缺血后處理對(duì)缺血／再灌注大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-2表達(dá)的影響*

盧彥珍，王 佳，宋 娟，張翠英，冀菁荃，李寶紅，田小霞，宋曉亮

近些年來(lái)，隨著冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)等冠脈再通術(shù)的迅速開(kāi)展，緩解了缺血性心血管疾病，卻帶來(lái)了副作用即再灌注性損傷，它不但損傷心肌本身，還損傷了心肌間質(zhì)。心肌間質(zhì)構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜、廣泛的膠原網(wǎng)絡(luò)，將心肌細(xì)胞連接在一起，使單個(gè)心肌細(xì)胞和肌束的機(jī)械收縮偶連在一起，從而協(xié)調(diào)心肌的收縮和舒張。膠原的破壞必將影響心肌功能?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是結(jié)構(gòu)上與鋅相關(guān)的肽鏈內(nèi)切酶家族，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要生理性調(diào)節(jié)物質(zhì)，在基質(zhì)成分合成和降解的過(guò)程中起著重要的作用。有研究報(bào)道［1］，心肌MMPs于心肌缺血早期即被激活，通過(guò)對(duì)心肌膠原的分解代謝，參與心肌缺血／再灌注損傷過(guò)程。大量研究表明缺血后處理（ischemic postconditioning，IPTC）具有明顯縮小心肌梗塞面積、抗再灌注心律失常、改善心功能等與缺血預(yù)處理（ischemic postconditioning，IPC）相似的抗心肌缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）損傷保護(hù)作用［2，3］，但目前的研究基本上集中在對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)上，我們前期的研究顯示［4］，IPTC對(duì)心肌間質(zhì)有保護(hù)，但對(duì)MMPs有何影響未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討IPTC對(duì)I／R大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-2的影響，并觀察其與心肌間質(zhì)和心功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 瓊脂糖購(gòu)自 Promega公司，羊抗鼠MMP-2多克隆抗體、鼠抗小鼠β-actin單克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗IgG購(gòu)自Santa Cruz公司，RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.1.2 動(dòng)物分組和模型制備 雄性SD大鼠24只，體重（250±30）g，用 20%的烏拉坦（1g／kg ip）麻醉后隨機(jī)分為 3組（n＝8）：⑴缺血／再灌注（I／R）組，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支20 min，解除結(jié)扎灌注40 min；⑵假手術(shù)對(duì)照（sham control，SC）組；右冠狀動(dòng)脈前降支僅穿線不結(jié)扎。⑶缺血后處理（IPTC）組，按Zhao［5］等的方法復(fù)制缺血后處理動(dòng)物模型，即缺血畢，再灌注30 s、缺血30 s，連續(xù)3個(gè)循環(huán)，然后再灌注40 min結(jié)束實(shí)驗(yàn)。復(fù)制模型的可靠性用連續(xù)監(jiān)視心電圖Ⅱ?qū)?lián)的變化來(lái)判斷，結(jié)扎后心電圖ST段抬高，解除結(jié)扎血管復(fù)通后ST段下降1／2以上為模型成功。

1.2 方法

1.2.1 左室功能測(cè)定 從右頸總動(dòng)脈插入 PE-50軟質(zhì)塑料導(dǎo)管至左心室，接壓力傳感器，經(jīng)生理儀輸出左心室壓力（left ventricular pressure，LVP）信號(hào)，接計(jì)算機(jī)程序處理后，記錄各組缺血前和再灌注40 min左心室峰壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室內(nèi)壓上升及下降最大速率（the maximum rate of left ventricular pressure rise and fall，±dp／dt max）及Ⅱ?qū)碾妶D。

1.2.2 心肌中膠原含量測(cè)定 按文獻(xiàn)方法［6］稱取凍存左室心肌約100 mg，脫水、脫脂、烘干、稱重，加入 6 mol／L HCl 3 ml，105℃烘箱烤 16 h。冷卻后調(diào)pH為 6，加去離子水至 10 ml，以 3 500×g，10 min離心，取2 ml上清液做檢測(cè)。按要求配制標(biāo)準(zhǔn)管和空白管，用 Beckman紫外分光光度計(jì)，波長(zhǎng)550 nm，1 cm光徑，水調(diào)零，測(cè)各管A值，計(jì)算出羥脯氨酸含量。由于羥脯氨酸在膠原中占13.4%，心肌膠原含量（mg／g干重心?。搅u脯氨酸含量 ×7.46。

1.2.3 血漿MDA含量及SOD活性測(cè)定 各組于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分別從左頸總動(dòng)脈取血2 ml，以2 000×g，10 min離心分離血漿，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。

1.2.4 Western blot免疫印跡檢測(cè)各組心肌 MMP-2蛋白的表達(dá)變化 取液氮凍存心肌勻漿、離心，取上清得MMP-2提取液，用Bradford法蛋白定量，每泳道取20μg蛋白于8%SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。加入多克隆羊抗鼠MMP-2的抗體 IgG（終濃度為 mg／L），37℃孵育 2 h，洗滌后，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的MMP-2兔抗山羊單克隆 IgG（1∶1 000稀釋），37℃孵育 2 h，洗滌后，按試劑盒說(shuō)明染色后拍照分析。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)MMP-2mRNA在心肌的表達(dá) 采用Trizol一步法提取心肌組織總RNA，用紫外分光光度儀行RNA定量檢測(cè)。MMP-2及內(nèi)參照β-actin引物參照基因庫(kù)基因序列設(shè)計(jì)。引物序列MMP-2（327 bp）上游引物5＇-CACCTATACCAAGAACTTCC-3＇，下 游 引 物 5＇-AACACAGCCTTCTCCTCCTG-3＇；β-actin（233 bp）上游引物5＇-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3＇，下 游 引 物 5＇-GCACCGTGTTGGCGTAGAGG-3＇。取 2μg總 RNA行RT-PCR，94℃變性 40 s，54℃ 退火 1 min，72℃延伸1.5 min，經(jīng)35個(gè)循環(huán)。取10μl RT-PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，利用Quantity One凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描，計(jì)算MMP-2 mRNA相對(duì)于內(nèi)參β-actin的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，用SPSS14.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 IPTC對(duì)心肌I／R損傷時(shí)心臟動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

心臟動(dòng)力學(xué)參數(shù)是代表心臟功能的重要指標(biāo)。I／R組左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室內(nèi)壓最大上升速率（maximum rate of intraventricular pressure rise，±dp／dt max）低于假手術(shù)組，兩者相比有顯著差異（P＜0.01），說(shuō)明 I／R組心臟功能明顯受損；IPTC組三項(xiàng)指標(biāo)明顯高于I／R組（P＜0.05，P＜0.01，表 1），表明 IPTC組心臟功能明顯改善。

Tab.1 Effects of IPTC on dynamic parameters of rat heart in three groups（ˉx±s，n＝8）

2.2 大鼠心肌膠原含量和血漿MDA含量、SOD活性的變化

I／R組心肌膠原含量明顯減少，血漿MDA含量增高，SOD活性降低，與SC組比較差異有顯著性（P＜0.05，P＜0.01）。而與 I／R組相比，IPTC組心肌膠原含量明顯升高，血漿MDA含量降低而SOD活性增強(qiáng)（P＜0.05，P＜0.01，表 2）。

Tab.2 Changes of myocardial collagen fibers and MDA、SOD of plasma among three groups

2.3 Western blot、RT-PCR測(cè)定 MMP-2表達(dá)結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，缺血20 min再灌注40 min后，心肌組織中 MMP-2（3.6±0.98）表達(dá)較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），IPTC組 MMP-2（2.3±0.71）的表達(dá)顯著降低（P＜0.01，圖 1）。RT-PCR法檢測(cè)MMP-2 mRNA表達(dá)，SC組有少量MMP-2 mRNA表達(dá)（0.25±0.08），I／R組心肌表達(dá)明顯增多（0.89±0.06），而 IPTC組表達(dá)明顯低于 I／R組（0.53±0.09）（P＜0.01，圖 2、圖 3）。

Fig.1 Expression of MMP-2 proteinSC：Sham control：I／R：Ischemic／reperfusion；IPTC：Ischemic postconditioning；MMP-2：Matris matris metalloproteinase-2

Fig.2 RT-PCR of MMP-2 in SC group，I／R group and IPTC groupSC：Sham control：I／R：Ischemic／reperfusion；IPTC：Ischemic postconditioning；MMP-2：Matris matris metalloproteinase-2

Fig.3 RT-PCR of MMP-2 mRNA of SC group，I／R group and IPTCgroupMMP-2：Myocardium matris metalloproteinase-2；SC：Sham control；I／R：Ischemic／preperfusion；IPTC：Ischemic postcnditioning**P＜0.01 vs SCgroup；＃＃P＜0.01 vs I／R group

3 討論

隨著心血管疾病，特別是缺血性心臟病發(fā)病率的升高，缺血性心臟病已成為嚴(yán)重危害人類健康的心血管流行病。盡快開(kāi)通閉塞的冠狀動(dòng)脈，有效恢復(fù)缺血心肌的血液灌注，是減少缺血心肌細(xì)胞損傷和恢復(fù)心肌收縮功能的根本措施，也是限制和縮小梗死面積、改善預(yù)后的關(guān)鍵所在。但隨著急性心肌梗死的溶栓以及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)等有效恢復(fù)缺血心肌血液供應(yīng)的治療技術(shù)的興起，大量基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，缺血心肌的再灌注本身也會(huì)誘發(fā)一系列新的病理生理變化，進(jìn)一步加重心肌細(xì)胞損傷，出現(xiàn)再灌注心律失常、心肌舒縮功能障礙、代謝異常以及心肌超微結(jié)構(gòu)改變等，即發(fā)生心肌的缺血／再灌注損傷，直接影響病人的預(yù)后。因此，如何減輕缺血／再灌注損傷、最大限度保護(hù)缺血心肌、是有效治療缺血性心臟病的關(guān)鍵。

由Zhao等［5］于 2003年首先提出的 IPTC，具有明顯縮小心肌梗塞面積、抗再灌注心律失常、改善心功能等與IPC相似的抗缺血／再灌注損傷作用［2］，且由于其可控性好，操作方便引起廣大心血管病學(xué)者的興趣，但目前的研究基本上集中在對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)上。心肌是由心肌細(xì)胞和心肌胞外間質(zhì)成分（extracellular，ECM）構(gòu)成，ECM是維護(hù)心臟結(jié)構(gòu)和功能完整性不可缺少的重要組成部分［7］，對(duì)心肌細(xì)胞起支持、保護(hù)、營(yíng)養(yǎng)、潤(rùn)滑和制約作用，心肌間質(zhì)的損傷必將導(dǎo)致心臟形態(tài)改變和功能障礙。

心肌間質(zhì)主要由膠原纖維及糖蛋白組成，膠原中I型膠原占80%～85%，Ⅲ型占11%，其余是少量的Ⅳ、V、Ⅵ膠原。這些膠原在心肌細(xì)胞間組成精細(xì)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其主要功能有：（1）包繞在心肌細(xì)胞周圍，為心肌細(xì)胞提供支撐網(wǎng)架，并在心肌細(xì)胞和毛細(xì)血管之間起連接作用；（2）形成心室的骨架組織，協(xié)調(diào)心肌收縮所產(chǎn)生張力的傳導(dǎo)；（3）膠原纖維自身與心肌纖維呈現(xiàn)一定的排列方向，有利于防止心肌細(xì)胞錯(cuò)位，重排及肌節(jié)過(guò)度伸展，維持心室的幾何形狀；（4）膠原纖維還可在心肌收縮期貯存能量，有利于心室舒張期充盈的伸展。已有研究表明，心肌缺血／再灌注后，雖然沒(méi)有心肌細(xì)胞的壞死，血液供應(yīng)也得到了恢復(fù)，但心肌舒縮功能尚不能及時(shí)恢復(fù)，其原因可能與心肌間質(zhì)的損傷、降解有關(guān)。Zhao等［8］用掃描和透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn) I／R后心肌的膠原支架稀疏，不連續(xù)或缺失，包繞心肌細(xì)胞束的膠原網(wǎng)松散或缺失。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一組能特異地降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的鋅（Zn2＋）依賴的酶家族，主要分為膠原酶、明膠酶、基質(zhì)溶解素及膜型MMPs等幾類，其主要功能是參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，可降解除多糖以外的所有ECM。最近大量動(dòng)物及臨床研究發(fā)現(xiàn)MMPs的表達(dá)及活性增強(qiáng)與心肌缺血／再灌注損傷有著密切的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I／R組心肌MMP-2蛋白活性和MMP-2 mRNA的表達(dá)均明顯升高，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。同時(shí)，心肌羥脯氨酸含量明顯降低，表明心肌缺血／再灌注后膠原降解。在心肌膠原含量明顯減少時(shí)，心功能三項(xiàng)指標(biāo)LVSP、±dp／dt max明顯低于假手術(shù)組（P＜0.01），表明MMP-2的釋放和活性的增加與心肌間質(zhì)的破壞和心功能損害有明顯的相關(guān)性。與I／R組比較，IPTC組MMP-2活性和MMP-2 mRNA的表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），在 MMP-2降低的同時(shí)，心肌膠原含量增加，反映心臟收縮功能的LVSP、＋dp／dt max及反映心臟舒張功能的-dp／dt max明顯改善（P＜0.05，P＜0.01），提示 ITPC具有抑制MMP-2的表達(dá)和活性的作用，且對(duì)心肌的保護(hù)作用之一可能是通過(guò)抑制MMP-2的活性和表達(dá)，減輕了心肌間質(zhì)的損傷實(shí)現(xiàn)的。

IPTC抑制I／R心肌MMP-2的活性和表達(dá)增加的機(jī)制尚不清楚。有研究表明心臟在缺血／再灌注后產(chǎn)生大量氧自由基，氧自由基可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶原的構(gòu)象改變，使其暴露催化部位而激活［10］。我們發(fā)現(xiàn)I／R組MMP-2的活性和MMP-2 mRNA表達(dá)增加的同時(shí)，血漿中的SOD也明顯降低而MDA明顯升高，提示缺血／再灌注過(guò)程中體內(nèi)氧自由基增加或清除能力不足必將導(dǎo)致心肌基質(zhì)金屬蛋白酶激活，使心肌膠原降解和破壞。而IPTC的心肌保護(hù)作用可能在于增加了SOD的活性，增強(qiáng)了機(jī)體的抗氧化能力，穩(wěn)定了基質(zhì)金屬蛋白酶，從而減少心肌間質(zhì)膠原的降解而保護(hù)了心臟功能。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示：（1）MMP-2的表達(dá)及活性增強(qiáng)是心肌缺血再灌注心肌間質(zhì)損傷的機(jī)制之一。（2）IPTC對(duì)心肌的保護(hù)作用之一可能是通過(guò)減少自由基產(chǎn)生，抑制MMP-2的活性和表達(dá)，減輕了心肌間質(zhì)的損傷而實(shí)現(xiàn)的。

［1］ Lalu MM，Pasini E，Schulze CJ，et al.Ischemia-reperfusion injury activates matrix metalloproteinases in the human heart［J］.Eur Heart J，2005，26（1）：27～35.

［2］ Zhao ZQ，Vinten-Johansen J.Postconditioning：reduction of reperfusion-induced injury［J］.Cardiovase Res，2006，70（2）：200～211.

［3］ 王 玨，高 琴，孫國(guó)銓，等.δ-阿片受體在缺血后處理心肌保護(hù)中的作用［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008，24（2）：184～189.

［4］ 盧彥珍，張翠英，王 佳，等.缺血后處理對(duì)缺血再灌注大鼠心肌間質(zhì)的保護(hù)作用［J］.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，25（3）：164～167.

［5］ Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion：comparision with ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285（2）：H579～588.

［6］ 田振軍.過(guò)度訓(xùn)練對(duì)心肌間質(zhì)膠原、心肌舒縮性能和AngⅡ變化的研究［J］.中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志，2002，18（1）：63～67.

［7］ Chiariello M，Ambrosio G，Cappelli-Bigazzi M，et al.A biochemical method for the quantitation of myocardial scarring after experimental coronary artery occlusion［J］.J Mol Cell Cardiol，1986，18（3）：283～290.

［8］ Zhao MJ，Zhang H，Robinson TF，et al.Profound structural alterations of the extracellular collagen matrix in postischemic dysfunctional（“stunned”）but viable myocardium［J］.J Am Coll Cardiol，1987，10（6）：1322～1334.

［9］ Sung MM，Schulz CG，Wang W，et al.Matrix metalloproteinase-2 degrades the cytoskeletal protein alpha-actinin in peroxynitrite mediated myocardial injury［J］.JMol Cell Cardiol，2007，43（4）：429～436.

［10］ Turer AT，Hill JA.Pathogenesis of myocardial ischemiareperfusion injury and rationale for therapy［J］.Am J Cardiol，2010，106（3）：360～368.