā)生EGFR-TKI耐藥，可能是由于間質(zhì)細胞引起非EGFR依賴的PI3K/AKT通路的激活，降低了腫瘤細胞增殖對EGFR的需求，從而導(dǎo)致了NSCLC對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥。②第10號染色體磷酸酶和張力蛋白同源缺失基因（phosphatase and tensin homolog deleted onchromosome ten,PTEN）基因突變。PTEN作為抑癌基因，其蛋白產(chǎn)物可以水解磷酯酰肌醇3磷酸第3位磷酸基團，抑制EGFR下游PI3K/AKT信號通路的激活，介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，發(fā)揮抑癌基因的作用。然而PTEN通過等位基因缺失、突變和甲基化等突變，導(dǎo)致其抑癌作用缺失。研究[7]發(fā)現(xiàn)，PTEN基因缺失使Erk通路異常激活，抵抗腫瘤細胞凋亡，導(dǎo)致EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥。③胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-1R）的激活。IGF-1R是非EGFR依賴的TKI受體。由于IGF1R激活PI3K/AKT信號通路抑制TKIs藥物的作用，導(dǎo)致了NSCLC細胞對TKI產(chǎn)生耐藥[8]。但當(dāng)IGF-1R信號通路受到抑制時，則可能會延緩或阻止NSCLC對TKI耐藥的產(chǎn)生。最近Hurbin等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在對EGFR-TKIs治療反應(yīng)上，肺粘液腺癌及非粘液腺癌類型之間是不同的。粘液腺癌過表達IGF1R（P＜0.000,1）及有頻繁的KRAS突變的傾向雙調(diào)蛋白（P=0.004）的表達。而非粘液腺癌則過表達EGFR（P＜0.000,1）和有頻繁的EGFR突變（P=0.037）傾向TTF-1（P＜0.000,1）的表達。高IGF1R（P=0.02）表達及低TTF-1（P=0.02）表達與吉非替尼治療下疾病進展有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)在吉非替尼耐藥H358粘液細胞中存在EGFR和IGF1R信號通路，通過抗雙調(diào)蛋白及IGF1R治療可增強H358細胞對吉非替尼誘導(dǎo)的細胞凋亡敏感性，從而克服粘液腺癌對EGFR-TKIs耐藥。因此，在非EGFR突變的肺癌細胞H358中，IGF-1R同樣也可引起TKI耐藥的產(chǎn)生[10]。④EGFR擴增7號染色體的缺失。最近Furugaki等[11]研究發(fā)現(xiàn)一種新的耐藥機制，即EGFR擴增7號染色體的缺失，通過建立對厄洛替尼耐藥NSCLC細胞株進一步檢測其耐藥機制。研究發(fā)現(xiàn)，在76.47%耐藥細胞中，EGFR復(fù)制數(shù)量比母細胞減少約12.5%。并且，在B10這個耐藥細胞群中，幾乎100%細胞為EGFR不擴增。 約97.5%母細胞顯示EGFR擴增，但仍有2.5%為EGFR不擴增細胞。與耐藥細胞株B10相比，一種從厄洛替尼耐藥細胞中孤立出來的EGFR不擴增克隆4D8也產(chǎn)生耐藥。并且在4D8和B10中均發(fā)現(xiàn)了EGFR擴增7號染色體的損失。因此我們考慮EGFR擴增7號染色體的缺失為EGFR突變細胞株HCC827對低劑量水平厄洛替尼耐藥的原因，但高劑量則會阻止耐藥的發(fā)生。⑤CRKL基因的擴增。Suda等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在1/11的EGFR突變肺癌患者的TKIs繼發(fā)性耐藥中發(fā)現(xiàn)CRKL基因的擴增。通過對11例TKIs繼發(fā)性耐藥臨床樣本及來自7例解剖患者的39腫瘤標(biāo)本的CRKL基因的拷貝數(shù)量分析，發(fā)現(xiàn)CRKL基因的拷貝數(shù)量在EGFR-TKI敏感母細胞及繼發(fā)性耐藥的子代細胞是相同的；并且，阻止CRKL基因的擴增并不能逆轉(zhuǎn)臨床腫瘤標(biāo)本EGFR-TKI耐藥的發(fā)生。因此，CRKL基因擴增是EGFR突變肺癌患者的TKIs繼發(fā)性耐藥中罕見的耐藥機制。

2 微小RNA（microRNAs, miRNAs）在NSCLC中的作用

miRNAs是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約22個-26個核苷酸的非編碼小分子RNA，參與轉(zhuǎn)錄后水平基因的表達調(diào)控。近年來，miRNAs成為腫瘤學(xué)研究熱點，miRNAs僅占人類基因的1%，卻調(diào)控了約30%的人類編碼蛋白的基因，參與了包括肺癌在內(nèi)的許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13,14]，起到癌基因或抑癌基因的作用，另外，miRNAs在臨床腫瘤診療過程中也具有多種用途，可以作為肺癌早期診斷的標(biāo)志物、判斷預(yù)后的指標(biāo)，甚至還可能成為一種新的治療手段。其異常表達、突變或異常加工均會影響靶基因miRNAs的正常功能，導(dǎo)致蛋白水平表達異常，繼而通過影響相關(guān)的細胞信號通路改變腫瘤細胞對藥物的敏感性，最近研究[15]發(fā)現(xiàn)，miRNAs參與了多種腫瘤耐藥相關(guān)，尤其是NSCLC，并且可以影響腫瘤細胞對吉非替尼等藥物敏感性，參與EGFR-TKIs耐藥。

3 miRNAs與EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥關(guān)系

3.1 miRNAs與EGFR異常表達 EGFR異常表達會影響其對EGFR-TKIs藥物的敏感性。T790M突變使TKI與EGFR結(jié)合受阻，不能有效抑制其下游增殖相關(guān)信號，從而導(dǎo)致EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥產(chǎn)生。Rai等[16]研究發(fā)現(xiàn)，表達miRNA-7質(zhì)粒脂質(zhì)體可以通過作用于EGFR信使RNA 3'非翻譯區(qū)而克服EGFR-TKI耐藥。通過在PC-9、H3255（EGFR-TKI敏感細胞株）及RPC-9、H1975（含有T790M突變的耐藥細胞株）中轉(zhuǎn)染表達miRNA-7質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)miR-7明顯抑制這四種細胞的生長，并且胰島素樣生長因子1受體（insulin receptor substrate-1, IRS-1），RAF-1及EGFR表達均受到抑制。在應(yīng)用RPC-9、H1975的小鼠異種移植模型中發(fā)現(xiàn)，被轉(zhuǎn)染表達miRNA-7質(zhì)粒的細胞受到抑制，在其余腫瘤細胞中，IRS-1、RAF-1及EGFR表達均也受到抑制。因此，轉(zhuǎn)染表達miRNA-7質(zhì)粒脂質(zhì)體可以克服（含有T790突變）肺癌細胞中EGFR-TKI耐藥情況。另外，Webster等[8]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-7通過與人類EGFR基因的3’-UTR3個位點結(jié)合，抑制EGFR基因的表達并能降低EGFR信號傳導(dǎo)過程中兩個關(guān)鍵受體AKT和（或）ERK1/2的磷酸化水平，使腫瘤細胞被阻滯于G1期，從而阻止細胞周期正常循環(huán)，減少細胞增殖，降低細胞活力，導(dǎo)致細胞凋亡。此外，Hu等[17]研究表明，miRNA-128在NSCLC組織及細胞中起到明顯的下調(diào)作用，并且與癌的病理階段和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，異常過度表達miR-128明顯抑制肺癌細胞體外增殖、集落形成、轉(zhuǎn)移及入侵，并且誘導(dǎo)G1受阻和凋亡。更重要的是，異常過度表達miR-128還可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）-C的表達及減少包括VEGF-C 3'-非翻譯區(qū)域熒光素酶的活動。NSCLC細胞過度表達miR-128及人類臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECs）會導(dǎo)致VEGF-A、VEGFR-2及VEGFR-3（它們是腫瘤血管和淋巴血管生成關(guān)鍵因素）表達下降，使細胞外調(diào)控信號傳導(dǎo)激酶（extracellularsignal regulated kinase, ERK）的磷酸化減少，抑制磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K）/AKT和p38信號通路（其中ERK、AKT均EGFR信號傳導(dǎo)過程中兩個關(guān)鍵受體）。因此，miR-128在NSCLC腫瘤生成、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面有重要作用，抑制miR-128不僅可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，而且使患者對吉非替尼等靶向藥物更加敏感，并且能獲得較長的生存期。

3.2 miRNAs與Met基因的擴增 在NSCLC臨床治療中，Met基因通過調(diào)節(jié)miRNAs的表達，參與對EGFR-TKI的繼發(fā)性耐藥。Garofalo等[18]通過對TKI耐藥的EGFR野生型肺癌細胞株Calu-1的研究，發(fā)現(xiàn)EGF和Met基因均可調(diào)控miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-221和miRNA-222的表達，同時沉默EGF和Met基因后，4種miRNAs的表達量均明顯下降，而miRNA-103和miRNA-203只受Met基因的調(diào)控，沉默Met基因后，二者的表達水平均明顯上升。受EGF和Met基因雙重調(diào)控的4種基因作用于TKI敏感相關(guān)的凋亡蛋白酶激活因子1（apoptotic peptidase activating factor 1, APAF-1）和細胞凋亡輔助蛋白BCL2-like 11；而miRNA-103和miRNA-203作用于TKI耐藥相關(guān)的SRC［v-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral oncogene homolog(avian)］和蛋白激酶Cε（protein kinase Cε, PKCε），因此上述基因產(chǎn)物均可通過抑制或激活Met依賴的AKT和ERK信號通路影響TKI的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，EGFR突變型肺癌細胞株HCC827起初對吉非替尼敏感，在長期暴露于藥物而產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥后，出現(xiàn)Met基因擴增以及miRNA-30b、miRNA-30c、miRNA-221和miRNA-222的高表達及miRNA-103和miRNA-203的低表達，因此4種miRNA過表達及后2種miRNA低表達均可使肺癌細胞對TKI產(chǎn)生耐藥。另外研究發(fā)現(xiàn)，使用 HCC827細胞［EGFR基因19外顯子缺少的肺腺癌細胞株］，在此細胞的基礎(chǔ)上培養(yǎng)吉非替尼耐藥細胞株（HCC827/GR）。檢測耐藥細胞株中Met的表達，并使用RT-PCR的方法檢測miR-34a的表達；發(fā)現(xiàn)在耐藥HCC827/GR細胞株中，miR-34a低表達，Met高表達，而在HCC827細胞株中，miR-34a高表達，Met低表達。TargetScan生物信息學(xué)軟件提示，miR-34a可能存在655個下游靶點，Met為其中之一，Met基因的3′UTR的51-57及165-2171為miR-34a的結(jié)合靶點。因此，miR-34a可能通過調(diào)控靶基因Met而參與EGFR-TKI的繼發(fā)性耐藥。此外，Donev等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抑制EGFR及MET下游分子PI3K可以通過抑制Akt磷酸化、誘導(dǎo)凋亡克服在EGFR突變肺癌細胞PC-9和 HCC827由HGF介導(dǎo)的EGFR-TKI耐藥。

3.3 miRNAs與EMT EMT發(fā)生過程中，上皮表型標(biāo)志物E-鈣粘著蛋白（E-cadherin）表達下調(diào)，間質(zhì)表型標(biāo)志物波形蛋白（vimentin）表達上升，使上皮細胞失去細胞極性及與基膜連接的上皮表型，獲得與細胞遷移和侵襲、抗細胞凋亡以及降解細胞外基質(zhì)等能力相關(guān)的間質(zhì)表型，導(dǎo)致上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力，甚至參與耐藥等重要生物學(xué)過程。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在EMT過程中充當(dāng)關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。Kitamura等[20]探討EMT相關(guān)miRNAs表達及EGFR-TKI耐藥之間相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)miR-134、miR-487b及miR-655（為EMT肺腺癌細胞中位于染色體14q32的同一集落）過表達。MAGI2（membrane-associated guanylate kinase inverted 2）是這些miRNAs的靶標(biāo)，同時也是PTEN的一個支架蛋白，在TGF-β1激活引起EMT的A549細胞中減少。過度表達miR-134及miR-487b可促進EMT現(xiàn)象發(fā)生及對吉非替尼耐藥的發(fā)生。反之，則會阻止EMT現(xiàn)象發(fā)生及反轉(zhuǎn)吉非替尼耐藥。根據(jù)MiR-134/487b/655通過直接調(diào)控MAGI2表達，促進由TGF-β1誘導(dǎo)的EMT現(xiàn)象發(fā)生及影響吉非替尼耐藥的發(fā)生。因此，miR-134/miR-487b/miR-655集落群在EMT現(xiàn)象發(fā)生的肺腺癌患者中可能成為一種新的治療目標(biāo)。另外Ahmad等[21]研究發(fā)現(xiàn)，并非所有的NSCLC患者均能從TKI藥物中獲益，抑制siRNA調(diào)控或者阻斷Hh藥理作用均能解除厄洛替尼對NSCLC的耐藥性，這也導(dǎo)致了TGF-β1誘導(dǎo)的A549（A549M）增敏及間質(zhì)表型H1299細胞在厄洛替尼聯(lián)合順鉑治療中所伴的腫瘤干細胞（cancer stem cell, CSC）標(biāo)記物（Sox2, Nanog,EpCAM）的上調(diào)及miR-200和let-7家族miRNAs的下調(diào)，異常上調(diào)miRNAs，尤其是miR-200和let-7家族能明顯減少A549M細胞對厄洛替尼的耐藥。EMT細胞中由GDC-0449（是在Hh通路上的一種小分子G蛋白偶聯(lián)受體的拮抗劑）介導(dǎo)的Hh信號抑制導(dǎo)致CSC標(biāo)記物的衰減及miR-200和let-7家族miRNAs的上調(diào)，從而導(dǎo)致了EMT細胞對藥物治療的敏感性。因此，在NSCLC中，Hh信號通路通過誘導(dǎo)EMT導(dǎo)致TKI藥物耐藥，因此，針對Hh通路可能導(dǎo)致EMT表型逆轉(zhuǎn)，進而增強NSCLC患者TKI藥物治療的有效性。

3.4 miRNAs與PTEN基因缺失 研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因缺失可能參與EGFR-TKI繼發(fā)性耐藥的產(chǎn)生。Li等[22]發(fā)現(xiàn)，將慢病毒載體轉(zhuǎn)染到EGFR-TKI敏感肺腺癌PC9細胞株及耐藥的PC9R細胞株中，調(diào)控miR-21的表達，通過檢測由其干擾調(diào)控的PTEN和PDCD4的表達。發(fā)現(xiàn)miR-21在EGFRTKI耐藥細胞株P(guān)C9R中過表達。miR-21水平與PTEN和PDCD4表達相反，卻與PI3K/Akt通路呈正相關(guān)。用慢病毒載體阻止miR-21可引起PC9R的凋亡，因此，我們發(fā)現(xiàn)miR-21通過下調(diào)PTEN和PDCD4的表達及激活PI3K/Akt通路引起NSCLC中EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥。Wang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，miR-214在HCC827/GR（吉非替尼耐藥細胞株）中明顯上調(diào)，并且miR-214和PENT在HCC827/GR中相反表達，下調(diào)miR-214可改變PENT和p-AKT的表達及恢復(fù)HCC827/GR對吉非替尼的敏感性。它通過PTEN/AKT信號通路調(diào)控HCC827對吉非替尼的繼發(fā)性耐藥，而且抑制miR-214可能會逆轉(zhuǎn)EGFR-TKIs治療的繼發(fā)性耐藥。

3.5 miRNAs與其他相關(guān)耐藥機制 Gao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤中，miRNAs是不受控制的小的非編碼RNA，PC9非小細胞持續(xù)暴露于吉非替尼半年，獲得吉非替尼耐藥模型（PC9GR）。在PC9GR細胞中，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p有很大比例下調(diào)。G蛋白受體124（GPR124）是miR-138-5p的直接目標(biāo)。在NSCLC細胞中，GPR124的表達因miR-138-5p在蛋白及mRNA水平受到抑制。更重要是，下調(diào)GPR124會模仿miR-138-5p對吉非替尼敏感性的效果，因此，下調(diào)miR-138-5p有助于吉非替尼耐藥，但恢復(fù)miR-138-5p或阻止GPR124可能會成為潛在克服NSCLC吉非替尼耐藥的治療方法。

4 討論與展望

在肺癌治療過程中，與傳統(tǒng)的化療相比，EGFRTKI治療無疑具有療效好、毒副反應(yīng)輕的特點，但是在其獲得良好療效后均會出現(xiàn)耐藥的現(xiàn)象。關(guān)于腫瘤細胞對EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥的原因有很多方面，任何影響藥物作用或干擾信號通路傳導(dǎo)的事件均有可能導(dǎo)致耐藥的發(fā)生。miRNA是基因表達的調(diào)控者，通過精密、復(fù)雜的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控人類的生命活動。因此miRNA異?？梢鹉[瘤耐藥相關(guān)通路中基因表達水平的改變，從而破壞原有的平衡，導(dǎo)致耐藥。目前，miRNA在肺部腫瘤耐藥方面的研究已經(jīng)取得一些進展，但是仍有更多方面的內(nèi)容及問題有待于進一步研究。我們相信隨著miRNA與腫瘤耐藥關(guān)系研究的進展，miRNA將為我們在腫瘤的預(yù)測及治療方面開拓更為廣闊的空間!