低氧調(diào)節(jié)大鼠前額葉皮層IGFs家族基因的表達(dá)*

祖胡月，瞿 專，任紀(jì)龍，陳學(xué)群，杜繼曾

（浙江大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)研究室，杭州310058）

胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）是重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有神經(jīng)保護(hù)作用，在體內(nèi)廣泛分布，通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌的方式起作用。IGF的生物學(xué)活性受到其結(jié)合蛋白IGFBPs的調(diào)節(jié)，IGFBPs對游離的IGF的含量及IGF與細(xì)胞表面IGFR的結(jié)合存在精細(xì)調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞對IGF信號的應(yīng)答。其家族包括配體IGF-I，IGF-II，I型、II型胰島素樣生長因子受體，以及6個(gè)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP1-6）。我們的研究表明低氧調(diào)節(jié)肝臟IGFI和IGFBP1基因表達(dá)，高原動(dòng)物肝細(xì)胞IGF-I和IGFBP1基因表達(dá)表現(xiàn)出對高原低氧損傷的保護(hù)作用［1］，但I(xiàn)GF家族是否參與大鼠低氧下大腦皮層細(xì)胞的損傷與保護(hù)？本研究目的是探討低氧下IGF家族對大鼠大腦皮層細(xì)胞的損傷保護(hù)，比較急性和慢性低氧對腦皮層細(xì)胞IGF家族基因表達(dá)的不同調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和低氧處理

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用健康雄性、清潔級 SD大鼠，體重（180±20）g，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SCXK2008-0033）。隨機(jī)分為對照組和低氧組（n＝6～7）：低氧組分別模擬 5 km（相當(dāng)于海平面的 10.8%O2）低氧 8 h、24 h、5 d、10 d和15 d，對照組置于杭州海拔高度不予低氧處理。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在低氧處理后，被迅速斷頭犧牲，剝?nèi)〈竽X，置于液氮罐中冷凍，后移至-80℃冰箱保存。稱取約50 mg前額葉皮層檢測。

1.2 樣品準(zhǔn)備和方法

qPCR樣品制備：使用 E.Z.N.A.DNA／RNA／Protein Isolation Kit（OMEGA，R6734-02）共提取前額葉皮層 DNA、RNA、Protein，放入-80℃冰箱備用。采用TransScript TM First-Strand cDNA Synthesis Super-Mix（TransGenBiotech，AT301）試劑盒將 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20℃冰箱保存。

1.3 Quantitative Real-Time PCR

qPCR反應(yīng)體系使用Takara公司SYBR Premix Ex TaqTM，利用Roche熒光定量PCR儀-480II進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和分析，以18s rRNA作為內(nèi)參。IGF-I，IGF-II，IGF-1R，IGFBP1和 18S熒光定量引物如下（表1）。經(jīng)嚴(yán)格預(yù)實(shí)驗(yàn)，PCR產(chǎn)物的電泳條帶清晰，分子量正確，無雜帶，溶解曲線好。

Tab.1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism5軟件分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，組間采用 t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 急性和慢性低氧5 km對大鼠前額葉皮層IGF-I mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

急性低氧5 km 8 h顯著升高了大鼠前額葉皮層IGF-I mRNA的表達(dá)（P＜0.01，圖 1），但 24 h時(shí)，表達(dá)明顯降低（P＜0.05，圖 1）。慢性低氧第5天時(shí)，大鼠前額葉皮層 IGF-I mRNA表達(dá)下降（P＜0.05，圖1），但第10天和15天時(shí)，IGF-I mRNA的表達(dá)基本恢復(fù)到對照組水平（圖1）。

2.2 急性和慢性低氧5 km對大鼠前額葉皮層IGF-II mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

急性低氧8 h對IGF-II mRNA表達(dá)沒有明顯影響（圖2），低氧24 h和5 d下調(diào)了 IGF-IImRNA的表達(dá)（P＜0.05，圖2），但第10天和15天時(shí)，IGF-II mRNA的表達(dá)基本恢復(fù)到對照組水平（圖 2）。

Fig.1 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGF-I mRNA expression in rats（ˉx±s，n＝6）IGF-I：Insulin-like growth factor I*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Fig.2 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGF-IImRNA expression in rats（ˉx±s，n＝6）IGF-II：Insulin-like growth factor II*P＜0.05 vs control

2.3 急性和慢性低氧5 km對大鼠前額葉皮層IGF-1R mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

急性低氧5 km 8 h時(shí)，大鼠前額葉皮層IGF-1R mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05，圖3）；但低氧24 h時(shí)，IGF-1RmRNA的表達(dá)顯著下降（P＜0.01，圖3）。慢性低氧5 d時(shí) IGF-1R mRNA的表達(dá)仍維持在低水平（P＜0.05，圖 3），10 d時(shí)，IGF-1R mRNA的表達(dá)量和對照組無明顯差異，慢性低氧15 d時(shí)其表達(dá)顯著升高（P＜0.01，圖 3）。

Fig.3 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGF-1R mRNA expression in rats（ˉx±s，n＝6）IGF-1R：Insulin-like growth factor 1 receptor*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

2.4 急性和慢性低氧5km對大鼠前額葉皮層IGFBP1 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

IGFBP1的基因表達(dá)在5 km急性低氧8 h時(shí)顯著升高（P＜0.05，圖4），急性低氧24 h和慢性低氧5 d時(shí)IGFBP1 mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01，圖4）。慢性低氧10 d和15 d時(shí)其基因表達(dá)恢復(fù)到對照組水平（圖4）。

Fig.4 Effects of acute（8 h，24 h）and chronic（5 d，10 d，15 d）hypoxia on prefrontal cortex IGFBP1 mRNA expression in rats（ˉx±s，n＝6）IGFBP1：Insulin-like growth factor binding protein 1*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

3 討論

急性低氧和慢性低氧均能引起機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)發(fā)生適應(yīng)性的改變［2］。IGFs家族能夠保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，參與低氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡。我們的結(jié)果顯示，急性低氧8 h刺激 IGF-I，IGF-1R，IGFBP1的基因表達(dá) mRNA的表達(dá)（除IGF-II），但在24 h的5 km抑制了IGF-I，IGF-1R，IGFBP1以及IGF-II的基因表達(dá)。這提示短時(shí)急性低氧刺激IGF-I mRNA的表達(dá)可能參與低氧神經(jīng)元損傷的保護(hù)過程，但24 h及5 d低氧抑制IGF-I mRNA的表達(dá)，這一結(jié)果提示較長時(shí)間低氧后，神經(jīng)細(xì)胞可能缺乏IGF-I的保護(hù)，開始出現(xiàn)損傷，可能是由于IGFBPs與IGF-I的結(jié)合導(dǎo)致局部組織處游離的IGF-I含量減少。

慢性連續(xù)低氧10 d和15 d，IGF-I，IGF-II和 IGFBP1表達(dá)都回復(fù)到對照水平。有文獻(xiàn)報(bào)道缺血缺氧性腦損傷發(fā)生后，IGFs家族在腦內(nèi)的表達(dá)增加，但不同成員表達(dá)的部位和時(shí)間不同。幼年大鼠缺血缺氧腦損傷后，神經(jīng)元中IGF-I mRNA表達(dá)快速下降，與之相伴的是急性期內(nèi)皮層神經(jīng)元的損傷。而在2～4 d后損傷部位的IGF-I表達(dá)開始增加，在損傷后5 d時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸回落，在大鼠頸動(dòng)脈結(jié)扎模型中海馬區(qū)IGF-1R的表達(dá)在損傷后6 h開始增加并維持至損傷后4 d。在缺血缺氧性腦損傷中IGF-I與IGF-1R結(jié)合，激活下游信號通路，抑制神經(jīng)元的凋亡，從而起到腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)作用；IGFBPs對IGF-I的神經(jīng)保護(hù)作用也起到了重要的調(diào)節(jié)作用。外源性IGF-I也可能對HIE起到神經(jīng)保護(hù)作用。成年大鼠右側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎后2 h側(cè)腦室注射IGF-I能夠在皮層，紋狀體，海馬等部位起到神經(jīng)保護(hù)作用［3］。

IGF-I和IGF-II在組織中通常以旁分泌和自分泌的形式發(fā)揮作用，IGF-I在幼鼠腦內(nèi)含量高于成年鼠，CNS發(fā)育早期IGF-I能夠促進(jìn)神經(jīng)元生長，樹突分枝形成以及突觸發(fā)生。CNS發(fā)育成熟階段，IGF-I能調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、分化以及凋亡，還促進(jìn)神經(jīng)纖維的修復(fù)與再生［4］。有報(bào)道稱IGF-I調(diào)節(jié)神經(jīng)元乙酰膽堿的釋放、突觸的可塑性、促進(jìn)增殖和抗凋亡。急性低氧和慢性低氧5 d時(shí)都引起IGF-IImRNA的下降，其機(jī)制尚不清楚。研究顯示IGF-II與IGF-2R有高親和力，與IGF-1R親和力較低，但I(xiàn)GF-1R同時(shí)也是IGF-II的受體，受體與配體的結(jié)合降低了細(xì)胞外IGF-II的水平，可能會(huì)抑制IGFII的功能。

IGF-1R是一種受體酪氨酸激酶，能激活MAPK和PI3K／Akt兩條信號通路。MAPK途徑主要參與細(xì)胞增殖，PI3K／Akt途徑則主要參與IGFs抗凋亡作用。IGF-1R mRNA表達(dá)在急性低氧8 h時(shí)也顯著上升，提示皮層神經(jīng)元上的IGF-1R能夠?qū)GF-I的刺激做出迅速反應(yīng)，使IGF-I迅速發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。在慢性低氧10 d和15 d時(shí)，其mRNA表達(dá)量仍然維持在較高水平上，這一結(jié)果提示IGF-1R可能參與慢性低氧損傷的保護(hù)。IGFBP1啟動(dòng)子區(qū)第-1090／-1086位上的低氧應(yīng)答因子（hypoxia response elements，HREs），是應(yīng)對低氧刺激和低氧誘導(dǎo)因子激活的必要條件，HIF-1能夠使IGFBP1的基因表達(dá)上調(diào)數(shù)倍［5］。研究發(fā)現(xiàn)低氧促進(jìn)IGFBP1發(fā)生磷酸化，磷酸化的IGFBP1與IGF-I的結(jié)合能力遠(yuǎn)大于IGF-I與IGF-1R的結(jié)合能力，因此磷酸化的IGFBP1延長了IGF-I的半衰期。

總之，IGFs家族在應(yīng)對急性低氧和慢性低氧引起的損傷均起到一定保護(hù)作用。IGFs家族參與腦皮層細(xì)胞的低氧損傷的保護(hù)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，慢性低氧上調(diào)的IGF-1R表達(dá)和受體信號通路可能是腦皮層細(xì)胞的低氧損傷的保護(hù)機(jī)制之一。

［1］ Chen XQ，Wang SJ，Du JZ，et al.Diversities in hepatic HIF-1，IGF-I／IGFBP-1，LDH／ICD，and their mRNA expressions induced by CoCl2 in Qinghai-Tibetan plateau mammals and sea level mice［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2007，292（1）：R516-526.

［2］ Chen XQ，Kong FP，Zhao Y，et al.High-altitude hypoxia induces disorder ofthe brain-endocrine-immune network through activation of corticotropin-releasing factor and its type-1 receptors［J］.Chin J Appl Physiol，2012，28（6）：482-487.

［3］ Guan J，Bennet L，Gluckman PD，et al.Insulin-like growth factor-1 and post-ischemic brain injury［J］.Prog Neurobiol，2003，70（6）：443-462.

［4］ Suh HS，Zhao ML，Derico L，et al.Insulin-like growth factor 1 and 2（IGF1，IGF2）expression in human microglia：differential regulation by inflammatory mediators［J］.J Neuroinflammation，2013，10（3）：10-37.

［5］ Kajimura S，Aida K，Duan C.Understanding hypoxia-induced gene expression in early development：in vitro and in vivo analysis of hypoxia-inducible factor 1-regulated zebra fish insulin-like growth factor binding protein 1 gene expression［J］.Mol Cell Biol，2006，26（3）：1142-1155.