代謝組學(xué)法評(píng)價(jià)紫蘇子抗小鼠急性肝損傷的作用

耿 芹，鄭床木，管 政,3,*，張小紅，朱 超，楊曙明，陳愛亮,*

代謝組學(xué)法評(píng)價(jià)紫蘇子抗小鼠急性肝損傷的作用

耿 芹1，鄭床木2，管 政2,3,*，張小紅2，朱 超2，楊曙明2，陳愛亮2,*

（1.華爍科技股份有限公司，湖北 武漢 430074；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京 100081；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥物研究所，浙江 杭州 310053）

用代謝組學(xué)法對(duì)紫蘇子抗小鼠急性肝損傷作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。研究構(gòu)建四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷模型，采用流動(dòng)注射-三重四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)模型組、紫蘇子給藥組、陽性藥聯(lián)苯雙酯給藥組及正常對(duì)照組動(dòng)物的肝組織及全血代謝輪廓譜進(jìn)行比較。采用主成分分析法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并初步篩選潛在生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)分析、血生化指標(biāo)檢測(cè)及病理研究表明，20 g/kg生藥當(dāng)量的紫蘇子醇提物對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷模型具有與聯(lián)苯雙酯臨床等效劑量相似的保肝作用。結(jié)果表明，檸檬酸、磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺等9 個(gè)代謝物為CCl4致小鼠急性肝損傷及紫蘇子保肝作用的潛在生物標(biāo)志物；作用途徑與脂質(zhì)過氧化、能量代謝等有關(guān)。

紫蘇子；流動(dòng)注射；質(zhì)譜；急性肝損傷；代謝組學(xué)；主成分分析

紫蘇子為唇形科植物紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.）的干燥成熟果實(shí)。常用于痰壅氣逆，咳嗽氣喘，腸燥便秘的治療[1]。作為一種在東南亞、北美等地區(qū)廣泛種植使用的藥食兩用作物[2]，紫蘇具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值與開發(fā)潛力?，F(xiàn)代藥理研究表明，紫蘇子除具有以上功效外，其酚性成分還具有強(qiáng)抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化、抗炎作用及基于此對(duì)肝損傷的保護(hù)作用[3-5]。

代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics）是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門通過對(duì)某一生物或細(xì)胞中特定生理時(shí)期內(nèi)所有低分子量代謝物的集合進(jìn)行定性、定量分析，并尋找代謝物與生理病理變化相對(duì)關(guān)系的學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分[6-7]。近年來，在國內(nèi)先驅(qū)者將代謝組學(xué)引入中醫(yī)藥領(lǐng)域之后，中醫(yī)藥代謝組學(xué)研究得到了蓬勃的發(fā)展，為中藥整體藥效學(xué)評(píng)價(jià)和中醫(yī)藥作用機(jī)制及其理論研究提供了強(qiáng)有力的現(xiàn)代化研究手段[8-10]。同時(shí)，隨著食品組學(xué)概念[11-12]的提出及其在西方各國的悄然興起，采用代謝組學(xué)法對(duì)具有藥食兩用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物展開研究已成為我國農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)一步占據(jù)功能食品國際市場(chǎng)的需要。

流動(dòng)注射-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為一種具有高通量分析能力的方法，雖然會(huì)帶來一定的基質(zhì)效應(yīng)等問題，但隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)及質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，近年來的方法學(xué)比較研究表明流動(dòng)注射-電噴霧質(zhì)譜指紋譜在分析中的應(yīng)用具有和液質(zhì)聯(lián)用[13-15]、氣質(zhì)聯(lián)用[16-20]以及核磁共振指紋圖譜技術(shù)[21-22]相當(dāng)?shù)男畔⒘亢头治鰞r(jià)值。這進(jìn)一步使得該種具有快速分析能力的技術(shù)在需要大樣本、大數(shù)據(jù)量采集分析的代謝組學(xué)、臨床檢測(cè)及相關(guān)藥效、毒理及機(jī)制研究中有了發(fā)揮的空間[23-24]。

據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)采用了基于流動(dòng)注射-三重四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）的代謝組學(xué)法與傳統(tǒng)藥理病理學(xué)指標(biāo)比對(duì)，對(duì)紫蘇子抗四氯化碳（CCl4）致小鼠急性肝損傷作用進(jìn)行分析，尋找與紫蘇子保肝作用密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，以探討其藥效及可能的作用機(jī)制，為進(jìn)一步利用代謝組學(xué)進(jìn)行相關(guān)藥效學(xué)研究及紫蘇子作為功能食品的保健價(jià)值提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)昆明小鼠，雄性，體質(zhì)量（35±3）g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，許可證號(hào)：SCXK（京）2011-0012。

紫蘇子（標(biāo)本號(hào)：20111017-LB），購自河北安國冷背藥材有限公司，經(jīng)陳愛亮副研究 員鑒定。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測(cè)試盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）測(cè)試盒南京建成生物工程研究所；聯(lián)苯雙酯滴丸 北京協(xié)和藥廠；甲醇、甲酸（色譜純） 美國Fisher 公司；Milli-Q超純水 美國Millipore公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀美國Agilent公司；AB MDS SCIEX QSTAR?Elite質(zhì)譜儀美國AB SCIEX公司；BX-61萬能顯微鏡 日本Olympus公司；Infinite F200多功能酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；AL104電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；全能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；LYOVAC GT2型冷凍干燥機(jī) 德國SRK公司。

1.3 方法

1.3.1 紫蘇子醇提物制備方法

取紫蘇子藥材1 kg，加3 倍量80%甲醇冷浸提取3 次，每次24 h，合并提取液，減壓回收，得浸膏，冷凍干燥，得粉末。

1.3.2 模型建立

小鼠常規(guī)飼養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、CCl4急性肝損傷模型組、病理模型紫蘇子醇提物給藥組及病理模型聯(lián)苯雙酯給藥組，每組8 只。除正常對(duì)照組外，其他每組小鼠按20 mL/kg體質(zhì)量腹腔注射0.1%（V/V）的CCl4花生油造模[25-26]；造模同時(shí)灌胃給藥，紫蘇子醇提物給藥劑量按生藥材計(jì)為20 g/（kg·d）；聯(lián)苯雙酯組每天給藥3.5 mg/（kg·d）；正常對(duì)照組及模型組則灌胃等容量的生理鹽水。造模后，連續(xù)給藥治療3 d，于第3天給藥后3 h采集樣本。

1.3.3 急性肝損傷藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

各組動(dòng)物于末次給藥3 h摘眼球取血。部分血液樣本4 ℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min取血清，供ALT、AST檢測(cè)用（樣本處理及檢測(cè)方法按說明書操作）。取部分肝臟置于37 g/100 mL的中性甲醛溶液（福爾馬林）中，石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.3.4 質(zhì)譜樣品采集與預(yù)處理

肝組織樣品0.5 g，按1∶2（m/V）加入生理鹽水做組織勻漿。組織勻漿液及血液樣本（0.8 mL）分別按1∶1（V/V）加入0.1 mol/L的HCl溶液中使藥物蛋白質(zhì)解離，12 000 r/min離心5 min，繼續(xù)加入3 倍量甲醇沉淀蛋白質(zhì)，12 000 r/min離心10 min。吸取上清，37 ℃氮吹至干。加入1 mL 5%甲醇（含0.1%（V/V）甲酸）渦旋復(fù)溶，過Waters公司Oasis系列HLB小柱，自然流速上樣、洗脫，洗脫液為80%甲醇（含0.1%甲酸，過0.22 μm濾膜）。

1.3.5 色譜條件

兩通連接，流動(dòng)相甲醇，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，數(shù)據(jù)采集時(shí)間1 min，流動(dòng)注射、直接進(jìn)樣供質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及PCA。

1.3.6 質(zhì)譜條件

電噴霧離子化源（ESI），正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)。掃描方式為全掃描，飛行時(shí)間質(zhì)譜離子掃描范圍m/z 100～1 000。噴霧電壓4.2 kV，去簇電壓60 V，去簇電壓2為10 V，調(diào)焦電壓265 V。碰撞氣及霧化氣均為氮?dú)?，碰撞?5 V。其余參數(shù)：霧化氣60 psi；輔助氣50 psi；氣簾氣20 psi；碰撞氣5 psi；溫度500 ℃。兩通連接、流動(dòng)注射直接進(jìn)樣。

1.4 數(shù)據(jù)處理

藥理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s值表示，做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較。質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Analyst QS 2.0軟件采集、m/z識(shí)別，離子峰相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行內(nèi)標(biāo)校正，將穩(wěn)定出現(xiàn)的、質(zhì)譜豐度0.5%以上的離子數(shù)據(jù)導(dǎo)入至Excel軟件，手動(dòng)對(duì)齊各組數(shù)據(jù)。將各組數(shù)據(jù)分別與模型組數(shù)據(jù)做獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異比較，剔除沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量（P＞0.05）后，得到有意義的變量值76 個(gè)（血液及肝組織樣本共有），導(dǎo)入統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件IBM SPSS Statistics 19的因子分析項(xiàng)中做PCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性肝損傷藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

圖1 小鼠肝臟組織病理形態(tài)改變（HE染色）Fig.1 Histopathological changes in livers of mice (HE staining)

如圖1所示，組織病理學(xué)檢查結(jié)果表明，正常對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無肝細(xì)胞壞死；CCl4急性肝損傷模型組的肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝小葉排列紊亂，可見肝細(xì)胞變性及大面積灶狀壞死；紫蘇子醇提物給藥組及聯(lián)苯雙酯給藥組的肝細(xì)胞索排列較整齊，胞漿染色與正常對(duì)照組接近，脂肪空泡減少，嗜伊紅染顆粒及肝細(xì)胞灶狀壞死面積減少。

如表1所示，生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，紫蘇子醇提物對(duì)CCl4所致急性肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶升高有明顯降低作用。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定給藥劑量下，其對(duì)血清轉(zhuǎn)氨酶的降低作用與聯(lián)苯雙酯臨床等效劑量相似，與模型組相比有極顯著差異。

表1 紫蘇子醇提物對(duì)CCl 急性肝損傷小鼠肝生化指標(biāo)的影響 x±s, , n＝8）Table 1 Effects of perilla seed extract on hepatic biochemical parameters in mice ( x±s, , n＝8)

2.2 小鼠代謝指紋質(zhì)譜

小鼠代謝指紋質(zhì)譜全掃描情況見圖2。得到有意義的變量值76 個(gè)（為血液及肝組織樣本共有，圖2只給出血液樣本指紋質(zhì)譜圖）做PCA。

圖2 小鼠血樣代謝指紋質(zhì)譜圖（負(fù)離子模式）Fig.2 MS metabolic fingerprinting of mouse blood samples (negative ion mode)

2.3 全血及肝臟樣本質(zhì)譜數(shù)據(jù)代謝組學(xué)分析

圖3 小鼠血液及肝臟樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)得分圖（負(fù)離子模式）Fig.3 PCA score plot based on the MS metabolic profiling of mouse blood and liver samples (negative ion mode)

如圖3所示，將質(zhì)譜數(shù)據(jù)做PCA，正常對(duì)照組、模型組、紫蘇子醇提物給藥組、聯(lián)苯雙酯給藥組血液及肝臟組織的樣本點(diǎn)均得到了較好分離，結(jié)果與病理切片及生化指標(biāo)可相互佐證，說明小鼠灌胃給藥后機(jī)體生理及物質(zhì)代謝情況已經(jīng)發(fā)生明顯改變，可對(duì)各組樣品進(jìn)行區(qū)分。

2.4 潛在生物標(biāo)志物鑒別

圖4 小鼠血液及肝臟樣品質(zhì) 譜數(shù)據(jù)共有變量PCA載荷圖Fig.4 PCA loading plot for IT-MS fingerprints of blood and liver samples of mice

PCA載荷圖能體現(xiàn)變量對(duì)于主成分貢獻(xiàn)的大小，在某一主成分方向上距原點(diǎn)越遠(yuǎn)的變量對(duì)此主成分的貢獻(xiàn)越大。離質(zhì)心越遠(yuǎn)的數(shù)據(jù)點(diǎn)，即“離群”數(shù)據(jù)點(diǎn)則?？勺鳛橄鄳?yīng)分析的標(biāo)志性變量。選取PCA載荷圖（圖4）中既“離群”又離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的數(shù)據(jù)點(diǎn)作為可能的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析。潛在生物標(biāo)志物鑒別，則依據(jù)各離子的一級(jí)及二級(jí)質(zhì)譜的精確質(zhì)荷比值，到METLIN、KEGG、HMDB、MASSBANK、CHEMSPIDER、METFRAG數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，推斷可能的結(jié)構(gòu)及潛在生物標(biāo)志物。鑒定結(jié)果見表2，組間變化情況見圖5。

表2 潛在生物標(biāo)志物鑒定Table 2 Identification of potential biomarkers

圖5 與小鼠急性肝損傷相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物及其相對(duì)含量變化趨勢(shì)Fig.5 Variations in potential biomarkers associated with acute liver injury syndromes

3 討 論

CCl4對(duì)動(dòng)物體的毒性作用，主要由具有強(qiáng)氧化性的三氯甲基自由基引起。經(jīng)過肝臟代謝后，它所生成的自由基會(huì)與微粒體脂肪及其他的細(xì)胞巨分子結(jié)合，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞能量傳送系統(tǒng)、蛋白合成途徑及核脂質(zhì)、核蛋白、DNA等的破壞[27-28]。在本實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物經(jīng)CCl4處理后，肝組織及血液樣本中檸檬酸含量上升，給予紫蘇子醇提物后含量回落，接近正常對(duì)照組，表明紫蘇子醇提物可通過改善三羧酸循環(huán)的代謝情況而對(duì)CCl4引起的肝臟線粒體功能紊亂有改善作用。該成分的變化趨 勢(shì)與黃欣等[29]的報(bào)道一致，而與彭思遠(yuǎn)等[30]的研究情況相反，認(rèn)為可能是由于CCl4與全氟辛酸造成肝損傷的作用機(jī)制不同引起。同時(shí)，在本研究中磷脂酸、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺及肉毒堿在給予CCl4后上調(diào)，給予紫蘇子醇提物后下調(diào)的系列變化，總體變化趨勢(shì)與有關(guān)報(bào)道一致，體現(xiàn)了紫蘇子醇提物對(duì)脂質(zhì)代謝及細(xì)胞膜系統(tǒng)的良好作用[31]。其中，磷脂酸（13∶0/0∶0）及溶血磷脂酰乙醇胺（16∶0）未見報(bào)道，可能為新的潛在的急性肝損傷生物標(biāo)志物。此外，由于CCl4引起的細(xì)胞核等的破壞，肌苷及甲基化核苷也呈現(xiàn)了上升趨勢(shì)，此趨勢(shì)與彭思遠(yuǎn)等[30]的研究結(jié)果相同。同時(shí)，給藥聯(lián)苯雙酯及紫蘇子醇提物則可回調(diào)肌苷及甲基化核苷的相對(duì)含量。在本研究中，?；悄懰犷愇镔|(zhì)的變化情況則與徐英等[32]報(bào)道的趨勢(shì)相同，肝損傷情況下該類物質(zhì)含量上升，給予治療藥物則下調(diào)，表明CCl4所致小鼠急性肝損傷及其相關(guān)藥物的治療效果亦可通過影響膽汁酸代謝網(wǎng)絡(luò)起作用。

本研究發(fā)現(xiàn)主要含有迷迭香酸、迷迭香酸苷及黃酮類物質(zhì)的紫蘇子醇提物，對(duì)CCl4致小鼠急性肝損傷有較好的保護(hù)作用，其作用強(qiáng)度在生藥當(dāng)量20 g/kg時(shí)，作用效果與聯(lián)苯雙酯臨床等效劑量相當(dāng)。ALT、AST、病理切片及代謝組學(xué)分析結(jié)果均表明了紫蘇子醇提物的藥效，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可相互佐證。

這種基于流動(dòng)注射進(jìn)樣的飛行時(shí)間質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的代謝組學(xué)研究方法[33]，相較傳統(tǒng)藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法，在數(shù)據(jù)挖掘、病理機(jī)制及藥物作用機(jī)制分析方面十分有優(yōu)勢(shì)。較之傳統(tǒng)的高效液相色譜柱分離之后再做質(zhì)譜檢測(cè)分析的方法，則具有檢測(cè)速度快（1 min每個(gè)樣品）、受外在因素干擾小的優(yōu)點(diǎn)。盡管單純質(zhì)譜分離能得到的化合物信息較色譜柱分離后再做質(zhì)譜檢測(cè)會(huì)有所減少是它的一個(gè)劣勢(shì)，但這種旨在和動(dòng)物藥效研究及臨床檢測(cè)方法接軌的探索所得到的潛在生物標(biāo)志物將可直接應(yīng)用于后者的分析，方便對(duì)大批量數(shù)據(jù)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)與數(shù)據(jù)挖掘。這對(duì)于作為藥效學(xué)研究需要足夠樣本量的實(shí)驗(yàn)以及臨床診斷快速檢測(cè)來說，很有幫助。同時(shí)，也相信隨著多種檢測(cè)技術(shù)的整合、組學(xué)技術(shù)及化學(xué)計(jì)量學(xué)研究的發(fā)展，這種基于質(zhì)譜快速分析的方法將 會(huì)為藥效學(xué)研究及臨床快速診斷帶來幫助，并成為建立客觀、量化的中藥整體藥效作用評(píng)價(jià)體系的重要組成部分。

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Protective Effect of Perilla Seed on Acute Hepatic Injury in Mice as Evaluated by Metabolomic Analysis

GENG Qin1, ZHENG Chuang-mu2, GUAN Zheng2,3,*, ZHANG Xiao-hong2, ZHU Chao2, YANG Shu-ming2, CHEN Ai-liang2,*
(1. Haiso Technology Co. Ltd., Wuhan 430074, China; 2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Institute of Materia Medica, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

The objective of this study was to evaluate the protective effect of perilla (Perilla frutescens) seed on acute hepatic injury induced by carbon tetrachloride. Identification of potential biomarkers was performed by high-performance liquid chromatography (HPLC) and flow injection electrospray ionization with time-of-flight (TOF) mass spectrometry (FIMS) combined with principal component analysis (PCA). Blood and hepatic tissue metabolic profiles were acquired and correlated with the biochemical and histopathological results. In this work, metabolomic profiling, and biochemical and histopathological studies together confirmed th e liver protective effect of perilla seed. Perilla seed at a dose equivalent to 20 g/kg per day caused a similar effect to that of bifendate (3.5 mg/kg per day). Compared with normal control group, the expression of LysoPC, LysoPE, PA, carnitine, citric acid, inosine, methylated nucleoside, and taurohyocholate were increased significantly in model group, whereas the opposite results were observed for the animals which had given perilla seed extract. These findings indicated that the developed metabonomic method based on FIMS might be used as a potentially powerful tool for fast and comprehensive estimation of the liver protective effect of perilla seeds.

perilla seed; flow injection; mass spectrometry; acute hepatic injury; metabonomics; principal component analysis

TS255.1

A

1002-6630（2014）17-0260-06

10.7506/spkx1002-6630-201417050

2013-10-30

耿芹（1980—），女，本科，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：yujia0715@sohu.com

*通信作者：管政（1980—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。E-mail：zhengguancn@163.com

陳愛亮（1975—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：ailiang.chen@gmail.com