煙草株高和葉數(shù)性狀QTL定位及候選基因預(yù)測(cè)

姜自鵬　趙會(huì)納　苑廣迪　蔣彩虹　劉旦　余世洲 雷波　程立銳　楊愛國(guó)　付憲奎

摘??要：為明確煙草株高和葉數(shù)性狀的遺傳規(guī)律，發(fā)掘控制相關(guān)性狀的主效位點(diǎn)，以臺(tái)煙8號(hào)（TT8）為母本（P1），NC82為父本（P2），配置雜交組合，以TT8為輪回親本回交，構(gòu)建了包含200個(gè)單株的BC1F1群體。在此基礎(chǔ)上，分別在四川、山東兩個(gè)環(huán)境點(diǎn)種植群體材料，獲得株高和葉數(shù)表型，進(jìn)而利用高密度遺傳圖譜對(duì)株高和葉數(shù)性狀進(jìn)行QTL定位分析。結(jié)果表明，在兩個(gè)環(huán)境條件下共定位到4個(gè)與株高和葉數(shù)相關(guān)的主效QTL，每個(gè)QTL均可以解釋相應(yīng)性狀10%～20%的表型變異。兩個(gè)環(huán)境點(diǎn)定位到2個(gè)葉數(shù)性狀QTL，均位于23號(hào)連鎖群上，非等位;定位到3個(gè)株高性狀主效QTL，四川點(diǎn)1個(gè)位于23號(hào)連鎖群上，山東點(diǎn)2個(gè)分別位于21號(hào)和23號(hào)連鎖群上，其中山東點(diǎn)23號(hào)連鎖群上的主效位點(diǎn)與控制葉數(shù)的主效QTL遺傳位置一致。相關(guān)結(jié)果為進(jìn)一步克隆控制株高和葉數(shù)性狀的主效基因及煙草重要農(nóng)藝性狀分子改良奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：株高;葉數(shù);遺傳圖譜;QTL定位;候選基因預(yù)測(cè)

QTL Mapping and Prediction?of Candidate Genes for Plant Height and Leaf Number in Tobacco

JIANG Zipeng ?ZHAO Huina YUAN Guangdi JIANG Caihong ?LIU Dan YU Shizhou

LEI Bo CHENG Lirui YANG Aiguo ?FU Xiankui

Abstract：In order to clarify the genetic rules of plant height and leaf number traits of tobacco and explore the main effective loci controlling related traits，?a BC1F1 population containing 200 individual plants was constructed by using Taiyan 8 （TT8） as?the?female parent （P1） and NC82 as?the?male parent （P2）， and backcrossing TT8 as recurrent parent.?The?plant height and leaf number phenotypes were obtained by planting population materials in Sichuan and Shandong respectively.?And then QTL mapping for plant height and leaf number traits was performed?based on the high-density genetic map.?The results showed that four major QTLs related to plant height and leaf number were located under two environmental conditions， which could explain 10%-20% of the phenotypic variation of the corresponding trait.?At?two environmental sites， two QTLs for leaf number traits were mapped， which were non-allelic and located on?the 23 linkage group; three major QTLs for plant height traits were identified， including one in Sichuan was located on the 23 linkage group and two in Shandong were located on the 21 and 23 linkage groups?respectively.?The major loci of plant height located on the 23 linkage group in Shandong is consistent with that of the major QTL of leaf number.?The related studies laid a foundation for further cloning the major genes controlling plant height and leaf number traits and molecular improvement of important agronomic traits in tobacco.

Keywords： plant height; leaf number; genetic map; QTL mapping; prediction of candidate genes

株高和葉數(shù)是煙草重要的農(nóng)藝性狀，與煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)有緊密的聯(lián)系^[1-3]。因此，要提高煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，就必須對(duì)其相關(guān)性狀進(jìn)行改良。煙草基本農(nóng)藝性狀、抗性和品質(zhì)等重要性狀大多都屬于復(fù)雜數(shù)量性狀^[4-5]，受多基因控制，易受環(huán)境影響。煙草是一個(gè)典型的大植物基因組^[6]，基因組大小有4.5 Gb，其中重復(fù)序列含量達(dá)到基因組序列的60%～80%，不同種質(zhì)間遺傳差異較小，這極大限制了煙草數(shù)量性狀遺傳研究。

目前，關(guān)于煙草株高和葉數(shù)性狀QTL定位分析雖有報(bào)道，但大多是基于低質(zhì)量的煙草遺傳圖譜進(jìn)行的，這可能導(dǎo)致獲得的QTL數(shù)量較少、準(zhǔn)確度和精細(xì)度低，影響煙草株高和葉數(shù)性狀的分子改良。蔡長(zhǎng)春等^[7]利用僅含23個(gè)連鎖群的不完整的遺傳連鎖圖譜檢測(cè)到1個(gè)與葉數(shù)相關(guān)的QTL。李茜^[8]利用SSR和SRAP標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，檢測(cè)到2個(gè)與葉數(shù)相關(guān)的QTL均位于16和17號(hào)連鎖群上，3個(gè)與株高相關(guān)的QTL分別位于2、17和19

號(hào)連鎖群。童治軍等^[9]基于SSR標(biāo)記的遺傳圖譜定位到了13個(gè)與株高相關(guān)的QTL、10個(gè)與葉片數(shù)相關(guān)的QTL，但大部分效應(yīng)值較小，難以在生產(chǎn)中得到有效利用;之后又利用重組自交系群體構(gòu)建了一張包含626個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜，發(fā)現(xiàn)了5個(gè)與葉片數(shù)相關(guān)QTL，分別分布于第3、4、7、17、和22號(hào)連鎖群上，6個(gè)與株高相關(guān)的QTL分別分布于3、7、13、14、17、和24號(hào)連鎖群上，均具有較高的效應(yīng)值，為培育高產(chǎn)煙草新品種提供了理論依據(jù)^[10]。

基于限制性酶切位點(diǎn)DNA測(cè)序（Restriction-site associated DNA sequencing，RAD-seq）是在第二代測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的一項(xiàng)基于全基因組酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)^[11]。RAD-seq測(cè)序技術(shù)具有標(biāo)記數(shù)量高，準(zhǔn)確性高、數(shù)據(jù)利用率高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于高密度遺傳圖譜的構(gòu)建、高密度單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記開發(fā)，植物重要性狀的QTL定位等研究^[12-13]，解決了利用傳統(tǒng)的分子標(biāo)記很難覆蓋全基因組的問題。

本研究組前期以RAD-seq技術(shù)構(gòu)建了高密度遺傳圖譜^[14]，在此基礎(chǔ)上，本文以TT8為母本，NC82為父本，配置雜交組合F1，F(xiàn)1回交于TT8，得到由200個(gè)子代組成的BC1F1群體，對(duì)與煙草產(chǎn)量和品質(zhì)相關(guān)的株高和葉數(shù)兩個(gè)重要性狀進(jìn)行QTL定位分析，并對(duì)候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，以期為今后進(jìn)一步研究株高和葉數(shù)性狀分子育種及開展煙草重要農(nóng)藝性狀分子改良提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1??供試材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)以TT8為母本（P1），以NC82為父本（P2）。其中NC82是美國(guó)烤煙類型品種，TT8為我國(guó)培育的烤煙品種，兩品種在株高和葉數(shù)農(nóng)藝性狀中表現(xiàn)有顯著差異。兩者均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。

2016年3—9月，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所青島試驗(yàn)基地利用TT8與NC82雜交獲得F1種子;2017年3—9月，在青島試驗(yàn)基地利用F1回交TT8獲得BC1F1群體種子。2018年分別在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所諸城試驗(yàn)基地和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所西南試驗(yàn)基地種植200個(gè)BC1F1群體。為了獲得穩(wěn)定、可靠的數(shù)據(jù)，將每個(gè)BC1F1單株利用組織快繁50株，用于田間種植。田間種植設(shè)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)材料每重復(fù)種植10株，株距50?cm，行距120?cm，按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)措施進(jìn)行栽培管理。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)調(diào)查5個(gè)單株，取平均值。

1.2 ?表型調(diào)查

煙草株高和葉數(shù)的測(cè)定按照YC/T142—2010《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法》要求進(jìn)行。

1.3 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2019軟件，對(duì)200個(gè)BC1F1材料的株高和葉數(shù)性狀進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)性分析。

1.4??QTL定位分析

利用本研究組前期以母本TT8、父本NC82、F1以及200個(gè)BC1F1群體構(gòu)建的煙草遺傳圖譜^[14]，結(jié)合株高和葉數(shù)的田間表型數(shù)據(jù)，利用QTL IciMapping 4.2軟件，利用ICIM-ADD作圖方法對(duì)煙草株高和葉數(shù)性狀進(jìn)行QTL定位，設(shè)置閾值為2.5，若在SNP標(biāo)記中檢測(cè)到LOD大于或等于2.5，則認(rèn)為該處存在QTL。按照MCCOUCH^[15]等規(guī)則進(jìn)行QTL的命名。使用Mapchart 2.2繪制遺傳圖譜。

1.5 ?株高和葉數(shù)性狀相關(guān)候選基因預(yù)測(cè)

根據(jù)QTL定位的結(jié)果，利用中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//218.28.140.17/）注釋目標(biāo)區(qū)段內(nèi)的基因功能，查閱可能與葉數(shù)和株高性狀相關(guān)的基因，進(jìn)行候選基因預(yù)測(cè)。

2 ?結(jié)??果

2.1??株高和葉數(shù)性狀表型分析

在兩個(gè)環(huán)境條件下，親本和BC1F1群體的株高和葉數(shù)性狀表型值如表1所示，在BC1F1群體中，不同株系間株高和葉數(shù)差異顯著，表現(xiàn)為連續(xù)性變異。在四川點(diǎn)，葉數(shù)的變異幅度為11～20.50片，平均16.04片，株高的變異幅度為142.06～193.57 cm，平均161.95 cm;在山東點(diǎn)，葉數(shù)的變異幅度為15.61～26.36片，平均為22.38片，株高的變異幅度為53.75～185 cm，平均126.52?cm;兩性狀的平均值均介于雙親之間，且存在雙向超親個(gè)體。株高和葉數(shù)性狀變異系數(shù)在3.90%～9.70%之間，說(shuō)明BC1F1群體中兩性狀存在較大的分離。統(tǒng)計(jì)兩個(gè)地點(diǎn)株高

和葉數(shù)性狀的偏度和峰度發(fā)現(xiàn)，偏度的絕對(duì)值在0.35～0.98之間，峰度的絕對(duì)值在4.60～10.66之間，符合單峰正態(tài)分布的特征，表明株高和葉數(shù)屬于數(shù)量性狀。方差分析表明（表2），煙草株高和葉數(shù)性狀在不同基因型之間均存在顯著差異，在不同的環(huán)境和基因型與環(huán)境互作中也存在顯著差異。

2.2??株高和葉數(shù)性狀QTL定位分析

本研究針對(duì)株高和葉數(shù)兩個(gè)性狀進(jìn)行全基因組QTL掃描，共檢測(cè)到4個(gè)QTL（表3，圖1），分別分布在第21和第23號(hào)連鎖群上。

在四川和山東試驗(yàn)基地檢測(cè)到與葉數(shù)相關(guān)的QTL各1個(gè)，分別命名為qLN23-1和qLN23-2。四川點(diǎn)qLN23-1位于23號(hào)連鎖群maker69553-maker76610標(biāo)記之間，可解釋19.34%的遺傳變異;山東點(diǎn)qLN23-2位于23號(hào)連鎖群標(biāo)記maker45399-maker47428標(biāo)記之間，可解釋總表型變異的14.81%。雖然兩個(gè)環(huán)境點(diǎn)在23號(hào)連鎖群上都可以定位到一個(gè)控制葉數(shù)的主效QTL，但兩個(gè)QTL所在遺傳位置差距較大，不是同一主效位點(diǎn)。

檢測(cè)到與株高相關(guān)的QTL有3個(gè)，分別命名為qPH23-1、qPH23-2和qPH21。在四川和山東試驗(yàn)基地檢測(cè)到的qPH23-1和qPH23-2均分布在23號(hào)連鎖群上，qPH23-1位于標(biāo)記maker9429和標(biāo)記maker222554之間，可解釋19.76%的表型遺傳變異;qPH23-2位于標(biāo)記maker45399和標(biāo)記maker47428之間，可解釋總表型變異的19.99%，兩者位置相近;同時(shí)，位于山東點(diǎn)23號(hào)連鎖群上控制株高（qPH23-2）和葉數(shù)性狀（qLN23-2）的主效位點(diǎn)的位置一致。除此之外，在山東試驗(yàn)基地還檢測(cè)到一個(gè)QTL（qPH21）位于21號(hào)連鎖群上，位于標(biāo)記maker17152和標(biāo)記maker1243之間，可解釋10.46%的表型遺傳變異。

2.3??預(yù)測(cè)候選基因

根據(jù)QTL定位和分析的結(jié)果，位于23號(hào)連鎖群上的主效位點(diǎn)存在一因多效，可能與葉數(shù)和株高性狀緊密相關(guān)。因此，在中國(guó)煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//218.28.140.17/）網(wǎng)站中以該主效位點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的紅花大金元參考基因組的物理位置進(jìn)行候選基因的篩選。如表4所示，目標(biāo)區(qū)間內(nèi)共有15個(gè)編碼基因，注釋功能為E3泛素蛋白連接酶、bHLH68轉(zhuǎn)錄因子、核孔復(fù)合體蛋白、膜結(jié)合?；D(zhuǎn)移酶C24H6.01c、肽/硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體、MYB86轉(zhuǎn)錄因子、類轉(zhuǎn)座子蛋白、疏水蛋白R(shí)CI2B、生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白等等。其中Ntab0789630編碼與擬南芥bHLH68轉(zhuǎn)錄因子功能相似的蛋白，與側(cè)根的發(fā)育、胚軸的伸長(zhǎng)和調(diào)控不同生理過程有關(guān)^[16-19];Ntab0035030與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因家族MYB86相似，與黃酮類物質(zhì)含量和花青素積累有關(guān)^[20-22];Ntab0702260與擬南芥生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白SAUR71相似，在細(xì)胞生長(zhǎng)、根分生組織發(fā)育和生長(zhǎng)素運(yùn)輸中起到調(diào)節(jié)作用^[23]。因此，初步將Ntab0789630和Ntab0702260確定為控制煙草株高和葉數(shù)關(guān)鍵候選基因。

3 ?討??論

3.1 ?株高和葉數(shù)性狀的QTL定位及候選基因分析

本研究利用200個(gè)BC1F1群體分別在四川、山東兩個(gè)環(huán)境點(diǎn)評(píng)價(jià)群體材料的株高和葉數(shù)性狀，獲得穩(wěn)定、可靠表型，進(jìn)而利用構(gòu)建的高密度的遺傳圖譜對(duì)株高和葉數(shù)性狀進(jìn)行全基因組QTL定位分析，共檢測(cè)到4個(gè)與株高和葉數(shù)相關(guān)的主效QTL。本研究獲得的葉數(shù)性狀的主效QTL位于23號(hào)連鎖群上，控制株高性狀的主效QTL位于21和23號(hào)連鎖群上，均是新發(fā)現(xiàn)的QTL位點(diǎn)，均可以解釋10%以上的表型變異，研究結(jié)果具有真實(shí)性和可信度。山東點(diǎn)位于23號(hào)連鎖群上控制株高和葉數(shù)性狀的主效位點(diǎn)的位置一致，說(shuō)明這個(gè)位點(diǎn)具有一因多效的作用。但是，本研究的結(jié)果與李茜^[8]和童治軍等^[10]報(bào)道的結(jié)果不一致，說(shuō)明在不同種質(zhì)資源中存在著多個(gè)控制株高和葉數(shù)性狀的非等位主效位點(diǎn)。

針對(duì)我們定位到的控制株高和葉數(shù)的主效位點(diǎn)，初步開展了候選基因預(yù)測(cè)。在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)，預(yù)測(cè)了2個(gè)控制煙草株高和葉數(shù)性狀的關(guān)鍵候選基因。植物株高和葉數(shù)性狀的發(fā)育與細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)過程有關(guān)，同時(shí)受多種植物激素的調(diào)控。bHLH68轉(zhuǎn)錄因子通過參與脫落酸（ABA）的調(diào)控表達(dá)從而影響植物的器官發(fā)育和抗旱性^[17]。bHLH （Basic helix-loop-helix）轉(zhuǎn)錄因子家族是最大的基因家族之一，bHLH通過自身特定的功能域與靶基因相互識(shí)別并作用，進(jìn)而通過代謝信號(hào)通路調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫和次生代謝等過程中起關(guān)鍵作用^[24-27]。SAUR71是生長(zhǎng)素應(yīng)答基因家族SAUR的一種調(diào)控因子，在細(xì)胞增殖和擴(kuò)張過程中起作用，可能參與調(diào)控植物株高和葉片數(shù)的發(fā)育過程。因此，根據(jù)定位結(jié)果及候選基因分析，初步確定Ntab0789630和Ntab0702260為候選基因，相關(guān)功能驗(yàn)證正在開展中。

3.2 ?株高和葉數(shù)性狀在育種改良上的應(yīng)用

利用BC1F1群體和高密度遺傳連鎖圖譜，我們定位到了4個(gè)與株高和葉數(shù)相關(guān)的QTL，為今后進(jìn)一步挖掘相關(guān)的候選基因和煙草改良奠定了基礎(chǔ)。煙草的各個(gè)植物學(xué)性狀的綜合表現(xiàn)與它們之間復(fù)雜的相關(guān)性、遺傳控制和環(huán)境效應(yīng)均有直接或間接的關(guān)系。童治軍等^[28]和朱惠琴等^[29]對(duì)煙草各農(nóng)藝性狀的研究表明，株高、葉數(shù)、節(jié)距、葉長(zhǎng)、葉寬等農(nóng)藝性狀間具有顯著的相關(guān)性。WHITE等^[30]和殷英等^[31]的研究結(jié)果表明，煙草產(chǎn)量和葉片數(shù)、株高有較高的正相關(guān)。因此，本研究發(fā)掘的控制株高和葉數(shù)的主效QTL及緊密連鎖的分子標(biāo)記，可為煙草重要農(nóng)藝性狀改良提供可操作的遺傳單元，同時(shí)對(duì)培育優(yōu)質(zhì)、適產(chǎn)新品種也有一定意義。

4 ?結(jié)??論

本研究基于高密度的遺傳連鎖圖譜，結(jié)合200個(gè)BC1F1群體在兩環(huán)境下的表型，共挖掘到4個(gè)與株高和葉數(shù)性狀有關(guān)的QTL，根據(jù)QTL定位和分析的結(jié)果，對(duì)候選基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為今后進(jìn)一步開展煙草株高和葉數(shù)性狀的主效基因克隆及分子育種奠定基礎(chǔ)。

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作者簡(jiǎn)介：姜自鵬（1994-），女，在讀碩士研究生，主要研究領(lǐng)域：分子育種。E-mail：jiangzipeng59@163.com。*通信作者，E-mail：fuxiankui@caas.cn

收稿日期：2021-08-23 ????????????????修回日期：2022-02-15