EGFR-TKI對肺癌新生淋巴管的影響及其意義

蔡明輝 楊新穎 姜寶紅 滕?？?潘雁 毛鋒 申屠陽

原發(fā)性支氣管肺癌（以下簡稱肺癌）遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移最常見的途徑是淋巴擴散，約占50%，成為影響總體療效的主要原因[1]。研究[2]表明，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）高表達(dá)的腫瘤患者易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，EGFR與血管內(nèi)皮生長因子（vascular epidermal growth factor, VEGF）在肺癌組織中的高表達(dá)呈正相關(guān)并促進(jìn)肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。EGFR與VEGF表達(dá)的正相關(guān)，似乎隱約提示EGFR在肺癌新生淋巴管的生成中可能發(fā)揮了一定的作用，而EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI）是否具有抑制淋巴管新生和肺癌淋巴轉(zhuǎn)移作用，迄今均未見報道，本文擬對此進(jìn)行初步探索研究。

1 資料和方法

1.1 研究對象 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)：實驗所用細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海藥物研究所培養(yǎng)并保存于液氮中。細(xì)胞株（NCI-H1975）培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液，內(nèi)含10%胎牛血清、L-谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素100 IU/mL和鏈霉素100 μg/mL。所有細(xì)胞均于37oC，5%CO2常規(guī)培養(yǎng)。實驗動物：BALB/cA裸小鼠，雌性，4周-5周齡，體重（17±2）g，由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供，生產(chǎn)合格證編號：SCXK（滬）2008-0017；使用合格證編號：SYXK（滬）2008-0049。實驗分2組，每組動物數(shù)為5只。

1.2 實驗方法 取生長旺盛期的瘤組織剪切成1.5 mm3左右，在無菌條件下，接種于裸小鼠右側(cè)腋窩皮下。裸小鼠皮下移植瘤用游標(biāo)卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100 mm3-200 mm3后將動物隨機分組。BIBW2992（Gilotrif，阿法替尼）20 mg/kg組，每天口服給藥1次，連續(xù)給藥3周。溶劑對照組則給等量0.5%CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）。整個實驗過程中，每周2次測量移植瘤直徑，同時稱量小鼠體重。給藥3周后處死小鼠，完整取下移植瘤，石蠟包埋，準(zhǔn)備下一步免疫組化實驗。藥物BIBW2992為白色粉末，每周用0.4%吐溫80和0.5%羧甲基纖維素鈉配置成混懸液后使用。

1.3 免疫組織化學(xué)實驗步驟 ①石蠟切片脫蠟，水化后，用磷酸緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）沖洗3次，每次3 min；②高壓組織抗原修復(fù)（高壓滅菌鍋到有壓力時，持續(xù)10 min，關(guān)閉高壓鍋，放氣自然冷卻）用PBS沖洗3次，每次3 min；③每張切片加50 μL 3%（20 μL PBS+80 μL甲醇+11 μL 30%過氧化氫），室溫孵育10 min，用PBS沖洗3次，每次3 min；④每張切片加100 μL 10%山羊血清（900 μL PBS+100 μL山羊血清），室溫孵育15 min；⑤除去10%山羊血清后，每張片子加即用型D2-40鼠抗人單克隆抗體（購自福州邁新生物公司，一抗），室溫孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑥除去PBS后，每張片子加50 μL即用型MaxVisionTM（羊抗鼠IgG聚合物，二抗）試劑，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；⑦除去PBS后，每張片子加100 μL新配的DAB，反應(yīng)2 min，顯微鏡下觀察；⑧自來水沖洗，蘇木染色10 min，流水4 min，1%鹽酸乙醇分化30 s，流水返藍(lán)；⑨脫水，樹脂封片。

1.4 病灶內(nèi)新生淋巴管密度的定量測定 新生淋巴管密度（lymphatic vessel density, LVD）的評測根據(jù)Widner[4]。在顯微鏡下觀察切片，選擇目鏡10倍，先在10×4倍鏡下，選擇有明確高表達(dá)的淋巴管區(qū)域，即“熱點”的地方。每個樣本依切片組織實際區(qū)域選擇不低于四個熱點區(qū)域，在10×20倍鏡下觀察，計數(shù)淋巴管數(shù)，計算平均數(shù)值即為新生淋巴管密度。肺癌灶中各區(qū)域淋巴管的密度可能是非均勻分布的，但4個“熱點”地區(qū)淋巴管密度能夠具有代表性。

1.5 新生淋巴管腫瘤侵犯的鑒定 新生淋巴管腫瘤侵犯（lymphatic vessels invasion, LVI）：如在顯微鏡下病灶至少有一個D2-40 IHC染色陽性的新生淋巴管管腔中存在腫瘤細(xì)胞團(tuán)，即為淋巴管侵犯陽性LVI（+）[5]。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 利用Image-Pro Plus 6.0軟件，測量每個“熱點”區(qū)域的新生淋巴管最長徑、面積。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BIBW2992對人肺癌NCI-H1975荷瘤裸小鼠的腫瘤抑制作用 小鼠按照上述方法給藥21天后，安樂處死，完整剝離瘤組織。圖1可見，對照組移植瘤腫瘤體積相對較大，可見腫瘤不規(guī)則生長，見分葉狀。BIBW2992可以明顯地抑制人肺癌NCI-H1975裸小鼠移植瘤的生長，腫瘤體積相對較小，腫瘤多呈球形，形態(tài)較規(guī)則。

2.2 BIBW2992對NCI-H1975裸小鼠移植瘤瘤量的影響 人肺癌NCI-H1975荷瘤裸小鼠給藥21天之后，BIBW2992可以明顯抑制小鼠腫瘤的生長，給藥組小鼠瘤重為（1.37±0.55）g，而對照組的小鼠瘤重為（2.12±0.36）g，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.035）。

2.3 BIBW2992對NCI-H1975裸小鼠移植瘤相對腫瘤體積的影響 圖2為兩組小鼠相對腫瘤體積的對比曲線圖。整個實驗過程中，每周2次測量移植瘤直徑。腫瘤體積（tumor volume, TV）的計算公式為：TV=1/2×a×b2，其中a、b分別表示長、寬。根據(jù)測量的結(jié)果計算出相對腫瘤體積（relative tumor volume, RTV），計算公式為：RTV=Vt/V0。其中V0為分籠給藥時（即d0）測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。給藥21天后，對照組的小鼠相對腫瘤體積為（22.48±6.85）mm3，給藥組小鼠相對腫瘤體積為（14.75±5.61）mm3，給藥組小鼠的相對腫瘤體積明顯小于對照組，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.031）。

2.4 NCI-H1975裸小鼠移植瘤瘤內(nèi)新生淋巴管的形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 在本實驗10例小鼠移植瘤的瘤組織中，D2-40標(biāo)記下的新生淋巴管顯示為單層的、棕黃色、壁薄的管腔，管腔內(nèi)沒有紅細(xì)胞出現(xiàn)。淋巴管非均勻出現(xiàn)在腫瘤組織中，大部分出現(xiàn)在腫瘤間質(zhì)組織。證明D2-40標(biāo)記的淋巴內(nèi)皮特異性較高。裸小鼠移植瘤中新生淋巴管的密度和腫瘤細(xì)胞侵犯的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)見圖3。

2.5 兩組NCI-H1975裸小鼠移植瘤新生淋巴管密度的比較對照組瘤組織內(nèi)新生淋巴管的密度范圍為6個-21個[（10.44±3.02）個]，給藥組的范圍為3個-13個[（6.44±1.58）個]，兩組形態(tài)特征比較見圖3C和圖3D。給藥組的新生淋巴管密度明顯小于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.023）。

2.6 兩組NCI-H1975荷瘤裸小鼠瘤組織新生淋巴管腫瘤細(xì)胞侵犯的比較 統(tǒng)計對照和給藥兩組，共10例樣本，對照組病灶內(nèi)見新生淋巴管腫瘤細(xì)胞侵犯2例，給藥組可見1例有腫瘤細(xì)胞侵犯。進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)BIBW2992對于瘤細(xì)胞的新生淋巴管侵犯的影響無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.519）。

2.7 兩組NCI-H1975荷瘤裸小鼠瘤組織中新生淋巴管面積的比較 我們對不同組別的小鼠瘤組織中的新生淋巴管面積進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)BIBW2992給藥組的移植瘤瘤組織的新生淋巴管平均面積[（57.42±39.45）μm2]明顯小于對照組[（87.29±49.72）μm2]，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.006）。

2.8 兩組NCI-H1975荷瘤裸小鼠瘤組織內(nèi)新生淋巴管最長徑的比較 BIBW2992給藥組的移植瘤組織內(nèi)新生淋巴管的最大徑為（8.57±2.69）μm，明顯小于對照組的新生淋巴管長徑（11.13±2.98）μm，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）。

3 討論

肺癌經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移是最常見的轉(zhuǎn)移途徑，是影響臨床療效的主要原因。臨床研究[6]表明，約80%的腫瘤有序地從原發(fā)灶通過淋巴管先蔓延淋巴結(jié)再傳播到遠(yuǎn)處器官。

EGFR高表達(dá)的腫瘤患者易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移且復(fù)發(fā)率高[2]。近期研究[3]發(fā)現(xiàn)，EGFR與VEGF在非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer, NSCLC）組織中的陽性表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.01），兩者的高表達(dá)可促進(jìn)肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，VEGF主要通過促進(jìn)新生血管的形成加速肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。EGFR在新生淋巴管的生成中是否發(fā)揮一定的作用值得關(guān)注，研究EGFR-TKI對腫瘤組織新生淋巴管的影響，探索靶向藥物抑制肺癌轉(zhuǎn)移的可能性，有望為肺癌的靶向治療提供新的研究視角。

Padera等[7]發(fā)現(xiàn)缺乏瘤內(nèi)淋巴管的腫瘤仍可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴系統(tǒng)表面積的增大與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移機率的增加一致，這為新生淋巴管參與腫瘤轉(zhuǎn)移提供了理論依據(jù)。臨床研究表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌病灶淋巴管密度明顯升高，并與較差的總體生存率相關(guān)，新生淋巴管可作為預(yù)測肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要因素[8]，抑制腫瘤新生淋巴管能明顯減少癌細(xì)胞的擴散轉(zhuǎn)移[9-11]。本研究利用靶點突變的耐藥細(xì)胞株NCI-H1975建立小鼠肺癌移植瘤模型，在抑制劑與EGFR不可逆結(jié)合，抑制腫瘤組織生長的同時，尋找其可能的新生淋巴管抑制作用。結(jié)果表明，BIBW2992給藥組的移植瘤小鼠瘤內(nèi)新生淋巴管密度明顯少于對照組（6.44±1.58 vs 10.44±3.02, P=0.023），提示EGFR-TKI在抑制腫瘤生長的同時，明顯抑制腫瘤組織內(nèi)淋巴管的新生。

圖1 BIBW2992對于NCI-H1975裸小鼠移植瘤的生長抑制作用Fig 1 Inhibitory effect of BIBW2992 on transplanted NCI-1975 in nude mice

圖2 BIBW2992對人肺癌NCI-H1975裸小鼠移植瘤相對腫瘤體積的影響Fig 2 Inhibitory effect of BIBW2992 on relative tumor volume in transplanted NCI-1975 in nude mice

圖3 NCI-H1975裸小鼠移植瘤瘤內(nèi)新生淋巴管的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)。A：對照組（IHC染色，10×20）病灶內(nèi)的新生淋巴管，棕黃染色，壁薄管腔，管腔內(nèi)無紅細(xì)胞，癌細(xì)胞團(tuán)中很少出現(xiàn)新生淋巴管，主要位于腫瘤組織邊緣；B：20 mg/kg用藥組（IHC染色，10×20）病灶內(nèi)新生淋巴管被棕黃染標(biāo)記，而血管內(nèi)皮不能被D2-40顯示，血管（紅色箭頭所示）管壁無黃染；C：對照組（IHC染色，10×20）病灶內(nèi)的新生淋巴管，管腔較大，數(shù)目較多；D：20 mg/kg給藥組新生淋巴管管腔相對較小，數(shù)目相對較少（IHC染色，10×20）；E：對照組（IHC染色，10×20）瘤組織的新生淋巴管中可見腫瘤細(xì)胞侵犯（紅色箭頭），定義為新生淋巴管侵犯LVI（+）。Fig 3 Morphological features of lymphangiogenesis in NCI-1975 transplanted nude mice. A: Control group (IHC staining, 10×20): Newborn lymphatic vessels in tumor tissue determined by immunohistochemistry, which mainly located in the tumor edge, with brown staining, thin wall, and no red blood cells in the lumen. Cancer cells seldom appear in newborn lymphatic; B: 20 mg/kg treatment group (IHC staining, 10×20): Newborn lymphatic vessels were marked by D2-40, but vascular endothelial cannot be stained, as shown by the red arrow in the figure; C:Control group (IHC staining, 10×20): Larger and more lymphatic vessels were found in control group than those in treatment group; D: 20 mg/kg treatment group (IHC staining, 10×20): Less lymphatic vessels were found in treatment group, with smaller lumen than in the control group; E:Control group (IHC staining, 10×20): Tumor cells were found in lymphatic (red arrow), defined as the newborn lymphatic invasion LVI (+). LVI:lymphatic vessels invasion; IHC: immunohistochemistry.

新生淋巴管中可見癌栓，佐證腫瘤細(xì)胞通過新生淋巴管而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。本研究中給藥組腫瘤細(xì)胞對新生淋巴管的侵犯和對照組相比，雖然未見統(tǒng)計學(xué)差異，但對照藥組有3例出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞侵犯新生淋巴管，而給藥組僅見1例，提示EGFR-TKI對腫瘤侵犯新生淋巴管亦有一定抑制趨勢，值得進(jìn)一步關(guān)注。

國際肺癌分期（International Association for the Study of Lung Cancer, IASLC）（第七版）肺癌分期重點指出病灶直徑在預(yù)后中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)給藥組相對腫瘤體積和瘤重均小于對照組，提示EGFR-TKI在小鼠移植瘤模型中能有效控制腫瘤的生長。同時，給藥組新生淋巴管最大管徑和面積均明顯小于對照組，提示靶向藥物可影響新生淋巴管的形態(tài)，其臨床意義值得深究。非荷瘤狀態(tài)的淋巴系統(tǒng)內(nèi)，大部分毛細(xì)淋巴管處于靜息塌陷狀，僅有部分毛細(xì)淋巴管處于功能狀態(tài)[12]。隨著腫瘤的不斷生長，瘤內(nèi)局部滲透壓升高，引起淋巴引流相對不足[13]。為了完成組織間液回流，首先使原來處于靜息儲備狀態(tài)的毛細(xì)淋巴管大量擴張開放，并進(jìn)一步促進(jìn)新生毛細(xì)淋巴管的形成，以適應(yīng)其對組織液運輸能力的需要。同時，由于回流量大，淋巴管內(nèi)壓增加，使毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的連接由復(fù)雜型向簡單型轉(zhuǎn)變，從而有利于毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮通道的形成和對組織間物質(zhì)的吸收引流[14]。這也為癌細(xì)胞進(jìn)入新生淋巴管提供了直接進(jìn)入的機會[15]。隨著腫瘤的增大，浸潤程度加重，癌內(nèi)組織水腫明顯，導(dǎo)致了瘤內(nèi)新生淋巴管的管徑增大、面積擴大，同時新生淋巴管密度增加，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了有利的通道，增加了腫瘤在發(fā)展過程中淋巴道轉(zhuǎn)移的機會[14]。有文獻(xiàn)[16]報道，腫瘤生長可促進(jìn)瘤內(nèi)淋巴管的增生和增粗。EGFR-TKI縮減新生淋巴管管徑和面積的作用對減少肺癌淋巴轉(zhuǎn)移的積極意義顯而易見。

EGFR-TKI阿法替尼在抑制EGFR突變小鼠肺癌移植瘤瘤體生長的同時，抑制瘤體內(nèi)新生淋巴管生成、縮減新生淋巴管管徑和面積，并有抑制腫瘤侵犯淋巴管的趨勢。本研究探索了EGFR-TKI對肺癌新生淋巴管的相關(guān)影響，這是EGFR-TKI對肺癌治療效應(yīng)的嶄新視角或另一重要線索，值得進(jìn)一步深入研究。