嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕中細菌素的研究

■魏曉燕 張文舉

（石河子大學動物科技學院，新疆石河子832000)

近年來由于食品中抗生素的使用而引起的藥物殘留以及防腐劑添加超標而導致的各種損失,已引起了人們的廣泛關注。人們迫切需要探尋一種能取代抗生素的抗菌劑,于是細菌素成為了近年來研究的熱點。嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)獨特的生理、生化特性被認為是最理想的促生長替代抗生素的益生菌，其代謝產(chǎn)物細菌素以其無毒性、對熱穩(wěn)定，易被消化道中的蛋白酶降解，且低濃度下具有抑菌活性等特性，被認為是一種具有廣闊應用前景的防腐劑和飼料添加劑[1-2]。

本研究以前期篩選出的產(chǎn)細菌素嗜酸乳桿菌為發(fā)酵菌株，分別發(fā)酵棉粕、豆粕，比較兩者發(fā)酵后細菌素的活性，研究嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕飼料中無機離子及不同干燥和保存方法對細菌素活性的影響，探索其在棉粕源發(fā)酵飼料中應用的可行性，為后續(xù)在飼料工業(yè)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品

棉粕、玉米由新疆石河子天康飼料有限公司提供，粉碎，過60目篩。

發(fā)酵菌種為篩選的產(chǎn)細菌素嗜酸乳桿菌(Lacto?bacillus acidophilus)J2。

指示菌為沙門氏菌(Salmonella)，由石河子大學微生物實驗室提供。

培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.1.2 儀器與設備

透析袋(1 000 u)、微型植物粉碎機（FZ-102）、針筒式濾膜過濾器(Ф 25/0.22 μm)、酸度計（PHSJ-3F型）、電子分析天秤(BS224型，精確至0.000 1 g)、精密電子天秤(SL 2002N型，精度0.01 g)、高壓蒸汽滅菌鍋(MLS-3750型）、恒溫磁力攪拌器(HJ-3型)、電熱鼓風干燥箱（GZX-9070MBE型）、臺式真空冷凍干燥機(BT85B型)、真空包裝機(DZ-400/2C型)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GSP-9246MBE型)、雙人雙面垂直潔凈工作臺(SW-CJ-2F型)、臺式冷凍高速離心機(TG16G型)、高速冷凍離心機(himac CR226Ⅱ型)等。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)液制備

在無菌條件下，將嗜酸乳桿菌菌種劃線培養(yǎng)于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)36 h，從中挑取單個菌落接種于斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，然后挑取一環(huán)接種于5 ml MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)16 h（一級菌種），再取2.5 ml一級菌種接入50 ml MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)11 h（二級菌種）作為發(fā)酵菌種。

1.2.2 樣品處理

試驗組樣品處理：稱取100 g發(fā)酵底物(棉粕90%、玉米10%)置于500 ml三角瓶中，按底物初水分30%加入純化水，用玻璃棒攪拌均勻，密封，121℃蒸汽滅菌15 min，冷卻后在無菌條件下接入5 ml(7.6×107cfu/ml)嗜酸乳桿菌二級種子液，攪拌均勻后轉入100 ml無菌燒杯中，壓實，用保鮮膜和橡皮筋密封，置于培養(yǎng)箱發(fā)酵培養(yǎng)48 h，發(fā)酵結束后稱取10 g發(fā)酵樣品溶于20 ml無菌水中(4 ℃、10 000 r/min、15 min)離心，取上清保存于4℃冰箱中。豆粕組樣品處理與棉粕組相同。

對照組樣品處理：將100 g試驗底物置于500 ml三角瓶中混合均勻，然后加入30 ml的蒸餾水，充分攪拌調(diào)濕，pH值自然，在0.056 MPa、121℃條件下蒸汽滅菌20 min，冷卻后裝入樣品袋，保存于4℃冰箱中待測。

1.2.3 細菌素的提取

采用Yang[3]的分離方法并加以改動：將上述處理液置70℃水浴鍋中恒溫水浴處理30 min，使酶失活；冷卻至室溫后用4 M NaOH溶液調(diào)pH值至6.0；室溫電動攪拌30 min，使細菌素吸附在細胞上。離心（4 ℃、10 000 r/min、30 min），收集沉淀；將沉淀再次懸浮在5 mmol/l磷酸緩沖溶液100 ml中，進行二次洗滌。離心（4 ℃、10 000 r/min、30 min），收集沉淀；再將沉淀懸浮在100 mmol/l NaCI溶液5 ml中，用5%的H3PO4溶液調(diào)pH值為2.0；4℃電磁攪拌12 h，離心（4 ℃、10 000 r/min、15 min）收集上清液，并用細菌過濾器(孔徑 0.22 μm)過濾；用截留分子量1 000 Da的透析袋在pH值3.1的檸檬酸緩沖液中透析過夜后進行抑菌試驗。

單層瓊脂平板打孔法[4]：取直徑為90 mm的標準培養(yǎng)皿準確加入20 ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，水平放置，使之形成均勻一致，冷卻后4℃冰箱放置備用。吸取50 μl指示菌稀釋液（活菌數(shù)為107cfu/ml）于固體培養(yǎng)基中，用滅菌推棒涂抹均勻，用直徑為8 mm的無菌打孔器在平板上均勻打出擴散小孔，用無菌鑷子將孔中菌層培養(yǎng)基夾出，準確量取200 μl的待測液加入到小孔中，放置37℃培養(yǎng)16 h至長出明顯可見的抗菌圈，用游標卡尺測量其直徑，每個試驗設3個重復。

1.2.4 嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕、豆粕細菌素活性的對比研究

嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕：底料組成為棉粕90%、玉米10%，接種量為5.0 ml/100 g。溫度為37℃，底物初水分30%，初始pH值6，發(fā)酵時間48 h。

嗜酸乳桿菌發(fā)酵豆粕：底料組成為豆粕90%、玉米10%，其他發(fā)酵參數(shù)如上。

1.2.5 嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕中添加無機離子對細菌素產(chǎn)量的影響

無機離子對乳酸菌素的抑菌活性有一定影響，試驗一擬采用4因子6水平均勻設計試驗法優(yōu)化底物中無機離子添加量。水平設置見表1。

表1 生物飼料無機離子添加量優(yōu)化的因子與水平

根據(jù)SPSS 17.0統(tǒng)計軟件中的均勻設計法得到4因子6水平均勻設計U6(64)(見表2)，利用此表來安排試驗處理，每個處理3個重復，共計18個樣本。試驗測定指標為發(fā)酵產(chǎn)物中細菌素活性。

1.2.6 不同干燥方法和時間對細菌素活性的影響

對發(fā)酵后的棉粕飼料進行真空冷凍干燥和普通干燥處理。普通干燥以干燥溫度、干燥時間為二個因素，每個處理設3個重復，普通干燥溫度設置45、60、90、121 ℃ 4個梯度，干燥時間設置48、60、72 h三個梯度，每個處理設3個重復。以處理前底物中細菌素的活性為對照。測定不同的干燥溫度和干燥時間細菌素的活性。統(tǒng)計分析試驗結果，以細菌素活性最高的組合為優(yōu)化結果。

表2 生物飼料無機離子添加量的優(yōu)化均勻設計U6(64)

1.2.7 不同包裝方法對細菌素活性的影響

采用真空包裝（真空包裝袋，10×15×16絲）、普通包裝（PE封口袋、10×20×5絲）兩種方法進行包裝，每包裝樣50 g。測定干燥后飼料樣品不同貯存時間對細菌素活性的影響。時間設置：10、20、30、40、50、60 d。每個處理設置3個重復，以0 d時細菌素活性作為對照，測定細菌素的活性。

1.2.8 指標測定方法

嗜酸乳桿菌數(shù)采用平板計數(shù)法，按照SN/T1941.1—2007《進出口食品中乳酸菌檢驗方法》進行計數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel軟件整理，使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”來表示。

2 結果

2.1 嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕、豆粕中細菌素活性的對比研究(見表3)

表3 不同底物發(fā)酵后抑菌活性及嗜酸乳桿菌活菌數(shù)的變化

以高壓處理而未經(jīng)發(fā)酵棉粕源底物為空白對照1組，未發(fā)酵豆粕源底物為空白對照2組，表3中可以得出，發(fā)酵后底物的活菌數(shù)與抑菌圈直徑與對照組相比存在極顯著差異(P＜0.01)。棉粕組與豆粕組之間抑菌圈直徑差異不顯著，這說明細菌素的產(chǎn)量主要取決于產(chǎn)生菌，不同發(fā)酵底物對細菌素活性變化無顯著影響。

2.2 嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕中添加無機離子對細菌素產(chǎn)量的影響

2.2.1 以L.acidophilus活菌數(shù)為因變量的回歸分析

以L.acidophilus活菌數(shù)作為目標函數(shù)Y1，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對表4中的活菌數(shù)和因子水平試驗數(shù)據(jù)進行逐步回歸分析，得到如下回歸方程：

經(jīng)逐步回歸分析，該方程的確定系數(shù)R2=0.993，表明此回歸方程能夠準確表達各自變量與活菌數(shù)的關系，符合度較好。變量X2、X4與Y1呈負相關，標準偏回歸系數(shù)分別為-0.155、-0.992；變量X3與Y1呈正相關，標準偏回歸系數(shù)0.442；其中X1對活菌數(shù)含量差異不顯著(P＞0.05)，X3的作用為差異顯著(P＜0.05)，X4與Y1差異極顯著(P＜0.01)。根據(jù)該回歸方程，Y1最高指標時，各因變量組合為：X1(硫酸鎂)0 mg/kg、X2(檸檬酸三銨)50 mg/kg、X3（硫酸錳）25 mg/kg、X4（磷酸氫二鉀）50 mg/kg。

2.2.2 以抑菌圈直徑為因變量的回歸分析

以發(fā)酵產(chǎn)物中細菌素的抑菌圈直徑作為目標函數(shù)Y2，進行逐步回歸分析得到如下回歸方程：

該方程的確定系數(shù)R2=0.977，表明此回歸方程能夠準確表達各自變量與抑菌圈直徑的關系，符合度較好。各自變量與因變量Y2的標準偏回歸系數(shù)分別為X2（0.880）、X3（-0.028）、X4（0.656）；其中X3對抑菌圈直徑差異不顯著(P＞0.05),X2、X4與Y2差異顯著(P＜0.05)。根據(jù)該回歸方程，Y2最高指標時，各因變量組合為：X1（硫酸鎂）0 mg/kg、X2（檸檬酸三銨）300 mg/kg、X3（硫酸錳）0 mg/kg、X4（磷酸氫二鉀）300 mg/kg。

2.2.3 無機離子添加量的確定(見表4)

經(jīng)多重比較，各活菌數(shù)含量差異不顯著，因此取抑菌圈直徑為主指標，權重占90%，活菌數(shù)為次指標，權重占10%。嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉粕中底物微量元素添加量比例如下：X1（硫酸鎂）0 mg/kg、X2（檸檬酸三銨）275 mg/kg、X3（硫酸錳）2.5 mg/kg、X4（磷酸氫二鉀）270 mg/kg。我們發(fā)現(xiàn)X1（硫酸鎂）0 mg/kg的活菌數(shù)和抑菌圈直徑兩個指標的優(yōu)化結論是一致的，都是取試驗水平設置的最小值0。根據(jù)所確定的微量元素添加量比例和回歸方程1、2，計算得出的發(fā)酵底物活菌數(shù)和抑菌圈直徑預測值分別為：Y1=7.35×108cfu/g，Y2=15.43（mm）。

表4 生物蛋白飼料底物無機離子添加量的優(yōu)化試驗結果

2.3 不同干燥方法和時間對細菌素活性的影響（見表5）

表5 不同干燥方式對細菌素活性的影響

對發(fā)酵后的棉粕飼料進行真空冷凍干燥和電熱鼓風干燥處理，以處理前底物中細菌素的活性為空白對照。由表5可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)真空冷凍干燥后細菌素的抑菌圈直徑略高于普通電熱干燥（45℃、48 h）組、（45 ℃、60 h）組、（60 ℃、48 h）組及對照組，但各組之間差異不顯著。電熱干燥處理下，干燥的溫度和干燥時間對發(fā)酵產(chǎn)物中的抑菌活性均有影響，隨著干燥時間的增加，各組的抑菌活性呈下降趨勢。前期的研究可知細菌素是一種熱穩(wěn)定性物質(zhì)，能夠耐受121℃的高溫，故本試驗也設置了90、121℃這兩個水平，可以看出在高溫處理下產(chǎn)物中的細菌素仍具有一定的抑菌能力。綜合考慮，由于真空冷凍干燥過程中消耗的能量較大、生產(chǎn)能力小、設備成本和維持成本都很高，且較高的烘干溫度和時間都會破壞飼料的品質(zhì)，故選取電熱干燥45℃、48 h進行下一步試驗。

2.4 不同包裝方法對細菌素活性的影響（見圖1）

采用真空包裝、普通包裝兩種方法對干燥后的飼料樣品進行分裝，試驗數(shù)據(jù)顯示：采用真空包裝處理，飼料樣品的貯藏環(huán)境因與外界環(huán)境沒有氣體交換，故袋內(nèi)細菌素活性在0～20 d范圍內(nèi)細菌素活性變化較平緩。30 d后，抑菌活性消失。普通包裝組，隨著貯存時間的延長，抑菌活性呈明顯下降趨勢，貯藏至20 d時，達到最低臨界值。由圖1可見，采用兩種方法都存在隨著儲存時間的延長，活性不斷下降的問題，但真空包裝與普通包裝相比，在延長細菌素的貨架期方面具有較好優(yōu)勢。

圖1 不同包裝方法對細菌素抑菌活性的影響

3 討論

3.1 微生物發(fā)酵對底物益生菌含量的影響

益生菌作為飼料添加劑要獲得所預期的效果，活菌數(shù)需達到足夠的數(shù)量。王小磊[5]利用復合菌種對棉粕源飼料進行發(fā)酵，發(fā)酵后酵母菌活菌數(shù)達2.2×108cfu/g，乳酸菌活菌數(shù)達2.3×108cfu/g，芽孢桿菌達18.4×108cfu/g。鮑振國[6]以枯草芽孢桿菌發(fā)酵棉粕源生物飼料，發(fā)酵結束后枯草芽孢桿菌菌數(shù)提高7.98×107cfu/g，差異均極顯著（P＜0.01）。本研究所得的結果與前人的研究結果相似，活菌數(shù)較發(fā)酵前提高了一個數(shù)量級。

產(chǎn)細菌素嗜酸乳桿菌在發(fā)酵棉粕中原位表達細菌素，需要該乳酸菌能夠適應特殊的發(fā)酵環(huán)境，使其能夠在發(fā)酵飼料中發(fā)酵、加工和保藏過程中生長，并產(chǎn)生足夠量的細菌素。原位產(chǎn)細菌素的抑菌效力還可能受到各種因素的負面影響，如細菌素結合于底物成分（脂肪或蛋白質(zhì)顆粒）、蛋白酶或其他抑制劑可引起細菌素失活，溶解度和電荷的改變，目標細菌細胞膜的改變等。因此，細菌素在微生物發(fā)酵飼料中的應用有待進一步深入研究。

3.2 無機離子對細菌素產(chǎn)量的影響

無機離子對乳酸菌素的抑菌活性有一定影響。陳秀珠等[7]的研究表明，Mn2+對Nisin的產(chǎn)生有促進作用，而Cu2+則有強烈的抑制作用；Mg2+可增加細菌素pedio?cin AcH的產(chǎn)量。Koichi kuwano等[8]研究發(fā)現(xiàn)，Nisin Z在100 mM氯化鈉的條件下對金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯增強，因為高鹽環(huán)境能夠改變指示菌細胞膜的受體LipidⅡ的極性，增大了膜內(nèi)外電位差，從而改變了指示菌細胞膜的通透性。烏云達來等[9]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸三鈉水合物對產(chǎn)生細菌素為負效應，即隨著檸檬酸三鈉水合物的添加量的增加細菌素產(chǎn)量呈下降趨勢。本研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸三銨與抑菌圈直徑為正相關。

3.3 不同干燥方法對細菌素活性的影響

飼料發(fā)酵后烘干主要是為了迅速降低發(fā)酵產(chǎn)生的大量水分，避免與空氣接觸污染變質(zhì)，以便于包裝、貯藏、運輸、加工和使用。和常規(guī)干燥工藝比較，真空冷凍干燥在保持物料的物理化學特性和生物活性及營養(yǎng)成分方面具有非常明顯的優(yōu)勢：凍干工藝對生物細胞和組織破壞極小，同時凍干工藝對生物細胞和組織破壞極小，在一定條件下容易吸水還原為原來的鮮活態(tài)。已有研究表明，應用冷凍干燥方法保存細菌、真菌、病毒等取得了顯著的效果。但凍干工藝能耗高、設備控制難度大、操作成本也比其它干燥方法高出5～7倍[10]。因此，凍干技術的廣泛應用受到很大限制。采用烘箱干燥，干燥速度較慢且消耗的能量比較高，但這種干燥方法操作容易控制。Ortwin Simon[11]認為嗜酸乳桿菌作為飼料添加劑的主要限制因素就是因為其耐熱性差，在高溫條件下存活率低，在飼料加工和儲存過程中的穩(wěn)定性很差。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物細菌素具有較好的熱穩(wěn)定性，可耐受電熱干燥（60℃、48 h），這一特性可保證其在熱加工條件下，抵抗熱破壞免于失活，拓寬了其作為飼料添加劑的前景。

3.4 不同包裝方法對細菌素活性的影響

真空包裝是指將產(chǎn)品裝入氣密性包裝中，然后抽去包裝內(nèi)部的氣體并密封，從而使密封后的包裝內(nèi)部達到預定真空度的一種包裝方法。真空包裝主要用于食品保鮮，通過使包裝內(nèi)部達到真空狀態(tài)來抑制微生物生長，可使被包裝物品達到隔氧、保鮮、防潮、防霉、防銹、防蝕、防蟲、防污染等目的，有效地延長保質(zhì)期、保鮮期，便于存放和運輸[12]。本研究對比了2種包裝方式下嗜酸乳桿菌發(fā)酵飼料中細菌素在不同貯藏時間下活性的變化規(guī)律，真空包裝下數(shù)值的變化和相關報道的基本相似。研究結果說明，真空包裝貯存細菌素的效果優(yōu)于普通包裝，真空包裝是一種較好的保質(zhì)貯藏方式。

4 結論

①細菌素的產(chǎn)量主要取決于產(chǎn)生菌，同一株菌發(fā)酵不同底物對細菌素活性變化無顯著影響。

②底物微量元素添加量的優(yōu)化結果為：X1（硫酸鎂）0 mg/kg、X2（檸檬酸三銨）275 mg/kg、X3（硫酸錳）2.5 mg/kg、X4（磷酸氫二鉀）270 mg/kg。

③ 真空冷凍干燥的抑菌效果優(yōu)于電熱干燥（45 ℃、48 h）、（45 ℃、60 h）、（60 ℃、48 h）組，各組之間差異不顯著。

④真空包裝與普通包裝相比，在延長細菌素的貯存時間方面具有優(yōu)勢。