植物乳桿菌增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

■ 王 欣 趙 巍 付 麗甄玉國，2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉農(nóng)博瑞奶牛研發(fā)中心，吉林長春130118；2.長春博瑞飼料集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，吉林長春130114）

乳酸菌是一類能將碳水化合物發(fā)酵且主要代謝產(chǎn)物為乳酸的革蘭氏陽性菌[1]，在自然界分布廣泛，種類繁多，是動物胃腸道的優(yōu)勢菌群，具有調(diào)節(jié)動物胃腸道菌群平衡、改善腸道內(nèi)環(huán)境、增強(qiáng)免疫力和抵抗力等多種功能[2-7]，在食品、畜牧業(yè)及醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的日益成熟，應(yīng)用這類技術(shù)對乳酸菌的研究更加深入，這些研究加深了人們對于乳酸菌益生作用的認(rèn)識，乳酸菌成為微生物學(xué)家和營養(yǎng)專家研究的熱點(diǎn)。本文主要是通過對植物乳桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，從而使植物乳桿菌的菌體生物量達(dá)到最大，為乳酸菌的高密度發(fā)酵和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

植物乳桿菌由中國微生物保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖5.0 g、吐溫80 1.0 ml、檸檬酸氫二銨2.0 g、無水乙酸鈉 5.0 g、K2HPO42.0 g、MnSO4·H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蒸餾水1.0 L，pH值6.8。

MRS固體培養(yǎng)基[8]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸氫二銨 2.0 g、Tween80 1.0 ml、K2HPO42.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·H2O 0.05 g、CaCO320.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1.0 L，pH值6.8。

MRS液體培養(yǎng)基[8]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 ml、檸檬酸氫二銨2.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、K2HPO42.0 g、MnSO4·H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、蒸餾水 1.0 L，pH 值6.8。

1.3 乳酸菌生長曲線繪制

取斜面菌種一環(huán)，接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，活化兩代。將活化后的乳酸菌，接入400 ml MRS液體培養(yǎng)基中，接種量為2%。將接入菌體的液體培養(yǎng)基搖勻后分裝于10 ml EP管中，每管5 ml，置于37℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每隔2 h取三支EP管置4℃冰箱保存。待EP管全部取完后，用722分光光度計在光程為1 cm、波長為600 nm測量吸光度值，以同一批次滅菌而未接入菌種的MRS液體培養(yǎng)基為參比，繪制菌體生長曲線。

1.4 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.4.1 碳源及其添加量的篩選

選取葡萄糖、乳糖、蔗糖、糖蜜、可溶性淀粉為碳源，仍以2%的添加量替代MRS培養(yǎng)基中的碳源，培養(yǎng)16 h后，用722分光光度計在600 nm的條件下測定OD值，用酸度計測定pH值。將最佳碳源分別以1%、1.5%、2.0%、2.5%、3%、3.5%、4.0%、4.5%的添加量加入MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)16 h，測定OD值。

1.4.2 氮源及其添加量的篩選

選取硫酸銨、尿素、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨和牛肉膏組合（1∶1）為氮源，按照MRS培養(yǎng)基中氮的含量和以上每種物質(zhì)中所含的總氮量分別折算氮源的添加量。37℃培養(yǎng)16 h，測定OD值。將最佳氮源分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的添加量加入MRS培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)16 h，測定OD值。

1.4.3 各種無機(jī)鹽、刺激因子、緩沖鹽及其添加量的篩選

將MRS中的無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、磷酸氫二鉀、MnSO4·H2O 0.05 g、MgSO4·7H2O和吐溫80分別單一加入培養(yǎng)基中，通過測定OD值，得出各種無機(jī)鹽及刺激因子對乳酸菌繁殖速率的相關(guān)性。依據(jù)各種無機(jī)鹽、刺激因子及緩沖鹽對乳酸菌繁殖快慢的影響，對各種物質(zhì)的添加量進(jìn)行篩選。

1.4.4 正交試驗(yàn)

考慮到各個因素之間的互作作用，選取葡萄糖、蛋白胨和MnSO4·H2O三個因素為主要因素，進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)設(shè)計。

1.5 統(tǒng)計分析

用Excel將不同培養(yǎng)基成分對植物乳桿菌OD值和pH值的影響進(jìn)行整理，通過SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌生長曲線繪制（見圖1）

圖1 植物乳桿菌的生長曲線和pH值變化曲線

通過生長曲線我們可以看出，隨著培養(yǎng)時間的增加，植物乳桿菌的生物量在迅速增長，在4 h進(jìn)入對數(shù)期，到達(dá)16 h進(jìn)入穩(wěn)定期，24 h以后OD值略有下降，可能是由于一部分細(xì)菌發(fā)生菌體自溶。pH值的變化和植物乳桿菌的生物量變化是相符合的，由于植物乳桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸，所以，隨著培養(yǎng)時間的增加，pH值急劇下降，當(dāng)培養(yǎng)到16 h，pH值下降幅度減小，逐漸趨于穩(wěn)定。由于發(fā)酵產(chǎn)物中積累了大量的乳酸抑制了乳酸菌的繁殖，所以pH值的下降幅度會減小。

2.2 不同碳源對植物乳桿菌OD值的影響（見圖2）

圖2 不同碳源對植物乳桿菌OD值的影響

如圖2所示，植物乳桿菌的最佳碳源為葡萄糖，其次為蔗糖，再次為糖蜜，淀粉不能被植物乳桿菌有效利用，因?yàn)榈矸蹫槎嗵?，乳酸菌在利用的過程中需要水解成單糖后才可以吸收利用。乳酸菌本身缺乏分泌分解淀粉的酶，所以對淀粉的利用效果最差；而葡萄糖作為碳源對植物乳桿菌的生長促進(jìn)作用明顯，而淀粉不能有效促進(jìn)植物乳桿菌的生長。葡萄糖為速效利用碳源，屬于單糖，可以被乳酸菌直接利用，迅速提高菌體的生物量。

2.3 葡萄糖最佳添加量的篩選（見圖3）

圖3 葡萄糖添加量對植物乳桿菌OD值的影響

隨著葡萄糖添加量的增加，OD值逐漸增大，當(dāng)添加量達(dá)到3.0%，OD值達(dá)到最大；再增加葡萄糖的量，OD值又逐漸減小，但降低的幅度不明顯。葡萄糖的添加量在3.0%處出現(xiàn)拐點(diǎn)，所以葡萄糖的最佳添加量為3.0%。

2.4 不同氮源對植物乳桿菌的影響（見圖4）

圖4 不同氮源對植物乳桿菌OD值的影響

由圖4中可以看出，牛肉膏和蛋白胨為有機(jī)氮源，能夠有效促進(jìn)植物乳桿菌的生長，而植物乳桿菌對于無機(jī)氮源的利用效果較差。由于乳酸菌合成蛋白和分解蛋白的能力都比較差，不易利用無機(jī)氮源，而有機(jī)氮源中含有豐富的氨基酸比較容易被吸收，所以能有效提高植物乳桿菌的菌體生物量。單獨(dú)使用蛋白胨與混合牛肉膏使用對植物乳桿菌的效果一樣，考慮到成本問題，選用蛋白胨為植物乳桿菌的氮源。

2.5 蛋白胨最適添加量的篩選（見圖5）

圖5 蛋白胨添加量對植物乳桿菌OD值的影響

選擇蛋白胨的添加量為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%，培養(yǎng)16 h后，測定OD值。

如圖5顯示，隨著蛋白胨添加量的增加，植物乳桿菌的OD值在不斷增加，在3.0%處出現(xiàn)拐點(diǎn)，所以蛋白胨的最適添加量為3.0%。

2.6 不同無機(jī)鹽、刺激因子及緩沖鹽對植物乳桿菌OD值的影響（見圖6）

圖6 不同無機(jī)鹽對植物乳桿菌OD值的影響

在以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中依次單一加入無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、K2HPO4和吐溫80進(jìn)行試驗(yàn)，以不加以上的無機(jī)鹽、刺激因子和緩沖鹽為對照組。結(jié)果表明，添加無水乙酸鈉、檸檬酸氫二銨、MnSO4·H2O和吐溫80對乳酸菌的增殖有促進(jìn)作用，其中MnSO4·H2O對植物乳桿菌菌的增殖效果最為明顯，其次為無水乙酸鈉，而硫酸鎂和磷酸氫二鉀對植物乳桿菌的促進(jìn)作用不大。

2.6.1 硫酸錳最適添加量的篩選（見圖7）

圖7 硫酸錳添加量對植物乳桿菌OD值的影響

在以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中，依次加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/l的硫酸錳，以不加硫酸錳作為對照。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加0.05 g/l的硫酸錳對植物乳桿菌的促進(jìn)作用最強(qiáng)，所以硫酸錳的添加量為0.05 g/l。

2.6.2 無水乙酸鈉最適添加量的篩選（見圖8）

圖8 無水乙酸鈉添加量對植物乳桿菌OD值的影響

在以葡萄糖為碳源、蛋白胨為氮源、加入硫酸錳0.05 g/l的培養(yǎng)基中，依次加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%的無水乙酸鈉，不添加無水乙酸鈉為對照。結(jié)果表明，1.4%的無水乙酸鈉對植物乳桿菌的促進(jìn)作用最為明顯。

2.6.3 檸檬酸氫二銨最適添加量的篩選（見圖9）

圖9 檸檬酸氫二銨添加量對植物乳桿菌OD值的影響

與篩選硫酸錳和無水乙酸鈉同樣的道理篩選檸檬酸氫二銨。結(jié)果表明：隨著檸檬酸氫二銨濃度增加，植物乳桿菌的濃度隨之增加，在0.5%時達(dá)到最大，繼續(xù)增加檸檬酸氫二銨濃度，菌體濃度逐漸下降。可能的原因是檸檬酸氫二銨對植物乳桿菌的糖酵解途徑的關(guān)鍵酶——磷酸果糖激酶具有調(diào)節(jié)作用，檸檬酸對磷酸果糖激酶具有抑制作用，而可以解除檸檬酸的抑制作用。

2.6.4 吐溫80最適添加量的篩選（見圖10）

吐溫80作為一種刺激物質(zhì)，對植物乳桿菌的增殖作用不是很大，但是在培養(yǎng)基中添加吐溫80對代謝產(chǎn)物中產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物有一定作用，由圖10可知，吐溫80的最佳添加量為0.40%。

圖10 吐溫80對植物乳桿菌OD值的影響

2.7 酵母粉最適添加量的篩選（見圖11）

圖11 酵母粉對植物乳桿菌OD值的影響

酵母浸粉中含有豐富的維生素和生長因子，在培養(yǎng)基中添加少量酵母粉對細(xì)菌的繁殖有促進(jìn)作用，由圖11可知，添加1.0%的酵母浸粉對植物乳桿菌的促進(jìn)作用最好，在此添加量出現(xiàn)拐點(diǎn)。

2.8 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，從R值可以看出，影響植物乳桿菌OD值的主次順序?yàn)锳＞C＞B，因此，植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)培養(yǎng)基組合為A2B2C3，即葡萄糖的添加量為3.0%、蛋白胨添加量為3.0%、硫酸錳的添加量為0.07 g/l。從R值可以看出，培養(yǎng)基中的葡萄糖對OD值影響最大，綜合考慮發(fā)酵條件的互作效應(yīng)，植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為葡萄糖3.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1%、無水乙酸鈉1.4%、檸檬酸氫二銨 0.5%、MnSO4·H2O 0.07 g/l、MgSO4·7H2O 0.2%、K2HPO40.2%、吐溫80 0.4%。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，OD值提高到17.258，大約是優(yōu)化前的2倍。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 碳源對植物乳桿菌菌體生物量的影響

碳源是微生物繁殖過程中的主要物質(zhì)之一，是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的基礎(chǔ)，為微生物繁殖過程中提供大量的能源。如果碳源合適則乳酸菌吸收和利用碳源比較容易，從而節(jié)省了大量的能量，有利于菌體生長；反之，乳酸菌吸收和利用碳源時要消耗大量的能量，不利于乳酸菌的增殖。徐洪偉等[9]研究了不同碳源、氮源對乳酸桿菌小分子肽產(chǎn)量及抑菌效果的影響，結(jié)果表明葡萄糖為碳源的發(fā)酵液的生物量最大。梁璋成等[10]對植物乳桿菌R23進(jìn)行了培養(yǎng)基的優(yōu)化，結(jié)果指出植物乳桿菌最佳碳源為葡萄糖。Lovijesteijn等[11]研究指出，德氏保加利亞乳桿菌NCFB2772以葡萄糖為碳源比以果糖為碳源時產(chǎn)胞外多糖的量提高2倍。本試驗(yàn)選用葡糖糖、蔗糖、乳糖、糖蜜、淀粉等作為碳源，結(jié)果表明，3%的葡萄糖對植物乳桿菌的增殖作用最好，結(jié)果與前人研究相一致。葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，不同碳源相比較，葡萄糖為單糖而且是速效利用碳源，而淀粉為多糖需要分解為單糖或二糖才能被利用[12]。當(dāng)然，不同種屬的乳酸菌對碳源的種類要求不同，不同的研究需要的代謝產(chǎn)物不同而需選擇不同的碳源。

3.2 氮源對植物乳桿菌菌體生物量的影響

用于培養(yǎng)乳酸菌的氮源有很多，包括有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。氮是微生物生長發(fā)育過程中組成核酸和蛋白質(zhì)的重要元素，對微生物的生長發(fā)育有著重要作用。實(shí)驗(yàn)室常用于培養(yǎng)乳酸菌的培養(yǎng)基有MRS、CM和M17，而這三種培養(yǎng)基的共同特點(diǎn)是氮源由多種有機(jī)氮源混合提供。從試驗(yàn)結(jié)果看出，植物乳桿菌對無機(jī)氮源的利用效果差，因?yàn)橹参锶闂U菌對氮源要求比較苛刻，必須吸收利用多種有機(jī)氮源中的氨基酸和生長因子才能有效促進(jìn)植物乳桿菌的生長，所以最終選擇3.0%的蛋白胨提供氮源。

3.3 無機(jī)鹽對植物乳桿菌菌體生物量的影響

無機(jī)鹽也是細(xì)菌生長不可缺少的物質(zhì)，無機(jī)鹽的主要作用是維持菌體的滲透壓，另一方面一些離子對細(xì)菌體內(nèi)的酶有激活作用。乳酸菌在代謝過程中產(chǎn)生乳酸使pH值下降，故培養(yǎng)基中需要加入一些緩沖鹽來調(diào)節(jié)pH值，維持滲透壓，從而使乳酸菌更好地生長。梁璋成等[10]報道在培養(yǎng)基中引入0.05 g/l MnSO4菌量比無錳培養(yǎng)基高2倍左右，可能是因?yàn)镸n2+是葡萄糖激酶、醛縮酶、變位酶、磷酸烯醇化酶、丙酮酸激酶等主要酶的激活劑。陳秀珠等[13]的研究顯示，Mn2+對Nisin的產(chǎn)生有促進(jìn)作用，Cu2+則有強(qiáng)烈的抑制作用；Mg2+可增加細(xì)菌素Pediocin AcH的產(chǎn)量。本試驗(yàn)對多種無機(jī)鹽進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，硫酸錳和無水乙酸鈉對植物乳桿菌的生長促進(jìn)作用較大，此結(jié)果與梁璋成報道相一致。而磷酸氫二鉀、硫酸鎂和檸檬酸氫二銨對植物乳桿菌的生長促進(jìn)作用不明顯，但是考慮到Mg2+和磷是很多酶的激活劑，對產(chǎn)生某種特定的代謝產(chǎn)物起一定的作用，所以在培養(yǎng)基中加入了少量的Mg2+和P。

3.4 刺激因子對植物乳桿菌菌體生物量的影響

Garver[14]等研究發(fā)現(xiàn)，在MRS培養(yǎng)基中添加Tween80對細(xì)菌的生長無明顯影響，但添加Tween80乳酸菌代謝物中會產(chǎn)生彎曲乳桿菌素（Curvaticin FS47）。在培養(yǎng)基中添加1%的Tween80可提高乳酸乳球菌乳脂亞種J46的細(xì)菌素產(chǎn)量，但是增加到2%時，對其產(chǎn)量并無影響。莊緒亮等[15]研究了不同發(fā)酵條件下Tween80對乳酸鏈球菌SM526產(chǎn)Nisin的影響，結(jié)果表明，在pH值為7.0發(fā)酵條件下，Tween80對乳酸鏈球菌SM526產(chǎn)Nisin都有一定的提高作用。本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中加入了0.4%的吐溫80，對植物乳桿菌的生長作用并不是很大，但添加吐溫80主要是考慮吐溫80對細(xì)菌素的產(chǎn)生有一定的促進(jìn)作用，為后期厭氧培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

①植物乳桿菌的最佳增殖培養(yǎng)基為葡萄糖3.0%、蛋白胨3.0%、酵母粉1%、無水乙酸鈉1.4%、檸檬酸氫二銨 0.5%、MnSO4·H2O 0.07 g/l、MgSO4·7H2O 0.2%、K2HPO40.2%、吐溫80 0.4%，OD600值從9.428提高到了17.258。

②在培養(yǎng)基中加入Mn2+比不加Mn2+乳酸菌菌體的OD值提高了將近2倍（見圖6）。