紫山藥組織培養(yǎng)快繁技術(shù)優(yōu)化

韓曉勇，王立，殷劍美，張培通，郭文琦，李春宏

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所，江蘇 南京 210014)

紫山藥(Dioscoreaalata)是山藥(Dioscoreaopposita)中珍貴的精品，因其肉質(zhì)、表皮紅中帶紫而得名，富含黏液質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)、淀粉和礦物質(zhì)元素，特別是花色苷含量比較高?；ㄉ帐瞧駷橹顾l(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑，具有抗氧化衰老、抗突變、抗癌與抗動(dòng)脈硬化等功能，作為保健食品或輔助治療藥物具有巨大潛力和應(yīng)用前景[1]。紫山藥主要通過塊莖繁殖，塊莖繁殖用種量大，生產(chǎn)成本較高，易受季節(jié)限制，且長期利用塊莖繁殖易造成種性退化，抗病性和抗逆性減退[2]。紫山藥組培再生體系技術(shù)研究不僅有利于品種的更新復(fù)壯，獲得基因型、長相一致的優(yōu)良種苗，還可為其種苗工廠化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

韓曉勇等[3-4]以臺州市紫山藥帶腋芽的莖段為外植體，建立了臺州紫山藥組織培養(yǎng)快繁體系，并研究了培養(yǎng)基用量、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度配比、蔗糖濃度，及光照強(qiáng)度對紫山藥試管薯形成和生長發(fā)育影響。王碧琴等[5-7]以紫山藥的莖尖、莖段為材料，對莖尖、莖段誘導(dǎo)分化不定芽進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加抗褐化劑活性炭(AC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，莖尖比莖段的培養(yǎng)效果好，能明顯降低培養(yǎng)基褐化速度，延長培養(yǎng)物培養(yǎng)時(shí)間；芽苗在白光源培養(yǎng)下的增殖系數(shù)是LED紅光的2.3倍，藍(lán)光和紫紅混光的1.6倍，生長速率是紅光和紫紅光的1.8倍，鮮質(zhì)量是藍(lán)光和紫紅光的1.5倍，表明白光是紫山藥試管芽苗培養(yǎng)較為理想的光質(zhì)。蔡月琴等[8]以紫山藥無菌苗為試材，研究了植物生長調(diào)節(jié)劑種類、材料類型、光暗條件等對愈傷組織誘導(dǎo)及其分化的影響。這些研究為紫山藥組培苗的培養(yǎng)奠定了一定基礎(chǔ)，但關(guān)于紫山藥莖段取樣部位、取樣時(shí)間、不同世代的繁殖系數(shù)和試管薯形成尚未見報(bào)道。筆者在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化紫山藥組織培養(yǎng)技術(shù)，為紫山藥良種繁育、種質(zhì)交換和種質(zhì)資源保存等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院紫山藥品種蘇蕷1號為材料。紫山藥種植于小高壟上，出苗后備用。

1.2 處理設(shè)計(jì)

1.2.1 紫山藥不同部位的腋芽分化力

取長勢一致的紫山藥莖，去掉葉片和莖尖1～2節(jié)腋芽，將莖段從上到下依次取3節(jié)，作上、中、下部3個(gè)處理，用剪刀截成1.5～2.0 cm帶腋芽的莖段。滅菌后接種在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中，接種7 d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理污染數(shù)、死亡數(shù)，計(jì)算污染率和死亡率；接種25 d后，比較各處理腋芽分化數(shù)，計(jì)算分化率。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)35個(gè)莖段。

1.2.2 紫山藥不同生長期的腋芽分化力

紫山藥出苗后，分別在07-29、08-12、08-28、09-11和09-26，取帶腋芽的莖段，滅菌后接種在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基中，去除污染莖段。接種25 d后，比較各處理腋芽分化數(shù)、總芽數(shù)和芽高，計(jì)算分化率和平均芽數(shù)。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)35個(gè)莖段。

1.2.3 紫山藥不同接種世代的組培增殖系數(shù)

將帶腋芽的莖段接種在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 d，將高2.0 cm左右葉片切下，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+0.02%活性炭培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)3代，培養(yǎng)45 d。統(tǒng)計(jì)每1代的株高、成形葉數(shù)、不成形葉數(shù)(2 cm以下)和根數(shù)，計(jì)算有效增殖系數(shù)。每個(gè)接種世代設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)10株組培苗。理論上每片葉均帶1個(gè)節(jié)，計(jì)理論增殖系數(shù)為1，實(shí)際上不成形葉并不能用作繼代，即有效增殖系數(shù)=成形葉數(shù)/(成形葉數(shù)+不成形葉數(shù))。

1.2.4 不同接種世代對試管薯形成的影響

T1、T2和T3代的組培苗分別培養(yǎng)90 d后，每個(gè)世代隨機(jī)選取10株，調(diào)查結(jié)薯數(shù)、試管薯鮮質(zhì)量、干質(zhì)量，3次重復(fù)。每個(gè)世代隨機(jī)選取5個(gè)種薯，量取長度和周長，3次重復(fù)。

1.2.5 培養(yǎng)基滅菌及培養(yǎng)條件

高壓滅菌前用1 mol·L-1的KOH調(diào)整培養(yǎng)基pH值為5.8，保持121 ℃滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，光照強(qiáng)度2 000～2 500 lx，光照周期12 h·d-1。培養(yǎng)基中瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7 g·L-1，蔗糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 g·L-1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003和STAT統(tǒng)計(jì)軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位對紫山藥腋芽分化力的影響

在上、中和下部莖段芽數(shù)差異不顯著的情況下，紫山藥植株不同取樣部位的腋芽分化力不同。其中，中部莖段發(fā)芽數(shù)最多，為19.3個(gè)；下部的發(fā)芽率最高，為76.7%；上部莖段發(fā)芽數(shù)和發(fā)芽率最低，分別為13.3和51.7%。上、中和下部莖段的污染數(shù)和污染率無顯著差異，但上部莖段死亡數(shù)和死亡率顯著高于中、下部。

表1 不同部位對紫山藥腋芽分化力的影響

注：同列無相同小寫字母表示組間差異達(dá)0.05水平。

2.2 不同生長期對紫山藥腋芽分化力的影響

從表2可以看出，紫山藥不同生長期，腋芽分化力不同。其中，8月28日取樣的莖段，發(fā)芽數(shù)、總芽數(shù)和發(fā)芽率顯著高于其他取樣時(shí)間，分別為22.3、39.3和88.1%。隨著山藥生長期的推進(jìn)，莖段腋芽分化率呈先升后降的趨勢。7月29日取樣的莖段發(fā)芽數(shù)、總芽數(shù)、發(fā)芽率和平均芽數(shù)均最低，分別為9.7、10.3、37.6%和1.1。不同生長期取樣的莖段芽高差異不大，8月12日取樣的莖段芽高最低，為1.4 cm，顯著低于其他時(shí)期。

表2 不同生長期對紫山藥腋芽分化力的影響

2.3 不同接種世代對紫山藥組培增殖系數(shù)的影響

從表3可以看出，接種T2代組培苗株高、有效增殖系數(shù)顯著高于T1和T3代，分別為5.5 cm和9.5。T1代成形葉數(shù)最多，為10.2，但不成形葉數(shù)也最多，從而影響有效增殖系數(shù)。T3代成形葉數(shù)等于有效增殖系數(shù)，為4.9。T2代之后，隨著接種世代的增加，組培苗株高、成形葉數(shù)、不成形葉數(shù)、根數(shù)和有效增殖系數(shù)均呈下降趨勢。

表3 不同接種世代對紫山藥組培增殖系數(shù)的影響

2.4 不同接種世代對試管薯形成的影響

從表4可以看出，接種T3代試管薯鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、薯長和周長顯著高于T1和T2代，單株結(jié)薯數(shù)顯著高于T1代。T1和T2代試管薯產(chǎn)量構(gòu)成無顯著差異。

表4 不同接種世代對試管薯產(chǎn)量構(gòu)成的影響

3 小結(jié)

紫山藥植株不同取樣部位的腋芽分化力不同。中下部莖段發(fā)芽數(shù)和發(fā)芽率顯著高于上部莖段，因此，紫山藥組培宜取植株中下部莖段，尤其是中部莖段。通常認(rèn)為，上部莖段較嫩，細(xì)胞分裂旺盛，易分化不定芽[9-10]；但相同滅菌時(shí)間不僅會(huì)顯著增加上部莖段死亡數(shù)和死亡率，而且易對莖段造成傷害，從而影響發(fā)芽率。紫山藥不同生長發(fā)育期，腋芽分化力不同。其中，8月28日取樣的莖段，發(fā)芽數(shù)、總芽數(shù)和發(fā)芽率顯著高于其他取樣時(shí)間，這可能是由于8月28日處于藤蔓快速生長期、腋芽分化力強(qiáng)所致。隨著紫山藥生長期的推進(jìn)，莖段腋芽分化率呈先升后降的趨勢，這與植株地上部分生長趨勢基本一致。

不同接種世代，紫山藥組培增殖系數(shù)不同，接種T1和T2代組培苗株高、有效增殖系數(shù)顯著高于T3代。隨著接種世代的增加，組培苗株高、成形葉數(shù)、根數(shù)和有效增殖系數(shù)均呈下降趨勢。可能是繼代培養(yǎng)過程中組培苗內(nèi)源生長素水平提高，直接抑制了苗的分化，也可能是多次繼代后細(xì)胞自身退化，導(dǎo)致分化能力下降。此外，在培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的核型可能發(fā)生變異，染色體出現(xiàn)高度的非整倍性，也會(huì)使細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生能力下降甚至喪失[11]。接種T3代試管薯鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、種薯長和周長顯著高于T1和T2代，這可能是由于T1和T2代組培苗株高、成形葉數(shù)和不成形葉數(shù)顯著高于T3，造成試管苗營養(yǎng)生長旺盛，影響營養(yǎng)物質(zhì)向塊莖分配和累積，進(jìn)而減少試管薯的質(zhì)量。