缺血后處理對大鼠再灌注損傷肺細(xì)胞凋亡的影響*

石 璐，賈旭廣，羅 岷，劉亞坤，趙 珊，陳海娥，馬迎春，陳 丹，王萬鐵△

近年來，隨著心胸外科手術(shù)的廣泛開展，肺動脈袖狀切除、肺移植、心肺聯(lián)合移植、肺溶栓治療等新的醫(yī)療方法不斷建立和發(fā)展，但肺缺血／再灌注損傷（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）始終是影響溶栓及移植后預(yù)后的一個重要因素。但迄今為止，LIRI的發(fā)生機制尚未完全闡明，有研究證實肺缺血再灌注損傷誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡［1］。

缺血后處理（ischemic postconditioning，IPostC）即長時間缺血后再灌注前短時間內(nèi)反復(fù)短暫再缺血處理，可調(diào)動機體內(nèi)源性保護(hù)機制，明顯減輕缺血組織的缺血／再灌注損傷［2］。近年來有研究發(fā)現(xiàn) IPostC對肺組織具有保護(hù)作用［3］，但對這種保護(hù)作用的觀察主要集中在生化指標(biāo)的改變，而IPostC對LIRI時肺組織細(xì)胞凋亡影響的研究鮮有報導(dǎo)。本研究在大鼠LIRI模型上觀察IPostC對LIRI過程中細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因影響，并探討其作用機制，為臨床防治LIRI提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性成年SD大鼠24只，體重（220～250）g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供（許可號：2007-0005）。MDA、SOD、MPO試劑盒購自南京建成公司，Bcl-2、Bax鼠多克隆抗體購自美國santa cruz公司，In Situ Cell Death Detection Kit購自瑞士Roche公司，Trizol購自美國invitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國fermentas公司，PCR mix購自天根公司。PCR引物由上海捷瑞合成。Bcl-2引物序列：上游：5’-CTTCCAGCCTGAGAGCAACC-3’下游：5’-CATCCCAGCCTCCGTTATCC-3’；Bax引物序列：上游：5’-ATTGGAGATGAACTGGACAAT-3’下 游：5’-CCACAAAGATGGTCACTGTC-3’；β-actin引物序列：上游：5’-CCAGCCATGTACGTTGCTA TCCAG-3’下游：5’-GGAACCGCTCATTGCCAATGGTGA-3’。

1.2 動物模型的制備及分組

實驗大鼠隨機分為 3組（n＝8）：（1）對照組（control，C組）：左肺門游離后留置阻斷帶，觀察150 min；（2）肺缺血／再灌注組（lung ischemia reperfusion，I／R組）：阻斷左肺門30 min后開放再灌注120 min；（3）肺缺血／再灌注 ＋缺血后處理組（ischemic postconditioning，IPostC組）：阻斷左肺門30 min后給予連續(xù)的缺血30 s／再灌注30 s后處理循環(huán)3次后再灌注120 min。

1.3 血清指標(biāo)檢測

實驗完畢各組動物于頸動脈取血約2 ml，注入空白離心管中，于4℃3 000 r／min離心10 min后取上清即為血清。取各組大鼠血清按試劑盒說明書操作，檢測血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）活性及含量。

1.4 原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）測定肺組織細(xì)胞凋亡

每只大鼠取1張肺組織石蠟切片，脫蠟水化后蛋白酶 K（10μg／mg）37℃消化 20 min；加 TUNEL restion mixture 50微升／片，37℃反應(yīng) 60 min；加 Convert-POD 37℃反應(yīng) 30 min；3，3-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色；蘇木素復(fù)染。計算5個高倍視野（×400）下的凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）＝檢測到的凋亡細(xì)胞數(shù)÷5個高倍視野檢測到的細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.5 肺組織Bcl-2、Bax免疫組化分析

肺組織切片常規(guī)脫蠟，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶；復(fù)合消化液暴露抗原，封閉非特異性抗原后滴加1∶100稀釋的Ⅰ抗，37℃1 h，陰性對照為PBS替代I抗；滴加生物素化Ⅱ抗IgG，37℃20 min；滴加SABC，37℃20 min；DAB顯色3 min，然后蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。鏡檢：顯色呈棕黃色為陽性表達(dá)。應(yīng)用美國 IPP6.0（Image-pro plus）彩色圖像分析系統(tǒng)測定吸光度（optical density，OD）值。

1.6 RT-PCR測定肺組織Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)

用Trizol一步法提取肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA的過程參照試劑說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體積12.5μl：cDNA 2.5μl，上下游引物各 0.25μl，PCR mix 6.25μl，雙蒸水補足體系。反應(yīng)條件：94℃變性5 min，然后以94℃30 s，退火 Bcl-2為66℃ 45 s，Bax為55℃ 45 s，延伸72℃45 s，循環(huán)次數(shù)：Bcl-2為30次，Bax為 35次，最后 72℃ 7 min。PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離和溴化乙錠染色后，用凝膠成像及定量掃描儀測得。用gelpro analyze分析軟件分析電泳圖，用內(nèi)參β-actin的灰度值校正計算Bcl-2、Bax mRNA的相對含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

計量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）形式表示，采用 SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s t檢驗。雙變量相關(guān)性分析，采用Bivariate過程的Pearson相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 氧化-抗氧化系統(tǒng)檢測結(jié)果

與C組比較，I／R組血清SOD活性顯著降低；MDA含量和 MPO活力顯著升高（均 P＜0.01），IPostC組與 I／R組相比，MDA含量顯著降低（P＜0.05），MPO活力顯著降低（P＜0.01），SOD活性升高（P＜0.01，表 1）。

2.2 肺組織原位細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

肺組織原位細(xì)胞凋亡檢測示，I／R組凋亡指數(shù)（39.03±3.46）顯著高于 C組（2.88±0.34），IPostC組 AI（8.03±0.88）顯著低于 I／R組（均 P＜0.01）。凋亡細(xì)胞主要為肺泡上皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞（棕黃色凋亡細(xì)胞顆粒）（表2，圖1，見彩圖頁Ⅲ）。

Fig. 1 Apoptotic cells in lung tissue of each group（DAB ×400）C：Control group；I/R：Ischemia/ reperfusion group；IPostC：Ischemic postconditioning group

Tab.1 Changes of the content of MDA and the activity of MPO，SOD in serum of rat in different groups（ˉx±s，n＝8）

Tab.2 Comparision of apoptosis index in lung tissue of rats by TUNEL among groups（%，ˉx±s，n＝8）

2.3 肺組織Bcl-2、Bax免疫組化檢測結(jié)果

肺組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)呈棕黃色為陽性表達(dá)。在C組表達(dá)不明顯，I／R組表達(dá)較C組明顯上調(diào)，同時 Bcl-2／Bax的比值降低（均 P＜0.01，表 3）；與I／R組比較，IPostC組 Bcl-2蛋白表達(dá)增強（P＜0.05），Bax表達(dá)明顯減弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均P＜0.01，圖 2、圖 3，見彩圖頁Ⅲ）。

Fig. 2 Positive expression of Bcl-2 protein in lung tissue of each group（DAB ×400）C：Control group；I/R：Ischemia/ reperfusion group ；IPostC：Ischemic postconditioning group

Fig. 3 Expression of Bax protein in lung tissue of each group（DAB ×400）C：Control group；I/R：Ischemia/ reperfusion group ；IPostC：Ischemic postconditioning group

Tab.3 Optical density of Bcl-2、Bax of lung tissues in different groups and ratio of Bcl-2／Bax protein（ˉx±s，n＝8）

2.4 肺組織Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá)

在C組表達(dá)不明顯，I／R組表達(dá)較C組明顯上調(diào)，同時 Bcl-2／Bax的比值降低（均 P＜0.05，表 4）；與I／R組比較，IPostC組 Bcl-2 mRNA表達(dá)增強，Bax mRNA表達(dá)減弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均 P＜0.05，圖 4、圖 5）。

Tab.4 Reletive amout of Bcl-2、Bax mRNA and ratio of Bcl-2／Bax mRNA in lung tissue in 3 groups（ˉx±s，n＝8）

Fig.4 RT-PCR electrophoresis strip of Bcl-2 in lung tissue of each group1、4：Control group；2、5：LIR group；3、6：LIR＋ IPostC group；M：Marker；LIR：Lung ischemic reperfusion；IpostC：Ischemic postconditioning

Fig.5 RT-PCR electrophoresis strip of Bax in lung tissue of each group1、4：Control group；2、5：LIR group；3、6：LIR＋ IPostC group；M：Marker；LIR：Lung ischemic reperfusion；IpostC：Ischemic postconditioning

2.5 相關(guān)性分析

肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)AI與MDA、MPO呈顯著正相關(guān)（P＜0.01）；凋亡指數(shù)與 SOD、Bcl-2／Bax蛋白比值、Bcl-2／BaxmRNA比值均呈顯著負(fù)相關(guān)（均 P＜0.01）。

3 討論

肺缺血／再灌注損傷可在多種臨床情況下發(fā)生，包括心肺轉(zhuǎn)流、肺栓塞及肺移植等。介導(dǎo)LIRI的病理生理機制較復(fù)雜，目前認(rèn)為主要與白細(xì)胞活化、炎癥介質(zhì)的釋放、氧自由基的產(chǎn)生等有關(guān)，從而導(dǎo)致肺泡-毛細(xì)血管屏障滲透性增高、中性粒細(xì)胞滲出、間質(zhì)與肺泡水腫、組織炎癥與細(xì)胞損傷等一系列病理變化，最終引起肺組織細(xì)胞的壞死或凋亡。Fischer等學(xué)者［4］發(fā)現(xiàn)，缺血／再灌損傷能促進(jìn)供肺移植后再灌早期肺組織細(xì)胞的凋亡，過度的凋亡以導(dǎo)致肺功能的受損。本實驗TUNEL法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組偶見細(xì)胞凋亡；I／R組細(xì)胞凋亡較對照組明顯增加，凋亡細(xì)胞主要為肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞；相關(guān)分析結(jié)果表明肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)與MDA、MPO呈顯著正相關(guān)，與SOD呈顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)果說明了細(xì)胞凋亡可能是LIRI的機制之一，而氧自由基的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞的聚集等多種因素參與誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡又被稱為程序化細(xì)胞死亡，是細(xì)胞接受某種信號后或受到某些因素剌激后的一種主動的，由一些凋亡相關(guān)基因相互作用的細(xì)胞死亡過程。Bcl-2家族蛋白是在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用的一類蛋白質(zhì)［5］。Bcl-2是重要的抗細(xì)胞凋亡基因，在I／R損傷中表現(xiàn)得尤為突出。Bax基因與Bcl-2基因具有高度同源的序列，但其作用與Bcl-2基因相反，屬于促凋亡基因。Bcl-2高表達(dá)時，可形成 Bcl-2／Bcl-2同源二聚體，也可形成Bcl-2／Bax異源二聚體，均起抑制凋亡作用［6］。近年來也有研究表明Bcl-2／Bax異源二聚體有助于減輕肺組織凋亡，減輕肺損傷［7］。本研究采用免疫組織化學(xué)與 RT-PCR的方法，觀察到缺血／再灌注后肺組織Bcl-2、Bax表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2／Bax下降；且肺組織細(xì)胞AI與Bax呈正相關(guān)，而與Bcl-2／Bax比值呈負(fù)相關(guān)，提示 Bcl-2、Bax基因參與LIRI，而且再灌注后Bcl-2／Bax的比例下降是促進(jìn)凋亡的重要因素。

缺血后處理作為機體一種潛在性的、內(nèi)源性的保護(hù)措施，已經(jīng)在心［8］、腦［9］、腎［10］等組織缺血實驗中得以證實，它能使組織增加自身對缺血／再灌損傷的耐性。目前有實驗亦證實，IPostC能減輕肺組織缺血／再灌損傷［3，4］，但對肺組織細(xì)胞凋亡的影響還未見報道。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IPostC組細(xì)胞凋亡較I／R組明顯減輕；SOD活性明顯升高，MDA含量、MPO活力明顯下降；Bax蛋白和Bax mRNA表達(dá)顯著下調(diào)；Bcl-2蛋白和Bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)；Bcl-2／Bax的比值明顯升高。而且AI與Bax呈正相關(guān)，與Bcl-2／Bax比值呈負(fù)相關(guān)，提示IPostC可能是通過減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減少中性粒細(xì)胞的聚集，下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，提高Bcl-2／Bax比值來抑制細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)再灌注損傷肺組織的。

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