三丁酸甘油酯與三乳酸甘油酯對(duì)脂多糖刺激肉雞生長(zhǎng)性能、血液生化指標(biāo)及肝臟能量狀態(tài)的影響

■李嬌龍 張 俊 邱洪儀 楊 玲 譚靈琳 丁斌鷹

（1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430023；2.武漢泛華生物技術(shù)有限公司，湖北武漢430023）

來(lái)自環(huán)境及飼養(yǎng)管理中的各種因素會(huì)對(duì)肉雞造成應(yīng)激，使其身體機(jī)能紊亂，生產(chǎn)性能下降，從而對(duì)肉雞生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁特有的結(jié)構(gòu)成分[3]，能夠造成機(jī)體免疫應(yīng)激。研究表明，LPS刺激顯著降低了AA肉公雞生長(zhǎng)性能[4]，顯著增加了仔豬肝臟能量損耗[5]。此外，它還能夠刺激肝臟釋放細(xì)胞因子，引起機(jī)體免疫反應(yīng)進(jìn)而造成肝臟損傷[6]。Olinga等[7]研究表明，LPS刺激鼠肝細(xì)胞顯著增加了培養(yǎng)基中TNFα、IL-1β和IL-10的水平。

三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯分別是由丁酸和乳酸與甘油酯化而成的。二者都被證明具有良好的抑菌效果，能抑制炎性因子分泌，還能作為能源物質(zhì)為機(jī)體供能[8-9]。Cox等[8]研究表明，肉雞日糧中分別添加0.5%的丁酸或乳酸能夠顯著降低消化道沙門氏菌水平。Zhang等[10]在肉雞日糧中添加0.1%的丁酸鈉顯著降低了血清IL-6、TNFα水平，說(shuō)明丁酸能夠緩解免疫應(yīng)激造成的機(jī)體損傷。但是，關(guān)于二種甘油酯對(duì)生長(zhǎng)性能和肝臟損傷修復(fù)效果的比較還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)的目的是通過(guò)對(duì)肉雞進(jìn)行LPS多次刺激，建立了一個(gè)LPS多次刺激模型，來(lái)探究三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯對(duì)LPS引起的生長(zhǎng)性能下降和肝臟損傷的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

240只健康、體重(45.1±0.5)g的1日齡Cobb肉公雞，購(gòu)于武漢正大畜牧有限公司。

三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯，純度為45%。均由武漢泛華生物技術(shù)有限公司提供。

LPS，大腸桿菌血清型O55:B5，購(gòu)于Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)日糧

試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)分兩期。

試驗(yàn)Ⅰ期：240只體重基本一致的1日齡Cobb肉公雞，隨機(jī)分成3組（對(duì)照組、丁酸酯組和乳酸酯組），每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只雞。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，丁酸酯組和乳酸酯組分別飼喂在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加0.1%三丁酸甘油酯和0.1%三乳酸甘油酯的試驗(yàn)日糧。

試驗(yàn)Ⅱ期：在試驗(yàn)第22 d，從試驗(yàn)Ⅰ期對(duì)照組選?。ò大w重基本一致的原則）20只雞分成對(duì)照組和LPS組（飼喂基礎(chǔ)日糧），從試驗(yàn)Ⅰ期丁酸酯組、乳酸酯組各選10只雞為試驗(yàn)Ⅱ期丁酸酯組、乳酸酯組（飼喂在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上分別添加0.1%三丁酸甘油酯和0.1%三乳酸甘油酯的試驗(yàn)日糧），每只雞單籠飼養(yǎng)。每組10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞。在第25、27、29 d上午8：00，對(duì)LPS組、丁酸酯組、乳酸酯組的試驗(yàn)肉雞分別腹腔注射500 μg/kg體重的LPS，對(duì)照組注射相同劑量的滅菌生理鹽水。在此期間，每只試驗(yàn)動(dòng)物采食量控制在80 g/d，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)肉雞飼養(yǎng)在不銹鋼籠中，每籠20只雞。試驗(yàn)期4周，室溫在第一周維持在32～33℃，第二周在30～32℃，后面兩周維持在26℃，并保持畜舍通風(fēng)良好。試驗(yàn)前3周，自由飲水與采食。

1.5 樣品采集與處理

試驗(yàn)開(kāi)始后，前三周每周對(duì)試驗(yàn)肉雞稱重，記錄采食量。試驗(yàn)第25 d注射LPS前和第30 d上午8:00前（均為禁食12 h后）稱重，并做好記錄。試驗(yàn)第29 d中午12:00（注射LPS后4 h）對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物頸靜脈采血15 ml，3 000 r/min離心15 min，分離血漿并于-80℃冰箱保存，待測(cè)。試驗(yàn)第30 d上午8:00屠宰，剖開(kāi)腹腔取肝臟切碎，然后迅速放入液氮中保存待測(cè)。

1.6 指標(biāo)測(cè)定

1.6.1 生長(zhǎng)性能的測(cè)定

生長(zhǎng)性能包括1～21日齡肉雞采食量、平均日增重、料重比和LPS多次刺激期間即試驗(yàn)25～29 d的平均日增重（ADG）。

1.6.2 血液生化指標(biāo)的測(cè)定

用日立7020全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（AKP）酶活。

1.6.3 腺苷酸水平的測(cè)定

采用反相高效液相色譜儀(Waters，美國(guó))測(cè)定肝臟腺苷酸水平，方法參照劉堅(jiān)等[11]的方法進(jìn)行。將肝臟從液氮中取出，在液氮中研磨成粉末狀。迅速稱取0.1～0.2 g置于預(yù)冷的勻漿器中，加入2 ml預(yù)冷的1.5 mol/l高氯酸，冰浴勻漿，然后離心（4 ℃，3 000×g，10 min），取上清液1 ml緩慢加入0.4 ml 2 mol/l碳酸鉀溶液中和，再離心（4 ℃，3 000×g，10 min），取上清液，-80℃保存待測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncan's法多重比較，顯著水平為P＜0.05。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧添加二種甘油三酯對(duì)1～21日齡肉雞生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表2）

表2 甘油三酯對(duì)1～21日齡肉雞生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯對(duì)1～21日齡肉雞生長(zhǎng)性能沒(méi)有顯著的影響（P＞0.05）。

2.2 日糧中添加二種甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞平均日增重的影響（見(jiàn)表3）

表3 甘油三酯對(duì)試驗(yàn)25～29 d肉雞平均日增重(ADG)的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，LPS組平均日增重顯著降低了19.4%（P＜0.05）。與LPS組相比，丁酸酯組、乳酸酯組平均日增重分別提高了9.1%、10.2%（P＞0.05）。

2.3 日糧中添加二種甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞血液生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表4）

表4 甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞血液生化指標(biāo)的影響（U/l）

由表4可知，與對(duì)照組相比，LPS刺激升高了血漿GPT含量18.8%(P＜0.05)和GOT含量18.6%(P＜0.05)。與LPS組相比，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯分別使血漿GPT含量降低了15.4%（P＜0.05）、23.3%（P＜0.05），血漿GOT含量降低了15.2%（P＜0.05）、14.7%（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯分別使血漿GPT和GOT含量變化不明顯（P＞0.05）。在AKP含量方面，LPS組與對(duì)照組、丁酸酯組與LPS組和對(duì)照組、乳酸酯組與LPS組和對(duì)照組之間差異不顯著（P＞0.05），但是丁酸酯組AKP含量比乳酸酯組的低25.09%（P＜0.05）。

2.4 日糧中添加二種甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞肝臟腺苷酸水平的影響（見(jiàn)表5）

表5 二種甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞肝臟腺苷酸水平的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，LPS刺激降低了肝臟ATP含量50.4%（P＜0.05）、ADP含量33.3%（P＜0.05）、AMP含量20.7%（P＜0.05）、TAN含量32.1%（P＜0.05）及EC 21.8%（P＜0.05），升高了AMP/ATP比值48.9%（P＜0.05）。與LPS組相比，日糧中添加0.1%三丁酸甘油酯、0.1%三乳酸甘油酯分別顯著提高了肝臟ATP含量 113%、81%（P＜0.05），ADP含量 61%、67.1%（P＜0.05），TAN含量45%、44.8%（P＜0.05）及EC 39.2%、22.6%（P＜0.05），分別降低了肝臟 AMP/ATP 比值44.4%、29.1%（P＜0.05）。同時(shí)與LPS組相比較，三乳酸甘油酯還提高了AMP含量27.2%（P＜0.05）。日糧中添加0.1%三丁酸甘油酯、0.1%三乳酸甘油酯，與對(duì)照組相比，在肝臟ATP、ADP、AMP、TAN含量和EC值差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

3.1 日糧中添加二種甘油三酯對(duì)1～21日齡肉雞生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)表明，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯對(duì)非應(yīng)激條件下肉雞生長(zhǎng)性能并無(wú)顯著性影響。這與Zhang等[10]的結(jié)果是基本一致的。其原因可能是三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯都可以為動(dòng)物體提供丁酸、乳酸等有機(jī)酸；而Leeson等[12]認(rèn)為，營(yíng)養(yǎng)狀況良好的健康肉雞在一個(gè)衛(wèi)生狀況良好，密度適中的環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)，日糧添加有機(jī)酸對(duì)其生長(zhǎng)并沒(méi)有顯著的效果。

3.2 日糧中添加二種甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞體增重的影響

LPS會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生毒性作用，例如通過(guò)刺激多種細(xì)胞因子的大量分泌而引起炎癥反應(yīng)，造成多器官損傷，影響機(jī)體新陳代謝等，最終影響了動(dòng)物的正常生長(zhǎng)[6,10,13]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在試驗(yàn)第25～29 d，LPS顯著降低了肉雞平均日增重（P＜0.05），這與Lee?son等[12]和Zhang等[10]的研究結(jié)果是一致的。Zhang等[10]的研究表明，LPS多次刺激后，肉雞的生長(zhǎng)性能顯著低于對(duì)照組。董曉鈴[4]也發(fā)現(xiàn)，LPS處理顯著降低了AA肉雞生長(zhǎng)性能。大量研究表明，丁酸、乳酸不僅具有抗菌作用，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，更能作為一種能量來(lái)源為機(jī)體供能。Zhang[10]的研究表明，添加0.1%的丁酸鈉可以顯著提高LPS刺激的肉雞日增重。在李瑞珍[14]的研究中日糧添加1.8%的乳酸顯著提高了仔豬日增重。在本試驗(yàn)中，與LPS組相比，日糧中添加0.1%的三丁酸甘油酯、三乳酸甘油酯分別使平均日增重升高了9.1%、10.2%，但未達(dá)到顯著水平。

3.3 日糧中添加二種甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞血液生化指標(biāo)的影響

GPT是在肝細(xì)胞內(nèi)合成的，主要分布在肝細(xì)胞的胞質(zhì)中，當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)會(huì)釋放入血，是反映肝細(xì)胞炎癥受損最敏感的指標(biāo)。GOT可以從受損的肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肌肉細(xì)胞或腦細(xì)胞中釋放入血。肝臟中的GOT主要存在于線粒體中，GOT升高說(shuō)明細(xì)胞器受損，肝臟損害嚴(yán)重。肝臟中含有高濃度的AKP，血液中AKP升高是肝臟受損的一種表現(xiàn)。由此可見(jiàn)，血液中GPT、GOT和AKP濃度升高可能是由肝臟受損導(dǎo)致的。

本試驗(yàn)中，LPS刺激顯著升高了血漿GPT和GOT水平。馮俊明等[15]的研究表明，LPS刺激庫(kù)普細(xì)胞后產(chǎn)生的活性遞質(zhì)(TNFα、IL-6、NO)顯著升高了培養(yǎng)肝細(xì)胞上清的GPT、GOT水平，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在修復(fù)肝臟疾病方面起著重要的作用[16]。在本試驗(yàn)中，與LPS組相比，日糧中添加0.1%三丁酸甘油酯、0.1%三乳酸甘油酯顯著降低了血漿中GPT、GOT水平。徐振飛等[17]和楊玲[18]的研究表明，日糧中添加丁酸鈉或三丁酸甘油酯均有降低斷奶仔豬血清GPT、GOT水平的趨勢(shì)（P＜0.05）。 Miyoshi等[19]給肝損傷的大鼠口服三丁酸甘油酯，發(fā)現(xiàn)三丁酸甘油酯抑制了NF-κB活性，從而減弱了肝損傷程度。Giest?ing等[20]建議，仔豬斷奶后受到應(yīng)激刺激，添加三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物如乳酸等將有助于緩解應(yīng)激，減少體組織分解。Tsiloyiannis等[21]的研究也表明，日糧添加1.5%的乳酸緩解了大腸桿菌感染引起的仔豬疾病。以上結(jié)果表明，三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯均能緩解LPS引起的肝臟損傷，且二種甘油三酯之間效果差異不顯著。

3.4 日糧中添加二種甘油三酯對(duì)LPS多次刺激肉雞肝臟腺苷酸水平的影響

線粒體是機(jī)體能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)代謝的中轉(zhuǎn)站，是機(jī)體所有氧化磷酸化的場(chǎng)所，為細(xì)胞各種活動(dòng)供能[22]。ATP是機(jī)體中存在的直接能量形式，水解可生成ADP或AMP并伴有大量的能量產(chǎn)生，用于機(jī)體各項(xiàng)生命活動(dòng)。與此同時(shí)，AMP通過(guò)氧化磷酸化和底物水平磷酸化獲得高能磷酸基團(tuán)形成ATP，三者始終保持著動(dòng)態(tài)平衡[5]。TAN是ATP、ADP和AMP三者之和，其大小反映了線粒體生成高能磷酸化合物的能力、氧化呼吸活性和細(xì)胞的能量?jī)?chǔ)備[5]。EC反映了高能磷酸鍵在ATP、ADP和AMP之間的相互轉(zhuǎn)換，是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞能量平衡的一個(gè)參數(shù)，可有效評(píng)估能量?jī)?chǔ)備狀態(tài)[22]。

研究結(jié)果表明，LPS顯著降低了大鼠肝臟琥珀酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶活性和EC水平，嚴(yán)重影響了肝臟的能量代謝[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS顯著降低了肝臟ATP、ADP、AMP、TAN含量和EC水平，顯著升高了AMP/ATP。以上結(jié)果表明，LPS刺激增加了肝臟能量損耗，降低了能量?jī)?chǔ)備。Beauvieux等[23]通過(guò)對(duì)大鼠肝臟灌注丁酸和中鏈脂肪酸發(fā)現(xiàn)，丁酸和中鏈脂肪酸增加了肝臟呼吸活性，修復(fù)了肝臟能量代謝。中短鏈脂肪酸通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)肝臟，進(jìn)入線粒體經(jīng)β-氧化生成NADH和FADH2，NADH和FADH2又進(jìn)入電子呼吸傳遞鏈生成ATP。乳酸通過(guò)腸腔進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)肝臟，在肝臟轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸可以進(jìn)入三羧酸循環(huán)生成ATP[24]。本試驗(yàn)研究結(jié)果與以上研究結(jié)果基本一致，與LPS組相比，丁酸酯組、乳酸酯組的肉雞肝臟ATP、ADP、TAN含量和EC水平都有顯著的升高。三乳酸甘油酯還顯著升高了肝臟AMP水平。以上結(jié)果表明，LPS刺激造成了肝臟腺苷酸水平發(fā)生了變化，能量?jī)?chǔ)備下降，而三丁酸甘油酯和三乳酸甘油酯均能緩解LPS造成的不利影響。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示：LPS多次刺激顯著升高了血漿GPT、GOT水平，增加了肝臟的能量損耗；而日糧中分別添加0.1%三丁酸甘油酯和0.1%三乳酸甘油酯均顯著緩解了LPS多次刺激造成的肝細(xì)胞損傷和能量損耗，且二者之間并無(wú)顯著差異。