RGD分子影像在肺癌的研究現(xiàn)狀與進展

岳寧 袁雙虎 楊國仁

2013年中國腫瘤年報[1]顯示，惡性腫瘤發(fā)病率第一位的是肺癌。而且肺癌的發(fā)病率和死亡率將繼續(xù)快速攀升，每年死于肺癌的患者比乳腺、結腸、前列腺、胰腺癌的總和都要多。肺癌中80%是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），術后總的5年生存率僅為20%-40%[2]。現(xiàn)階段對于它的治療，已經(jīng)形成了一系列多學科綜合治療方案。近年發(fā)展的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）示蹤劑通過與腫瘤新生血管高表達的αvβ3整合素特異性結合，可以實現(xiàn)無創(chuàng)、立體、動態(tài)的血管生成顯像，從而在血管生成方面顯示肺癌的生物學特性。本文就RGD分子影像的肺癌研究進展進行綜述。

1 肺癌與血管生成

血管新生是指毛細血管從已存在的血管周圍生成的過程，包括細胞、可溶性因子和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）物質(zhì)間的廣泛作用。1971年，F(xiàn)olkman提出“腫瘤的生長、侵襲和轉移都依賴于腫瘤血管生成”的觀點。不斷擴張的新生血管網(wǎng)為腫瘤細胞提供生存所必需的營養(yǎng)并清除其代謝產(chǎn)物，如果血管生成受阻，沒有足夠血供，腫瘤的生長將不會超過3 mm。因此，腫瘤被認為是一種血管生成依賴性疾病。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，持續(xù)無規(guī)則的新血管生成加速了疾病發(fā)展。

腫瘤區(qū)血管密度可達正常組織血管密度的50倍-200倍，且在結構、功能以及分子水平上與正常血管存在明顯差異[3]，臨床上高密度血管生成的腫瘤患者預后一般較差。肺癌是典型的血管依賴性病變，與其他實體腫瘤一樣，血管的生成與肺癌的發(fā)生、生長及轉移密切相關。目前已分離和純化了20多種血管生成因子，其中血管內(nèi)皮生長因子/受體（vascular endothelial growth factor/VEGF receptors, VEGF/VEGFRs）及其他相關的生物信號分子、蛋白質(zhì)（如αvβ3、Endoglin-CD105等）在肺癌血管生成中具有重要的、乃至中樞核心的調(diào)節(jié)作用，已經(jīng)成為肺癌診斷與治療的重要靶點[4]。

2 整合素αvβ3與RGD肽

整合素為細胞黏附分子家族的重要成員之一，是一組廣泛存在的跨膜糖蛋白，此異二聚體由一個α鏈和一個β鏈以非共價鍵結合而成。迄今為止已發(fā)現(xiàn)20種不同的α鏈（120 kDa-185 kDa）和11種不同的β鏈（90 kDa-110 kDa），至少組成20余種不同的整合素亞型。其中，αvβ3、αvβ5、αvβ1與 RGD序列的關系最密切。

20世紀80年代初期，人們從ECM中分離出大量的糖蛋白。大多數(shù)ECM糖蛋白在細胞粘附中起著重要作用，因此，稱為粘附蛋白。不少粘附蛋白分子中含有RGD三肽序列。自從1984年Pierschbacher和 Ruosluherci首次報道纖維蛋白原中所含的RGD三肽序列為細胞識別位點以來，RGD肽及其衍生物就成為各國學者關注與研究的熱點之一。RGD短肽廣泛存在于生物體內(nèi)，具有分子量小、受分散有關的剪切力和有機溶劑影響較小的優(yōu)勢，是整合素與其配體蛋白相互作用的識別位點，介導細胞與胞外基質(zhì)及細胞間的粘附作用，同時具有信號傳導功能，從而介導許多重要的生命活動。

整合素在正常血管內(nèi)皮和上皮細胞很少表達，但在肺癌、骨肉瘤、成神經(jīng)細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細胞瘤及浸潤性黑色素瘤等多種實體腫瘤細胞表面有高水平的表達，而且在所有腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細胞膜有高表達[5]，提示整合素αvβ3在腫瘤生長、侵襲和轉移過程中起著關鍵作用。與正常組織相比，腫瘤細胞或腫瘤微環(huán)境中高表達的受體，為放射性標記的受體特異性肽非侵入性地發(fā)現(xiàn)腫瘤提供了分子基礎。因此，放射性標記的整合素αvβ3特異性靶向RGD肽，對肺癌進行核醫(yī)學顯像，對其早期發(fā)現(xiàn)和非侵入性地監(jiān)測肺癌血管生成的狀態(tài)有很大的潛力，能夠達到早期診斷和治療目的。

在多種針對血管為靶點的腫瘤治療中，整合素αvβ3受到廣泛的關注。測定腫瘤組織中整合素αvβ3受體的表達水平，有助于評價腫瘤的生長狀況和侵襲性。研究表明，腫瘤細胞αvβ3的表達與惡性腫瘤的浸潤轉移能力等惡性表型有關[6]，整合素αvβ3的表達水平可以作為判斷一些惡性腫瘤的預后指標[7]。

3 RGD血管生成分子影像

對腫瘤血管生成狀態(tài)的有效評估能夠反映組織微環(huán)境狀況及生物學形態(tài)，評價腫瘤組織對治療的反應。以往認為微血管密度（microvessel density, MVD）計數(shù)是評價腫瘤內(nèi)血管生成情況的“金標準”，它是腫瘤標本免疫組化染色后測定的新生血管內(nèi)皮細胞數(shù)目。但其屬于創(chuàng)傷性檢查，并且受到取材部位的影響，不能反映活體血管情況及抑制腫瘤血管生成的療效[8]，加上其測定方法復雜，使得MVD計數(shù)在臨床應用中有較大局限性。

近年來快速發(fā)展的分子影像學成像方式在很大程度上克服了這些缺點，它將傳統(tǒng)顯像技術和新的分子顯像探針結合，可監(jiān)測不同階段腫瘤發(fā)展，是一種能在活體快速、實時、無創(chuàng)、準確反映腫瘤全貌的影像學方法。腫瘤血管生成的顯像以及抗腫瘤血管生成治療效果的評價為其研究的重點，同時，既往的相關研究[9]也從一定程度上證實了肺癌的RGD血管生成顯像與免疫組化染色及放射自顯影有著良好的相關性。

利用放射性核素標記的RGD多肽作為整合素αvβ3的分子探針，是近些年來核醫(yī)學研究的熱點，已應用于腫瘤顯像與治療研究。放射性核素標記的RGD示蹤劑與腫瘤新生血管高表達的αvβ3整合素的靶向顯像，是目前應用前景最好的腫瘤血管生成分子影像學方法。

4 RGD分子影像在肺癌中的應用

目前為止，用不同的放射性核素對RGD肽進行標記的方法已經(jīng)基本成熟，在正常動物體內(nèi)驗證了其良好的生物學分布和腫瘤靶向特性[10,11]。此外，多種放射性核素標記的RGD肽已被證實為應用前景良好的αvβ3受體顯像劑，如64Cu、18F、99mTc、125I、188Re、111In和90Y等，已經(jīng)在多種荷瘤動物模型上獲得成功[12-15]。在臨床方面，18F-Galacto-RGD已成為第一個進入臨床試驗的非侵入的整合素αvβ3靶向腫瘤顯像劑，成功地應用于腫瘤患者的PET診斷，在膠質(zhì)母細胞瘤的臨床試驗[16]中表現(xiàn)出好的生物學分布及特異性靶點識別。

4.1 RGD分子影像在肺癌的實驗研究 在過去的幾十年中，一系列基于肽的成像劑，已經(jīng)被開發(fā)和研究關于各種腫瘤的靶向受體成像，包括肺癌[17,18]。隨著分子影像學技術的發(fā)展，18F-脫氧葡萄糖（fluorodeoxyglucose, FDG）PET/CT已經(jīng)證明是NSCLC診斷、分期和指導治療的準確和必要的方法[19,20]。其能準確反映體內(nèi)器官和組織對葡萄糖的代謝水平，應用較為廣泛。但一些局部或全身感染性病灶、非特異性炎性組織以及一些良性腫瘤可以不同程度的攝取18F-FDG，易出現(xiàn)假陽性結果，對腫瘤診斷缺乏明顯的特異性和高選擇性[21]。而RGD整合素受體顯像具有組織特異性好、親和力和選擇性高、血液清除快、T/NT值高、圖像質(zhì)量好等優(yōu)點，并且能準確、動態(tài)、實時地反映腫瘤血管生成的變化，是具有高靈敏性與高特異性的腫瘤顯像劑。

有文獻[22,23]表明，通過99mTc-RGD-4CK在健康動物體內(nèi)的藥代動力學、生物分布特點及顯像表現(xiàn)，證明其體內(nèi)穩(wěn)定性高，具有良好的放射化學性質(zhì)及比較理想的體內(nèi)動力學。且其非靶組織本底低，圖像質(zhì)量好，是非常有前景的肺部腫瘤陽性顯像劑。99mTc-RGD-4CK組小鼠的顯像和生物分布T/NT值明顯高于18F-FDG組，表明99mTc-RGD-4CK對NCI-H358人NSCLC的顯像敏感性高于18F-FDG，在診斷低代謝的NSCLC時，99mTc-RGD-4CK可能比18F-FDG更具優(yōu)勢。并且在NCI-H358異種移植裸鼠提供的證據(jù)[24]表明，99mTc-RGD-4CK主要經(jīng)腎臟快速排泄，是一種很有前途的顯像劑，可以無創(chuàng)測定細支氣管肺泡癌中αvβ3整合狀態(tài)和療效監(jiān)測。

檢測癌癥的雙受體靶向分子顯像劑的開發(fā)和應用一直在得到越來越多的關注[25]。其中，99mTc-HYNIC（tricine）（TPPTS）-RGD-BBN（99mTc-RGD-BBN）的生物分布、平面γ成像和小動物SPECT/CT研究被用于Lewis肺癌（LLC）C57/BL6小鼠。研究結果[26]表明，99mTc-RGD-BBN在區(qū)分肺癌和炎癥方面優(yōu)于18F-FDG。99mTc-RGD-BBN的小動物SPECT/CT可明確檢測肺轉移，99mTc-RGD-BBN的SPECT/CT將為無創(chuàng)發(fā)現(xiàn)肺癌提供一個有效的方法。

研究[27]對18F-FB-RGD、18F-FDG在Lewis肺癌小鼠模型進行對比實驗研究，在18F-FB-RGD 的生物分布研究中，18F-FB-RGD在腫瘤部位相當高的放射性攝取，血液清除速率很快，腫瘤對血、肌肉及肺的T/NT 比值均大于2.0，對原發(fā)腫瘤和對側肺轉移瘤都有清晰顯像；而18F-FDG則由于心臟高攝取及肺部的高本底而無法區(qū)分腫瘤與縱隔，特異性不強，而且未發(fā)現(xiàn)轉移瘤，靈敏度較18F-FB-RGD差。結果表明，18F-FB-RGD是一種對肺癌具有良好特異性及敏感性的腫瘤受體顯影示蹤劑，有望在肺癌診斷、分期、療效監(jiān)測方面發(fā)揮作用。

研究[28]表明，通過應用64Cu-DOTA-PEG-E[ C（RGDyK）]2在肺癌小鼠模型成像，證明64Cu-DOTAPEGE[C（RGDyK）]2是一個對整合素αvβ3陽性腫瘤顯像很好的正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography,PET）示蹤劑。其主要經(jīng)過腎臟從血液中快速清除，在正常肺組織和心臟最小程度的非特異性活性的積累，呈現(xiàn)高品質(zhì)的原位肺癌圖像。RGD PET顯像肺癌原發(fā)灶邊界的效果與FDG PET類似，顯像縱隔淋巴結轉移和對側肺轉移灶的效果更好。

Decristoforo等[29]報道用99mTc標記HYNIC與c（RGDyK）組成的共軛物99mTc-EDDA/HYNIC-RGD，正常小鼠和荷非小細胞肺腫瘤、荷人黑色素瘤裸鼠對其生物分布進行評價。實驗證明其在體內(nèi)外均有較好的水溶性、穩(wěn)定性、較為理想的藥代動力學及特異性蛋白結合特性，是一個很有發(fā)展前景的αvβ3受體顯像劑。腫瘤攝取的研究表明，與[18F]Galacto-RGD相比，對αvβ3受體陽性的腫瘤其具有特異靶向性及較好的腫瘤-器官比率。

胡四龍等[30]探討99mTc標記RGD小分子多肽GY11作為腫瘤顯像劑的可能性，并建立肺癌H460、荷人黑色素瘤A375和宮頸癌Hela BALB/a裸鼠腫瘤模型，分別進行體內(nèi)分布和腫瘤顯像研究。結果表明99mTc-GY11主要經(jīng)過腎臟從血液清除，除宮頸癌Hela腫瘤顯像不明顯外，給藥2 h后肺癌細胞H460和黑色素瘤細胞A375腫瘤均能清除顯像，24 h后顯像更清晰。實驗表明其有望成為腫瘤αvβ3受體顯像劑。

Jung等[31]用99mTc標記糖化的RGD肽[99mTc-D-c（RGDfK）]，在Lewis肺癌、荷纖維肉瘤小鼠進行體內(nèi)分布和顯像研究，并在個別Lewis肺癌小鼠進行紫杉醇抗血管生成治療。99mTc-D-c（RGDfK）在血液中迅速清除，腫瘤呈高度攝取，顯像過程中腫瘤清晰可見。經(jīng)紫杉醇治療的小鼠表現(xiàn)出對腫瘤生長速度減慢的劑量依賴性，這一現(xiàn)象可以用與整合素表達水平明顯相關的腫瘤部位對99mTc-D-c（RGDfK）的攝取降低來解釋。實驗結果表明，99mTc-D-c（RGDfK）在體內(nèi)具有良好的生物動力學及腫瘤靶向特性，并且可能在腫瘤整合素表達的非侵入評價及抗血管生成治療的反應上起到一定作用。

4.2 RGD分子影像在肺癌的臨床研究 Chin等[10]在健康人的實驗報告，[18F]FPP（RGD）2主要通過腎臟和膀胱排出體外，在腸、甲狀腺和腦室中可見少量放射性攝取，而在頭、頸、胸部和四肢未見明顯的放射性攝取，且在肺臟的本底非常低，因此，有望成功檢測肺部腫瘤生長和轉移變化。臨床試驗表明，RGD PET安全耐受，且無毒副作用發(fā)生。

為了進一步評價18F-FPPRGD2示蹤劑的安全性，生物分布和劑量學特性，Mittra等[32]在5位健康志愿者進行PET顯像，在研究過程中無不良事件發(fā)生，其有理想的藥代動力學和生物分布屬性，平均有效劑量為（0.146,2±0.066,9）rem/mCi。結論表明，18F-FPPRGD2示蹤劑有多種應用潛力，主要作用是有望對腫瘤進行PET顯像評估，由于其生物分布在頭、頸和胸部的低背景攝取，對這些部位的惡性腫瘤（如腦癌、乳腺癌或肺癌等）評估是最優(yōu)化的。18F-FPPRGD2掃描還可用于識別抗血管生成藥物治療的惡性腫瘤，有望更精確地在早期評估治療反應。最終，涉及癌癥患者的進一步的臨床研究仍是必需的，以確定其特異性及可達到的腫瘤-背景比。作者下一步的計劃是監(jiān)測該示蹤劑在腦癌、肺癌、乳腺癌患者腫瘤分期的有效性及抗血管生成治療的反應。最近被批準用于臨床研究，然而，費時多步合成限制了其臨床廣泛應用。

在另一項研究[33]中，開發(fā)了一種簡單的凍干試劑盒用于標記PRGD2肽（18F-ALF-NOTA-PRGD2，記為18F-alfatide），并對9例肺癌患者進行18F-alfatide靜態(tài)和動態(tài)PET顯像。結論表明，具有良好的放射化學產(chǎn)率和純度的18F-alfatide可以通過一個簡單的凍干試劑盒一步生產(chǎn)，18F-alfatide PET允許肺癌的具有良好對比度的αvβ3成像。但是仍需要更多18F-alfatide的臨床試驗研究，來進一步證明未來結合化療或放療的抗血管生成療法的可行性。

NC100692是包含單體RGD三肽序列的環(huán)狀肽，Axelsson等[34]為了驗證其99mTc標記物99mTc-NC100692檢測肺癌轉移灶的可能性，并評估其安全性，在15例肺癌患者進行全身骨顯像及SPECT/CT顯像。結果表明，99mTc-NC100692在檢測肺癌患者的肺、腦等軟組織轉移灶是可行的，而肝和骨病灶的檢出率較差。同時證明使用99mTc-NC100692是安全的，其耐受性良好。

一項旨在探討99mTc-3PRGD2對肺癌患者診斷、評估效能的多中心研究[35]表明，在70例肺部良惡性病變的患者進行全身平面掃描和胸部SPECT/CT，99mTc-3PRGD2的成像在1 h對肺癌檢測敏感，大多數(shù)惡性腫瘤表現(xiàn)突出的T/B比率，半定量分析的敏感性為88%，然而特異性只有58%-67%?？梢暬治隹奢o助半定量評估，全身平面掃描和胸部SPECT/CT對原發(fā)腫瘤和轉移灶的評估是互補的。這項研究的初步結果表明，99mTc-3PRGD2作為整合αvβ3受體顯像的一種新型示蹤劑，值得進一步臨床研究。

總之，RGD血管生成顯像是目前較為理想的血管成像個體化評價方法，融合2種或2種以上成像方式，尋求多模式、多技術的成像方式，從結構、功能和分子水平來更好的評價治療前后腫瘤血管的狀況，將是腫瘤血管生成成像發(fā)展的重要趨勢[36]。

5 小結

放射性核素標記的RGD分子探針，作為特異的靶向受體顯像劑，可實現(xiàn)無創(chuàng)、立體、動態(tài)的血管生成實時顯像，已用于多種腫瘤的研究。動物試驗研究和臨床研究初步證明其顯示αvβ3受體陽性腫瘤的可能性，但是尚需更為深入的臨床前與臨床研究。理論上，RGD分子影像可在肺癌診斷、靶向治療及放射治療中發(fā)揮作用，可用于即時或超早期評估療效、預測預后，特別是在肺癌個體化治療方面具有廣闊的臨床應用前景。