蛋白芯片應(yīng)用研究進展

邱 實，劉 芳，袁曉紅，馬麗萍，董慶利，李浩林，劉 程，劉 箐,

蛋白芯片應(yīng)用研究進展

邱 實1，劉 芳2，袁曉紅3，馬麗萍3，董慶利1，李浩林1，劉 程1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生保健中心，甘肅 蘭州 700030；3.余姚市食品檢驗檢測中心，浙江 余姚 315400）

蛋白芯片作為一種快速、簡便、高通量分析檢測技術(shù)，近年來在食品檢驗、蛋白質(zhì)組學(xué)、疾病診斷、藥物篩選、農(nóng)林畜牧業(yè)以及司法鑒定等領(lǐng)域應(yīng)用日漸增多。本文簡述蛋白芯片的應(yīng)用、存在的問題和未來發(fā)展前景。

蛋白芯片；生物芯片；高通量檢測；食品檢驗

生物芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的一種高通量、大規(guī)模并行分析檢測技術(shù)，曾被《Science》雜志兩度評為年度十大科技突破之一，它是利用分子間特異相互作用的原理，將多種技術(shù)（如生物化學(xué)、微加工、微電子、計算機等）融為一體的一項分析檢測技術(shù)[1-2]。與傳統(tǒng)分析檢測方法所不同的是，它形成的微陣列使生化分析反應(yīng)過程高度集成于某一載體之上，高通量地分析檢測成百上千種DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等分子。目前常見的生物芯片有：基因芯片、蛋白芯片、糖芯片以及其他小分子生物芯片。

在基因組學(xué)的研究背景下，為了滿足人類對數(shù)以萬計基因功能的大規(guī)模研究，基因芯片應(yīng)運而生?；蛐酒且罁?jù)堿基互補配對原則，將大量已知序列的核酸探針高密度有序固定于某一載體表面，從而對待檢樣品中大量核酸成分進行分析檢測的技術(shù)，其高通量、快速、簡便等優(yōu)點滿足了人們對基因的大規(guī)模分析檢測的需求。目前，基因芯片主要應(yīng)用于基因表達檢測、雜交測序、疾病預(yù)測和診斷等領(lǐng)域。但是，基因水平上的研究只能初步了解基因表達產(chǎn)物的變化，而作為直接影響生命活動變化的蛋白質(zhì)則需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯、加工等多個調(diào)控步驟才能形成，所以對其功能和結(jié)構(gòu)的研究將具有重大的科學(xué)意義[3]。隨著蛋白組學(xué)研究的興起，如同起初對基因組學(xué)的研究一樣，在利用傳統(tǒng)方法對蛋白質(zhì)組功能進行分析研究時，同樣遇到了現(xiàn)有技術(shù)耗時、繁瑣、通量低等一系列問題。在彌補這些研究方法缺陷時，人們自然而然地模仿了基因芯片的原理，從而研制出了蛋白芯片。蛋白芯片是將各種蛋白質(zhì)（如抗原、抗體）、多肽以及受體、配體等有序固定于某一載體（如濾膜、凝膠、玻片、納米微珠和微孔板）之上，以分析檢測樣品中能與之特異相互作用的成分。與基因芯片一樣，其具有快速、簡便、高通量等優(yōu)點，基本滿足了現(xiàn)階段人們對蛋白質(zhì)組學(xué)的分析研究。雖然蛋白芯片是在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究背景下產(chǎn)生的，但其應(yīng)用不僅僅只局限于蛋白質(zhì)組學(xué)。凡是有關(guān)抗體-抗原、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-核酸、蛋白質(zhì)-脂類、蛋白質(zhì)-小分子以及酶與底物相互作用的研究中，蛋白芯片技術(shù)均有其獨特的用途[4]（圖1）。隨著蛋白芯片技術(shù)的日漸成熟，利用蛋白芯片的原理和特點，人們創(chuàng)造性地延伸了其多種應(yīng)用領(lǐng)域，如食品檢驗、疾病診斷、藥物篩選、農(nóng)林畜牧業(yè)、司法鑒定等領(lǐng)域。以下就蛋白芯片在這些領(lǐng)域的研究與應(yīng)用作簡要概述。

圖1 不同種類蛋白芯片的原理示意圖[4]Fig.1 Schematic diagram of different types of protein chips[4]

1 蛋白芯片的應(yīng)用

1.1 蛋白芯片在食品檢驗中的應(yīng)用

目前，食品中有毒有害物質(zhì)的檢測主要是利用昂貴的分析儀器、繁瑣的傳統(tǒng)方法來進行，這不僅需要專業(yè)的實驗人員及實驗室，而且也大大增加了檢測成本，所以快速、準(zhǔn)確、多指標(biāo)、低成本的現(xiàn)場檢測方法是目前市場上迫切需要的，而蛋白芯片技術(shù)正滿足了這些需求。其具體應(yīng)用表現(xiàn)在農(nóng)獸藥殘留的檢測、食源性致病微生物的檢測以及轉(zhuǎn)基因食品的檢測等。

在農(nóng)獸藥殘留檢測方面，北京博奧生物芯片有限公司于2005年就已開發(fā)了世界上第一套食品中獸藥殘留檢測體系，可對多種食品樣品中的4 種獸藥進行半定量并行檢測，與傳統(tǒng)方法對比，結(jié)果具有較高的一致性，且具有快速、準(zhǔn)確率高、前處理簡單、可同時并行檢測多種獸藥殘留等優(yōu)點[5]；2010年，劉楠等[6]建立了一種可同時檢測4 種獸藥（氯霉素、克倫特羅、雌二醇、泰樂菌素）和3 種農(nóng)藥（阿特拉津、吡蟲啉、甲萘威）的高通量懸浮蛋白芯片技術(shù)，在對含有多種靶標(biāo)物質(zhì)的不同盲樣進行檢測時，檢測濃度值與實際濃度值相對偏差較小，整個檢測過程只需1～2 h；在食源性致病微生物檢測方面，2008年，Choi等[7]將大腸桿菌O157∶H7（Escherichia coli O157∶H7），鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica），嗜肺軍團菌（Legionella pneumophila）的各自抗體固定在經(jīng)過G蛋白（G-protein）修飾的基片上制成蛋白芯片，在對樣本的檢測中，E. coli O157∶H7的檢測下限可達102CFU/mL，動態(tài)線性范圍在102～107CFU/mL之間；2009年，路浩[8]建立了一種可同時檢測3 種致病菌、2 種病毒及2 種毒素的蛋白芯片技術(shù)，在對奶樣、土樣、水樣的檢測中，致病菌的檢測下限達103CFU/mL，病毒和毒素的檢測下限達μg/mL級別，檢測周期僅為2 h；在轉(zhuǎn)基因食品檢測中，蛋白芯片可直接檢測轉(zhuǎn)基因食品中外源基因表達出的蛋白質(zhì)，2011年，汪琳等[9]建立了可同時檢 測3 種轉(zhuǎn)基因成分的蛋白芯片技術(shù)，在對已知標(biāo)準(zhǔn)樣品進行單獨和混合檢測時，檢測下限可達到ng/mL級，且具有較高的特異性。

可見，在食品安全檢測方面，蛋白芯片法與傳統(tǒng)的食品檢測方法（如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、酶聯(lián)免疫反應(yīng)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、高效液相色譜法等）相比，具有高通量、快速、簡便、所需樣本量少等特點，但因其技術(shù)發(fā)展不成熟，不具有準(zhǔn)確率高、重復(fù)性好、檢測標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范統(tǒng)一等傳統(tǒng)檢測法所具有的優(yōu)勢。

1.2 蛋白芯片在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組系指一個基因組、一種細胞、一個組織、甚至是一個生物體在某一特定的階段內(nèi)所表達的全套蛋白質(zhì)[10]。在對蛋白質(zhì)組中大量蛋白質(zhì)分析研究的過程中，人們依據(jù)高通量、快速、簡便等需求，開發(fā)出了蛋白芯片技術(shù)，所以蛋白芯片最初是在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用開來的[11]，其在這一領(lǐng)域的主要應(yīng)用體現(xiàn)在兩個方面：1）蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及小分子相互作用圖譜的研究；2）蛋白表達譜的建立[12]。

在蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及小分子相互作用圖譜的研究中，科研工作者運用高通量蛋白芯片技術(shù)，對酵母菌蛋白質(zhì)組有了一個較深的研究[13]，而這些研究是傳統(tǒng)方法短期內(nèi)不能完成的。如2005年，Ptacek等[14]利用蛋白芯片技術(shù)研究了與酵母激酶相互作用的蛋白質(zhì)，其中涉及到1 325 個不同的蛋白質(zhì)，確定了4 000多個磷酸化反應(yīng)，繪制出第一代酵母磷酸化圖譜。當(dāng)前，蛋白芯片在蛋白組學(xué)領(lǐng)域的研究日趨活躍，2013年，高偉等[15]利用蛋白芯片技術(shù)探究了抑制鈉氫交換蛋白1（Na+/H+exchanger 1，NHE1）后血管生成因子表達的變化，并用實時定量PCR驗證NHE1抑制后白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）的表達水平，結(jié)果表明NHE1抑制后K562人白血病細胞中IL-8的表達出現(xiàn)顯著地下調(diào)；2013年，Chen Zhijian等[16]通過蛋白芯片研究了人類B淋巴細胞暴露于1.8 GHz GSM射頻電磁輻射下24 h內(nèi)蛋白質(zhì)表達的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有27 種蛋白質(zhì)有差異性表達，而這些蛋白質(zhì)與DNA損傷修復(fù)、細胞凋亡、腫瘤發(fā)生以及細胞增殖有關(guān)，有助于解釋射頻電磁輻射在DNA損傷修復(fù)和細胞凋亡中的生物學(xué)效應(yīng)。蛋白芯片不僅可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及其他小分子相互作用圖譜的研究，同時在蛋白質(zhì)表達譜建立的研究中也有廣泛應(yīng)用。在人類蛋白質(zhì)組的研究中，通過監(jiān)測人體內(nèi)一系列蛋白質(zhì)表達水平及特征的變化，可判定人體的細胞及組織是否處于疾病的狀態(tài)下，為篩選出人類疾病的生物標(biāo)志物及確定臨床診斷指標(biāo)提供了便捷的方法。2011年，程亞偉等[17]通過運用蛋白芯片技術(shù)比較了慢性腎衰（chronic renal failure，CRF）患者與正常人群舌苔上清液中蛋白表達譜的差異，并建立了CRF預(yù)測模型，結(jié)果表明有7 個差異質(zhì)譜峰組成的蛋 白質(zhì)可作為慢性腎衰的生物標(biāo)志物；2009年，Han等[18]利用蛋白芯片技術(shù)，對肺癌患者和健康人群血清中蛋白表達譜進行比較，發(fā)現(xiàn)在肺癌患者血清中有6 種蛋白質(zhì)出現(xiàn)了明顯下調(diào)現(xiàn)象，并以這6 種蛋白質(zhì)作為肺癌標(biāo)志物進行了樣本盲測，近一步說明了該6 種蛋白質(zhì)可作為肺癌的生物標(biāo)志物；2010年，胡朝軍等[19]通過運用蛋白芯片（包含17 718 個人類基因編碼蛋白，共38 400 個蛋白點）技術(shù)，篩選出4 個差異有統(tǒng)計學(xué)意義的原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）血清標(biāo)志物，可作為一種快速全面篩選診斷PBC標(biāo)志物的技術(shù)。由此可見，在篩選生物標(biāo)志物 這種大規(guī)模的蛋白質(zhì)分析研究當(dāng)中，蛋白芯片以其高通量、快速、簡便等特點受到了研究者廣泛地青睞。而在模式動物蛋白表達譜分析研究中，蛋白芯片亦可運用其中。2011年，張瑩等[20]運用蛋白芯片技術(shù)比較了胎鼠神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）在不同劑量葉酸作用下的蛋白質(zhì)表達譜的差異，結(jié)果表明每張蛋白芯片上均捕獲到102 個蛋白點，篩選出4 種具有顯著性差異（P＜0.05）的蛋白質(zhì)，初步斷定了胎鼠NSCs的凋亡與這些蛋白質(zhì)有關(guān)。

總之，在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，可以采用傳統(tǒng)方法如雙向凝膠電泳技術(shù)、高效液相色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)來進行分析研究，其優(yōu)點是技術(shù)體系成熟規(guī)范、可將細胞或體液等樣品中絕大部分蛋白質(zhì)分離出來、可給出蛋白質(zhì)的序列和構(gòu)型，缺點是對于極酸、極堿蛋白質(zhì)，極大、極小蛋白質(zhì)，疏水性及低豐度的蛋白質(zhì)難以分離并且通量較低、繁瑣、耗時，限制了后續(xù)的研究。而具有高通量、快速、簡便等特點的蛋白芯片技術(shù)，正彌補了傳統(tǒng)方法的缺陷，為大規(guī)模分析檢測蛋白質(zhì)提供了一個高通量的平臺，并且其還具有可檢出低豐度蛋白質(zhì)、檢測不受蛋白質(zhì)的酸堿性及疏水性的影響、所需樣本量少、可直接采用血清、體液等粗生物樣品檢測等優(yōu)點，但無法給出蛋白質(zhì)的序列及構(gòu)型、高豐度蛋白質(zhì)易于對低豐度蛋白質(zhì)的檢測結(jié)果造成影響、檢測成本高、技術(shù)體系不統(tǒng)一規(guī)范等缺點同樣也限制其發(fā)展速度。

1.3 蛋白芯片在疾病診斷中的應(yīng)用

人體的某些疾病（如癌癥、自身免疫性疾病等）在發(fā)生的同時會伴隨著特定的生物標(biāo)志物表達的變化，因此可利用蛋白芯片對這種變化進行監(jiān)測，從而進行疾病的研究與診斷。目前，蛋白芯片已在癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病、肥胖等疾病中有所研究與應(yīng)用，尤其是在腫瘤標(biāo)志物的篩選與確定中已廣泛的應(yīng)用開來[21]。

在癌癥預(yù)測與診斷方面，2011年，Cai Shaoyu等[22]開發(fā)了一種基于磁性弛豫開關(guān)技術(shù)的蛋白芯片，并用該芯片檢測前列腺癌特異性標(biāo)志物PSA（prostate specific antigen），其檢測線性濃度范圍為17.3～43.2 ng/mL，最低檢測限可 達13.7 ng/mL。雖然腫瘤標(biāo)志物的檢測已成為癌癥常規(guī)診斷的一種方法，但單一腫瘤標(biāo)志物的檢測陽性率低、特異性弱，對癌癥的早期檢出率不高。所以，目前常采用多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的方法來提高癌癥的檢出率，而傳統(tǒng)方法的繁瑣、費時、低效等缺點阻礙了聯(lián)合檢測的應(yīng)用，蛋白芯片技術(shù)以其高效、簡便、低成本等優(yōu)點推動了聯(lián)合檢測在這一領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展。2013年，Yang Zhugen等[23]將大腸癌的4 種生物標(biāo)志物的抗體固定于三維結(jié)構(gòu)化的玻片上，構(gòu)建了可檢測大腸癌的蛋白芯片，并考察了3 種不同表面功能基團修飾對蛋白質(zhì)固定能力的影響，實驗中發(fā)現(xiàn)基片的表面能、空間位阻、點樣緩沖液的pH值對蛋白 質(zhì)的固定有很大的影響；2013年，王文濤等[24]通過在醛基化修飾的玻片上固定肺癌標(biāo)志物捕獲抗體，并用檢測抗體制備了納米金探針，構(gòu)建了可檢測肺癌標(biāo)志物的蛋白芯片，該芯片可同時檢測2 種腫瘤標(biāo)志物，檢測時間只需1 h，其中癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）的檢測限可達45 pg/mL、CYFRA21-1（細胞角蛋白19的可溶性片段）為90 pg/mL，其結(jié)果可由肉眼或顯微鏡直接觀察得出，滿足了檢測結(jié)果可視化的需求?？梢?，運用蛋白芯片檢測腫瘤標(biāo)志物與傳統(tǒng)方法（如ELISA法）相比，檢測通量、靈敏度均有所提高，并且蛋白芯片檢測法具有快速、便攜、成本低和操作簡單等特點，在癌癥的臨床檢測中具有極大的應(yīng)用前景。表1統(tǒng)計了近幾年蛋白芯片在癌癥診斷中應(yīng)用的實例。蛋白芯片技術(shù)不僅可應(yīng)用于癌癥的診斷，在自身免疫性疾病的診斷中也有其身影。自身免疫性疾病是指機體對自身抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而導(dǎo)致自身組織受損所引起的疾病[25]，常見的有系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，因其在機體內(nèi)產(chǎn)生自身抗體，所以病人血清中常有較高的自身抗體檢出。根據(jù)這一特點，可以利用蛋白芯片技術(shù)對自身免疫性疾病進行研究與診斷。2012年，Huang Wei等[26]在對系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病的研究中，將人類的5 011 種蛋白質(zhì)固定在基片上，制成蛋白芯片，通過實驗發(fā)現(xiàn)了1 種新的與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病有關(guān)的自身抗原；2013年，Lin Mingwei等[27]構(gòu)建了可檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡的蛋白芯片，該蛋白芯片基于不同生物標(biāo)志物表達情況的不同可較靈敏地將系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者與健康人群區(qū)分開來；2009年，劉鏡光等[28]應(yīng)用風(fēng)濕病自身抗體蛋白芯片對375 份臨床樣本進行5 種指標(biāo)聯(lián)合檢測，通過與經(jīng)典的檢測方法（免疫比濁法、ELISA法和免疫熒光法）對比，表明該蛋白芯片具有較好的一致性（P＞0.05），且具有快速、便攜、準(zhǔn)確率高、特異性強和操作簡便等優(yōu)點。近年來，蛋白芯片在疾病研究與診斷中的應(yīng)用不斷拓展，有研究表明人體內(nèi)瘦蛋白（leptin，LP）與肥胖疾病有關(guān)，2009年，Lee等[29]通過運用浸蘸筆納米加工刻蝕技術(shù)（dip pen nanolithography，DPN）制作的蛋白芯片，對人體血清內(nèi)LP進行定量檢測，其檢測下限可達100 zmol/L，而傳統(tǒng)的ELISA試劑盒檢測下限只有1.95 pmol/L，且該芯片具有所需檢測樣本量少、分析速度快等優(yōu)點，但該芯片的基片制作速度緩慢，因此阻礙了其應(yīng)用推廣；而利用NanoeNabler?表面成型技術(shù)制作基片的速度比DPN技術(shù)制作基片的速度要快近2 000 倍，2010年，Islam等[30]就通過利用該技術(shù)制作了一種新型的納米陣列蛋白芯片，用其來檢測與人心血管疾病有關(guān)的C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP），結(jié)果表明該蛋白芯片檢測下限可達到50 zmol/L，與傳統(tǒng)ELISA法相比，檢測靈敏度提高了6×106倍，可檢出CRP的單分子，且有很寬的線性范圍（50 zmol/L～1 fmol/L）；β2-微球蛋白可作為腎小球和腎小管功能是否處于健康狀態(tài)的一個指標(biāo)，在腎病的臨床檢測中具有一定的意義，2013年，Moschallski等[31]將β2-微球蛋白的抗體固定于三維水凝膠中，構(gòu)建了可檢測β2-微球蛋白的蛋白芯片，該蛋白芯片具有良好的檢測線性范圍，可從mg/mL到μg/mL；2013年，Gagni等[32]構(gòu)建了可檢測阿爾茲海默病生物標(biāo)志物Aβ42的蛋白芯片，該蛋白芯片具有檢測樣本少、檢測周期短等特點，且最低檢測下限可達73 pg/mL。

表1 蛋白芯片在癌癥診斷中的應(yīng)用Table 1 Applications of protein chips in cancer diagnosis

總之，蛋白芯片在癌癥、自身免疫性疾病、肥胖等多種疾病的研究中均有所應(yīng)用，相比于ELISA等傳統(tǒng)檢測方法，其靈敏度顯著地提高，更重要的是其可進行多指標(biāo)聯(lián)合檢測，且具有快速、簡便、所需樣本少、低成本等優(yōu)點，但目前因其無法對檢測指標(biāo)進行精確定量，所以也限制了它在實際應(yīng)用中的發(fā)展。

1.4 蛋白芯片在藥物篩選中的應(yīng)用

藥物篩選是新藥開發(fā)的一個重要步驟，系指通過適當(dāng)?shù)募夹g(shù)和方法，對可能作為藥物使用的化合物進行藥理活性檢測評估的過程。傳統(tǒng)的藥物篩選，是通過待篩化合物直接作用于模型動物或細胞，觀察其對疾病表型反應(yīng)來進行的，雖然這種方法具有較高的準(zhǔn)確性，但并不能給出藥物作用的機理和毒性機制，且效率極低，造成新藥研發(fā)費用較高，限制了新藥的開發(fā)進展。在組合化學(xué)面世之后，傳統(tǒng)方法更是不能解決大量待篩化合物的篩選難題。當(dāng)前，高通量藥物篩選技術(shù)已在各種新藥（如化學(xué)藥物、蛋白質(zhì)類藥物、生物催化劑）開發(fā)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，成為制藥行業(yè)新藥開發(fā)的重要手段[33]。蛋白芯片技術(shù)則為藥物與靶標(biāo)蛋白互作之間建立了一個高通量的途徑。與眾多疾病發(fā)生有關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCRs）備受制藥行業(yè)的關(guān)注，據(jù)報道目前市場上約有1/3的小分子藥物都與GPCRs有關(guān)，2006年，F(xiàn)ang Ye等[34]通過運用蛋白芯片技術(shù)探索識別GPCRs的潛在配體，推動了蛋白芯片技術(shù)在制藥行業(yè)中的應(yīng)用。與此同時，由我國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制的用于藥物篩選的3 種蛋白芯片（膜受體芯片、核受體芯片、酶受體芯片）可以同時并行對多種樣品的生物活性和藥理作用進行分析篩選，在對300余名人體血液樣本的檢測中，結(jié)果表明該系列蛋白芯片具有靈敏度高，速度快，成本低等優(yōu)點[35]。

可見，蛋白芯片能夠進行成百上千種蛋白質(zhì)與藥物作用的同時并行分析，使得藥物篩選可以直接在生物體外進行，并通過對生命活動的執(zhí)行者——蛋白質(zhì)的直接分析，使得對藥物作用機理和毒性機制的探究變得簡便易行，從而降低了新藥開發(fā)的成本及時間，使得很多新型藥物可以以較低的價格推廣上市，對造福人類社會具有深遠影響。但目前該技術(shù)存在需要大量的活性蛋白質(zhì)且須保證固定在載體上的蛋白質(zhì)維持 一定的天然構(gòu)象和生物活性等難題，阻礙了蛋白芯片在藥物篩選中的廣泛應(yīng) 用。

1.5 蛋白芯片在農(nóng)林漁畜牧業(yè)中的應(yīng)用

在農(nóng)林畜牧業(yè)中，蛋白芯片技術(shù)在農(nóng)作物致病菌、畜禽病毒的檢測中有所應(yīng)用。在農(nóng)作物致病菌檢測方面，2011年，熊亮斌等[36]運用硝酸纖維素膜作為基片，建立了可檢測西瓜果斑病菌的可視化蛋白芯片，在對實際樣品的檢測中，表現(xiàn)出較好的特異性和重復(fù)性，與ELISA方法相比，檢測靈敏度和陽性符合率均相當(dāng)，但所使用的捕獲抗體量僅為ELISA法的1/12，檢測時間僅為1/8，且具有所需檢測樣本量少、操作簡便、成本低、結(jié)果可由肉眼直接觀察等特點；在漁畜禽病毒檢測方面，2010年，Wang Xiurong等[37]將從4 種病毒（禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性法氏囊病病毒）中提取的抗原蛋白質(zhì)固定在醛基化修飾的玻片上構(gòu)建蛋白芯片，用于檢測樣本中這4 種病毒，從而判斷家禽雞是否患病，與瓊脂凝膠沉淀法相比，其檢測結(jié)果靈敏度較好、陽性檢出率較高，且具有較好的特異性；淋巴囊腫病毒是淋巴囊腫病的病原體，影響全球海洋和淡水魚，2013年，Sheng Xiuzhen等[38]將淋巴囊腫病毒的抗體固定于瓊脂糖凝膠基片上構(gòu)建蛋白芯片，通過優(yōu)化基片表面化學(xué)結(jié)構(gòu)和檢測抗體的標(biāo)記物，使得該蛋白芯片對淋巴囊腫病毒的最低檢測限達0.068 6 μg/mL，并與ELISA和免疫熒光實驗有較好的符合率。

由此可見，蛋白芯片應(yīng)用于農(nóng)作物致病菌、畜禽病毒的檢測中，具有速度快、成本低、通量高、操作簡便、所需樣本量少等特點，但目前該技術(shù)在此領(lǐng)域中的研究與應(yīng)用實例較少。

1.6 蛋白芯片在司法鑒定中的應(yīng)用

當(dāng)前，在司法鑒定領(lǐng)域中也出現(xiàn)了蛋白芯片的身影。隨著涉毒案件的日益增加，公安部門的毒品檢測任務(wù)越來越繁重，傳統(tǒng)的檢測方法（如化學(xué)法、色譜法、光譜法、免疫法等[39]）低效、耗時、樣品檢測單一，已不能滿足現(xiàn)今毒品檢測的需求，而蛋白芯片的快速、高通量等特性正滿足了這種需要，2012年，上海市公安局物證鑒定中心[40]研究建立了一種可定量檢測多種毒品的蛋白芯片技術(shù)，在對506 例檢測樣本進行定性定量檢測后與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對比，相關(guān)性在88%以上，且該方法比膠體金試紙條法靈敏度提高了10 倍左右，特異性達到99%，為毒品的快速、大量、多重檢測提供了一個可行的思路。

2 蛋白芯片存在的問題

盡管蛋白芯片以其高通量、快速、簡便等特點受到了各領(lǐng)域的廣泛關(guān)注，但相對于只含有5 種堿基所組成的基因芯片來說，成千上萬種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的多樣性，使得蛋白芯片在制作應(yīng)用方面需要更多的步驟才能完成。經(jīng)過20多年的發(fā)展，蛋白芯片技術(shù)目前還存在著許多難題與挑戰(zhàn)，包括：1）與DNA雜交不同，蛋白質(zhì)的功能取決于其三維結(jié)構(gòu)，因此在制作芯片時，必須保證芯片上蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)甚至是更高級結(jié)構(gòu)處于正確的狀態(tài)，以保證蛋白探針的功能不致丟失，而這是當(dāng)前蛋白芯片領(lǐng)域的一大難題；2）在蛋白探針固定在基片上時，須保證每單位表面積固定蛋白質(zhì)分子的數(shù)量，這對蛋白芯片的檢測靈敏度有相當(dāng)大的影響，最佳的蛋白固定濃度在一定程度上取決于所用檢測方法的靈敏度，高靈敏度的檢測系統(tǒng)可容許較低濃度的蛋白固定量，但高靈敏度的檢測系統(tǒng)又必然導(dǎo)致檢測成本的提高，而低靈敏度、低成本的檢測系統(tǒng)則須保證有高濃度的蛋白固定量，因此如何確定基片上固定蛋白探針的量同樣成為當(dāng)前蛋白芯片領(lǐng)域中的一大難點；3）不同蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是不同的，其受諸多外界環(huán)境影響，如蛋白質(zhì)的酶降解和非酶降解、蛋白質(zhì)的氧化以及蛋白質(zhì)的高低溫損傷，所以在芯片貯存和運輸?shù)倪^程中，如何保證芯片上的蛋白探針具有承受一定外界環(huán)境變化的能力并處于良好的活性狀態(tài)同樣重要；4）芯片基片的選擇。不同材質(zhì)的基片在蛋白芯片的應(yīng)用過程中會顯示出不同的特性，表2列出了5 種常見基片的優(yōu)缺點，而這些不同的特性對載體固定蛋白質(zhì)的能力、維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的能力以及樣點均一性、檢測靈敏度等方面的影響也是不盡相同的，所以在基片表面改性和新型基片研發(fā)方面，則需要進行更深入的研究，并且這已成為當(dāng)前蛋白芯片領(lǐng)域中一大研究熱點；5）在芯片制作過程中，雖對基片表面進行了封閉處理，但基片非樣點處仍常與檢測靶標(biāo)產(chǎn)生非特異性結(jié)合，造成較高的背景值，降低檢測靈敏度；6）基片樣點處在產(chǎn)生光學(xué)信號時，常會出現(xiàn)“咖啡環(huán)”現(xiàn)象（圖2），使得無法對信號強度進行精確測量，限制了蛋白芯片定量檢測的發(fā)展；7）目前市面上抗體的數(shù)量遠不能滿足蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，且需要大量高特異性的抗體來保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，但是昂貴的單克隆抗體又必然提高芯片制造的成本，使得蛋白芯片不能以較低的價格面世；8）如何優(yōu)化點樣參數(shù)確保檢測樣點間的一致性，從而保證檢測結(jié)果的可重復(fù)性也是蛋白芯片技術(shù)當(dāng)前的一個難題；9）在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，有時需要對芯片上檢測到的蛋白質(zhì)進行近一步的研究，如何從芯片上將這些蛋白質(zhì)更好地分離出來，也是當(dāng)前需要解決的一個問題。

表2 蛋白芯片中不同基片特性的比較Table 2 Comparison of characteristics of various substrates for protein chips

圖2 蛋白芯片中樣點產(chǎn)生光學(xué)信號時的“咖啡環(huán)”現(xiàn)象[7,49-50]Fig.2 “Coffee ring” in protein chips as optimal signal appeared in sample points[7,49-50]

3 結(jié) 語

當(dāng)前，雖然在蛋白芯片技術(shù)研究中遇到了諸多難題與挑戰(zhàn)，但隨著這些問題的解決，尤其是在新型基片方面的深入研究，蛋白芯片技術(shù)定將會愈加成熟與完善。我們有理由相信，隨著大量科研工作者的共同努力，蛋白芯片技術(shù)必將會在食品檢驗、蛋白質(zhì)組學(xué)、疾病診斷、藥物篩選、農(nóng)林畜牧業(yè)、司法鑒定等各領(lǐng)域中廣泛地應(yīng)用開來。

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An Overview of the Application of Protein Chip

QIU Shi1, LIU Fang2, YUAN Xiao-hong3, MA Li-ping3, DONG Qing-li1, LI Hao-lin1, LIU Cheng1, LIU Qing1,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. International Travel Health Care Center, Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 700030, China; 3. Yuyao Food Inspection Center, Yuyao 315400, China)

As a rapid, simple and high-throughput analytical technique, protein chip has been increasingly applied in the fi elds of food inspection, proteomics, disease diagnosis, drug screening, agroforestry, animal husbandry and judicial expertise. This paper is intended to provide a brief overview of its applications and problems involved as well as future prospects.

protein chip; bio-chip; high-throughput detection; food inspection

Q819

A

1002-6630（2014）17-0332-06

10.7506/spkx1002-6630-201417062

2013-11-21

上海市科委重點支撐計劃項目（13430502400）；甘肅省科技支撐計劃項目（1304FKCA056）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（GSCIQ_2010IK220）

邱實（1990—），男，碩士研究生，研究方向為蛋白芯片快速檢測食源性致病菌。E-mail：quintustone@163.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理及快速檢測技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn