魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合氨芐西林對(duì)表皮葡萄球菌的抗菌作用

賈 芳，楊江流，劉文慧，邢立群

(河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾015000)

表皮葡萄球菌(SE)是臨床常見(jiàn)的條件致病菌，常伴隨生物材料的置入如插管、人工瓣膜、透析等醫(yī)療技術(shù)和一次性材料進(jìn)入人體內(nèi)，并通過(guò)黏附在生物材料表面形成細(xì)菌生物膜而使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，給臨床治療帶來(lái)困難［1］。中藥魚(yú)腥草的主要抗菌成分為癸酰乙醛，向癸酰乙醛中加入亞硫酸氫鈉制成的魚(yú)腥草素鈉，性質(zhì)穩(wěn)定又保留了抗菌活性［2］。管研等［3］報(bào)道，500 mg/L 的魚(yú)腥草素鈉對(duì)SE生物被膜的形態(tài)有顯著影響，聯(lián)合紅霉素在亞濃度下就能有效抑制SE生物被膜的黏附和代謝。氨芐西林(AM)為廣譜半合成青霉素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、耐酸、低毒等特點(diǎn)，但其對(duì)β-內(nèi)酰胺酶不穩(wěn)定，細(xì)菌易產(chǎn)生耐藥性。由于耐藥菌的出現(xiàn)，單一抗菌藥物已經(jīng)失去療效，因此聯(lián)合用藥成為控制和減少耐藥菌株產(chǎn)生的有效手段［4］。2014年1～3月，我們觀察了魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合AM對(duì)SE的體外抑制作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 8株臨床分離SE菌株(巴彥淖爾市第二醫(yī)院饋贈(zèng))，ATCC 29213質(zhì)控菌株購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)菌株保藏所。魚(yú)腥草素鈉購(gòu)于中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)藥品中心，溶于無(wú)菌水中配制成0.1 mol/L的藥液，AM溶于磷酸緩沖液中配制成0.1 mol/L的藥液，4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 接種菌懸液的制備 將實(shí)驗(yàn)菌株劃線接種于固體MH培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，挑去單菌落按1∶100接種于液體MH培養(yǎng)基中，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，稀釋至0.5麥?zhǔn)瞎軡岫?，再將該菌懸液用MH液體培養(yǎng)基1∶20稀釋后使用。

1.2.2 藥物單獨(dú)抗菌活性測(cè)定 采用二倍稀釋法［5］測(cè)定。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板外圍孔中加200 μL蒸餾水，剩余孔均加入100 μL MH液體培養(yǎng)基及100 μL接種菌懸液(包括無(wú)藥對(duì)照孔)。將100 μL工作濃度藥液加入每排第一個(gè)孔，然后依次進(jìn)行二倍稀釋。同時(shí)設(shè)置10∶100和1∶100菌懸液的稀釋對(duì)照，表示10%和1%細(xì)菌污染檢測(cè)。魚(yú)腥草素鈉檢測(cè)濃度范圍為 0.78 ～100 μg/mL，AM 為 0.5 ～1 024 μg/mL。平板置于密封袋中，5%CO2、37 ℃孵育過(guò)夜。當(dāng)質(zhì)控菌株的MIC值處于質(zhì)控范圍時(shí)，以肉眼觀察，藥物最低濃度孔無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為受試菌的MIC。MIC值測(cè)定重復(fù)3次。

1.2.3 藥物聯(lián)合抗菌活性測(cè)定 采用微量棋盤(pán)法［5］測(cè)定。將魚(yú)腥草素鈉與AM的MIC值兩兩組合，每孔抗菌藥物各50 μL加入到96孔板中，試驗(yàn)孔及無(wú)藥對(duì)照孔均加入100 μL MH液體培養(yǎng)基及100 μL菌懸液。聯(lián)合用藥各藥物檢測(cè)最終濃度范圍同單藥檢測(cè)相同，MIC值判定方法相同。藥物效果判定參照文獻(xiàn)［6］方法，部分抑菌濃度指數(shù)(FICI)=(MICa聯(lián)合/MICa單獨(dú))+(MICb聯(lián)合/MICb單獨(dú))，F(xiàn)ICI≤0.5 表示兩者協(xié)同，0.5 ＜ FICI≤4 表示兩者不相關(guān)，F(xiàn)ICI＞4表示兩者拮抗。

1.2.4 藥物殺菌效力評(píng)估 從上述實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)抽取1株耐藥菌，分別接種于含有魚(yú)腥草素鈉單藥、AM單藥、魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合AM的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(其濃度為魚(yú)腥草素鈉和AM的MIC)，另設(shè)不加藥物的空白對(duì)照孔，37℃孵育過(guò)夜，于0、12、24、36 h每孔取100 μL，用比濁管對(duì)比稀釋至1×106個(gè)細(xì)菌/管，取100 μL接種于MH固體培養(yǎng)基，37℃孵育過(guò)夜，記錄平板上的菌落數(shù)，換算成log10的形式，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［6］，聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥相比，菌落數(shù)減少≥2log10cfu/mL為協(xié)同，減少或增加＜2log10cfu/mL為不相關(guān)，增加≥2log10cfu/mL為拮抗。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗SE活性測(cè)定結(jié)果 見(jiàn)表1。AM單獨(dú)對(duì)SE的MIC為2～64 μg/mL，魚(yú)腥草素鈉單獨(dú)對(duì) SE的MIC 為12.5 ～50 μg/mL;二者聯(lián)合后，AM 對(duì) SE 的MIC降至0.5～16 μg/mL，魚(yú)腥草素鈉對(duì) SE 的 MIC降至0.78 ～6.25 μg/mL，AM 的 MIC 下降了 4 倍，魚(yú)腥草素鈉的MIC下降了8～16倍，F(xiàn)ICI是0.250～0.375，表明二者具有協(xié)同作用。

表1 魚(yú)腥草素鈉、AM單獨(dú)和聯(lián)合抗SE的MIC和FICI

2.2 殺菌效力評(píng)估結(jié)果 篩選22號(hào)和6號(hào)菌株進(jìn)一步試驗(yàn)，如圖1、2所示，不加藥物的對(duì)照孔0～36 h細(xì)菌繼續(xù)生長(zhǎng)，魚(yú)腥草素鈉、AM單獨(dú)作用也沒(méi)有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但相同濃度下魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合AM抑制了細(xì)菌生長(zhǎng)，藥物單獨(dú)作用與聯(lián)合作用比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥相比，菌落數(shù)的減少量明顯＞2log10 cfu/mL，因此魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合AM對(duì)SE的作用具有協(xié)同效果。

圖1 魚(yú)腥草素鈉 3.125 μg/mL、AM 0.5 μg/mL單獨(dú)及聯(lián)合作用于6號(hào)SE

圖2 魚(yú)腥草素鈉 6.25 μg/mL、AM 16 μg/mL單獨(dú)及聯(lián)合作用于22號(hào)SE

3 討論

中草藥具有殺菌抗菌作用，且不易產(chǎn)生耐藥性。AM為青霉素類(lèi)抗生素，根據(jù)美國(guó)臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)判斷標(biāo)準(zhǔn)，AM單獨(dú)作用8株SE的MIC為2～64 μg/mL，均為耐藥菌株，AM單獨(dú)作用 ATCC29213標(biāo)準(zhǔn)菌株的 MIC值為0.5 μg/mL，在質(zhì)控范圍內(nèi)。由于抗生素的濫用導(dǎo)致耐藥菌株的增加，尋找能抑制耐藥菌株的抗生素成為近年研究的熱點(diǎn)。Beecham制藥公司首先報(bào)道了BRL42715的合成及生物活性，其對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的抑菌活性較強(qiáng)，而對(duì)革蘭陰性菌的抗菌活性弱，是目前最好的廣譜內(nèi)酰胺酶抑制劑，與已知的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑如克拉維酸、舒巴坦、他唑巴坦相比，具有更強(qiáng)的抑酶活性及更廣的抗菌譜［7］。Synphar和Taibo公司研制合成的SYN-2190屬單環(huán)β-內(nèi)酰胺化合物，可特異性鈍化腸桿菌、檸檬桿菌、假單孢菌和摩氏摩根菌屬染色體介導(dǎo)的耐藥菌，是C型β-內(nèi)酰胺酶的有效競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑［8］。SE耐青霉素類(lèi)抗生素的機(jī)制主要包括生物被膜和青霉素酶產(chǎn)生及其BPB的改變［9］。本實(shí)驗(yàn)選擇了8株多重耐藥SE分離株，觀察魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合青霉素類(lèi)抗生素的抗菌作用，結(jié)果顯示魚(yú)腥草素鈉聯(lián)合青霉素類(lèi)抗生素對(duì)SE的抗菌作用明顯優(yōu)于單獨(dú)作用。下一步我們將利用分子生物學(xué)手段探討魚(yú)腥草素鈉是否具有抑制青霉素酶的作用，故本實(shí)驗(yàn)選取了AM而非耐青霉素酶的甲氧西林等抗生素類(lèi)藥物。

近年來(lái)，中藥抑制耐藥性菌株取得了較大成就。魚(yú)腥草性味辛、寒，具有清熱解毒、清腫排膿、利尿通淋之功效，臨床用于治療腫癰化膿、痰熱喘咳、熱痢熱淋、癰腫瘡毒等。現(xiàn)代藥理研究表明，魚(yú)腥草素具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、利尿作用，還可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、平喘鎮(zhèn)咳［10］，對(duì)卡他球菌、金黃色葡萄球菌、流感桿菌、肺炎球菌具有明顯的抑制作用［11］。本研究顯示，魚(yú)腥草素鈉單獨(dú)作用8株SE 的 MIC 為12.5 ～50.0 μg/mL，與 AM 聯(lián)合后，其對(duì)SE的MIC均下降，與朱玲玲等［12］的報(bào)道一致。與管研等［13］報(bào)道的魚(yú)腥草素鈉對(duì)強(qiáng)產(chǎn)膜SEATCC35984的 MIC 值0.0625 μg/mL 不一致，可能與本實(shí)驗(yàn)臨床分離株耐藥性更強(qiáng)有關(guān)。

本研究對(duì)AM和魚(yú)腥草素鈉進(jìn)行殺菌效力評(píng)估，結(jié)果顯示，相對(duì)于起始細(xì)菌數(shù)1×106/管，不加藥對(duì)照組、單獨(dú)AM和魚(yú)腥草素鈉細(xì)菌生長(zhǎng)曲線向右呈上升趨勢(shì)，而魚(yú)腥草素鈉與AM聯(lián)合用藥后細(xì)菌生長(zhǎng)曲線向右呈下升趨勢(shì)，說(shuō)明聯(lián)合用藥與單獨(dú)用藥相比對(duì)細(xì)菌的殺菌效力增加?？傊?，魚(yú)腥草素鈉與AM具有協(xié)同抗菌作用，其作用機(jī)制可能是由于藥物抑制了酶的作用，也可能是作用于其他蛋白質(zhì)。

［1］Fey PD，Olson ME.Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis［J］.Future Microbiol，2010，5(6):917-933.

［2］Pan P，Wang YJ，Han L，et al.Effects of sodium houttuyfonate on expression of NF-κB and MCP-1 in membranous glomerulonephritis［J］.J Ethnopharmacol，2010，131(1):203-209.

［3］官妍，張爽，汪長(zhǎng)中，等.魚(yú)腥草素鈉對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜作用的研究［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2011，46(10):733-737.

［4］夏玲珍，丁克儉.聯(lián)合用藥的研究現(xiàn)狀及發(fā)展［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(11):204-205.

［5］Sun L，Sun S，Cheng A，et al.In vitro activities of retigeric acid B alone and in combination with azole antifungal ag ents against Candida albicans［J］.Antimicrob Agents Chemother，2009，53(4):1586-1591.

［6］Oo TZ，Cole N，Garthwaite L，et al.Evaluation of synergistic activity of bovine lactoferricin with antibiotics in corneal infection［J］.J Antimicrob Chemother，2010，65(6):1243-1251.

［7］OSbome NF，Atkins RJ，Brcxan NJP，et al.Synthesis of(5R)-(Z 6，6(1-methyl1，2，3-triazol-4-ylmethy erie)penem-3-carboxylic acid，a potent bread spectrum β-lactaroase inhibitor-from 6-aminopenicillanicacid［J］.J Chem Soc Perkin Trarts，1994，179-184.

［8］沈秉正，鄭珩，倪孟祥，等.B型金屬β-內(nèi)酰胺酶抑制劑研究進(jìn)展［J］，中國(guó)新藥雜志，2011，20(2):144-147.

［9］龔鳳云，劉麗娜，邢銘友，等.表皮葡萄球菌耐藥與生物膜的相關(guān)研究［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，1(21):20-23.

［10］孟江，和殿峰，周毅生，等.魚(yú)腥草不同提取部位藥理活性的比較研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2008，19(5):1050-1051.

［11］李娟，邵慧，鐘正靈，等.魚(yú)腥草抗菌作用研究進(jìn)展［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2012，17(12):1428-1432.

［12］朱玲玲，孫振新，程惠娟，等.魚(yú)腥草素鈉對(duì)頭孢他啶抗銅綠假單胞菌生物被膜的增強(qiáng)作用及抗菌協(xié)同作用［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24(10):2353-2355.

［13］官妍，李春，石晶金，等.亞抑菌濃度魚(yú)腥草素鈉及與紅霉素聯(lián)合對(duì)表皮葡萄球菌生物被膜的作用［J］.中國(guó)中藥雜志，2013，38(5):731-735.