醒腦丸對氣虛血瘀血管性癡呆大鼠的治療作用研究

徐海蓉

(中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)

血管性癡呆(VD)是腦血管病(CVD)后發(fā)生的進(jìn)行性智能障礙綜合征，發(fā)病率各國報道不一致，在老年癡呆中歐美占15% ～50%，亞洲占60% ～80%[1]。我國11 個城市和農(nóng)村普查結(jié)果顯示，大于60 歲人群的患病率為324/10 萬，城市人群為428/10 萬，農(nóng)村人群為140/10 萬[2]。血管性癡呆的發(fā)病率與年齡呈正相關(guān)，其中大于60 歲者占79.53%[3]，25% ～50%的腦血管病最終導(dǎo)致血管性癡呆。腦梗死癡呆發(fā)生率為13.6%，大于出血性癡呆的2.69%，其中多發(fā)梗死性癡呆(MID)占15% ～68.7%[4]。雖然現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對血管性癡呆的病因病理認(rèn)識已比較明確，但尚無特效的治療方法，而中醫(yī)復(fù)方具有整體調(diào)節(jié)，多層次、多方位、多靶點(diǎn)作用，毒副作用小等特點(diǎn)。為此，本研究中初步探討了中藥醒腦丸對血管性癡呆的治療作用及機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級SD 大鼠48 只，雄性，體重(200 ±20)g，由南京君科生物科技有限公司提供，符合國際動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。醒腦丸(哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠，國藥準(zhǔn)字Z23020166，規(guī)格為每丸9 g)主要由黃芪、西洋參、當(dāng)歸、川芎、水蛭、地龍、三七、菖蒲、遠(yuǎn)志、冰片等組方，將藥丸溶解、過濾至含生藥1 g/mL，置冰箱備用;腦復(fù)康片(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H21021775，規(guī)格為每片0.4 g)，將藥片溶解制成0.032 g/mL 混懸液備用。大鼠血栓素B2(TXB2)ELISA 試劑盒(上?？泼羯锟萍加邢薰?;總一氧化氮(NO)試劑盒(碧云天生物研究所);大鼠Bax 免疫組化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)

1.2 方法

動物前期準(zhǔn)備:大鼠購回后適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，進(jìn)行24 h 飲水量、24 h 食量、自發(fā)活動的測定。自發(fā)活動量化測定方法[5]，將自制的25 cm×25 cm×25 cm 的自發(fā)活動箱底部劃十字線，分為4等份，置安靜環(huán)境中，試驗(yàn)前先撫摩動物2 min，使其熟悉試驗(yàn)者，然后將大鼠置測定箱的一角，觀察3 min 內(nèi)動物橫向和直向活動，以跨越劃線次數(shù)為橫向活動指標(biāo)，以前肢抬起或后肢站立的次數(shù)為直向活動指標(biāo)。第4 天開始，進(jìn)行游泳勞損引起氣虛造模。14 d 后，再進(jìn)行24 h 飲水量、24 h 食量、自發(fā)活動的測定。

造模:游泳勞損致氣虛模型，將大鼠放入水溫(43 ±0.5)℃、水深35 cm 的恒溫水槽中游泳，連續(xù)游泳14 d;以每只大鼠出現(xiàn)自然沉降的時間為大鼠游泳耐疲勞的時間，當(dāng)全組50%的大鼠出現(xiàn)自然沉降時，全組動物停止游泳。全腦缺血模型，大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉(每100 g 體重0.3 mL)，仰臥位固定，頸正中去毛，碘酒酒精消毒，行頸正中切口，鈍性分離肌肉及皮下組織，分別暴露雙側(cè)頸總動脈并用絲線結(jié)扎，逐層縫合，對齊皮膚;術(shù)后給予青霉素20 萬U 肌肉注射3 d，注意保持傷口清潔，分籠飼養(yǎng)。

分組:將氣虛造模成功的大鼠隨機(jī)分為4 組，即空白對照組(A 組)、模型組(B 組)、腦復(fù)康片組(C 組)、醒腦丸組(D 組)，每組12 只。

給藥:術(shù)后3 d，大鼠傷口愈合，飲食恢復(fù)后開始給藥，4 組均連續(xù)灌胃15 d，每天早晚各1 次。

A 組、B 組均以每次3 mL 生理鹽水灌胃，C 組以每次每1 kg體重腦復(fù)康片83 mg 溶于3 mL 生理鹽水中灌胃，D 組以每次每1 kg 體重醒腦丸0.83 g 體重溶于3 mL 生理鹽水中灌胃。

1.3 觀察指標(biāo)

行為學(xué)指標(biāo):觀察大鼠造模及用藥后的機(jī)體狀態(tài)，如皮毛、活動量、舌質(zhì);大鼠學(xué)習(xí)獲得能力測試，術(shù)后21 d 時，4 組大鼠分別進(jìn)行水迷宮試驗(yàn)，水迷宮由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制，整個迷路設(shè)置4 個盲端，終點(diǎn)有一高出水面的安全臺，水深18 cm，水溫(25±2)℃;每天訓(xùn)練2 次，記錄每只大鼠在游泳中進(jìn)入盲端的次數(shù)及游出時間，在水迷宮中進(jìn)入盲端的次數(shù)越少及游出的時間越短，表明動物學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。采用ELISA 法檢測血漿TXB2含量，用硝酸還原酶法測定10%腦勻漿中NO 含量，光鏡下觀察海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)量，采用免疫組化法檢測大腦海馬促細(xì)胞凋亡蛋白Bax 表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 氣虛模型

與造模前比較，造模后大鼠24 h 飲水量、食量均明顯減少，自發(fā)活動量也降低，均有極顯著性差異(P ＜0.01)，提示游泳勞損致氣虛造模成功。見表1。

2.2 大鼠機(jī)體狀態(tài)比較

灌服藥物15 d 后觀察大鼠，A 組活動靈活，皮毛鮮亮有光澤，舌質(zhì)淡紅;B 組自主活動減少，皮毛色黯不光滑，舌質(zhì)紫黯;C 組自主活動有所增多，但皮毛色澤與舌質(zhì)顏色與B 組基本相同;D組自主活動明顯增多(接近A 組)，皮毛光滑柔順、色澤鮮亮(與A組無明顯差異)，舌質(zhì)較紅。

表1 氣虛模型評定結(jié)果( ± s)

表1 氣虛模型評定結(jié)果( ± s)

注:與造模前比較，＊P ＜0.01。

類別造模前(n=48)造模后(n=48)24 h 飲水量(mL)13.97 ±1.76 10.29 ±1.05＊24 h 食量(g)9.30 ±2.06 7.15 ±1.31＊自發(fā)活動(次)26.23 ±7.07 21.77 ±6.65＊

2.3 觀察指標(biāo)測定

學(xué)習(xí)獲得能力:與A 組比較，B 組水迷宮到達(dá)終點(diǎn)時間明顯延長，進(jìn)入盲端的錯誤次數(shù)明顯增多，學(xué)習(xí)能力下降，均有極顯著性差異(P ＜0.01)，提示癡呆模型造模成功。與B 組比較，C 組和D 組到達(dá)終點(diǎn)時間均明顯縮短(P ＜0.01)，D 組進(jìn)入盲端的錯誤次數(shù)明顯減少(P ＜0.01)，提示中藥醒腦丸可提高血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)獲得能力。見表2。

血漿TXB2含量:與A 組比較，B 組血漿TXB2含量明顯升高(P ＜0.01)，提示氣虛血瘀征象明顯，造?；境晒?。與B 組比較，C 組血漿TXB2含量無明顯變化(P ＞0.05)，D 組則明顯降低(P ＜0.05)，提示醒腦丸可降低血管性癡呆大鼠TXB2含量，穩(wěn)定血小板功能，改善氣虛血瘀征象。見表2。

腦組織NO 含量:與A 組比較，B 組腦組織NO 含量明顯升高(P ＜0.01)，提示造?；境晒ΑＥcB 組比較，C 組和D 組腦組織NO 含量均降低，D 組降低更明顯(P ＜0.01)，提示醒腦丸可降低血管性癡呆大鼠腦組織NO 含量，減少過量NO 的毒性作用，減輕腦缺血后期神經(jīng)元的損害。見表2。

表2 各組大鼠觀察指標(biāo)測定結(jié)果( ± s，n=9)

表2 各組大鼠觀察指標(biāo)測定結(jié)果( ± s，n=9)

注:與A 組比較，＊P ＜0.01;與B 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別 學(xué)習(xí)獲得能力 血漿TXB2 含量(pg/mL)腦組織NO 含量(μmol/L)A 組B 組C 組D 組到達(dá)終點(diǎn)時間(s)62.75±15.94 132.00±30.38＊66.50±16.20▲65.75±20.01▲錯誤次數(shù)(次)1.38±1.06 3.88±1.13＊2.50±1.07△1.63±0.92▲708.21±250.90 1 185.02±198.63＊1 058.22±329.44 872.13±211.25△5.56±1.32 9.08±2.30＊6.46±1.22△6.00±1.75▲

2.4 海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察

A 組海馬CA1 區(qū)結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元形態(tài)、數(shù)目正常，錐體細(xì)胞排列整齊;B 組海馬CA1 區(qū)結(jié)構(gòu)不完整，錐體細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，部分細(xì)胞周圍出現(xiàn)間隙，細(xì)胞脫失明顯，膠質(zhì)細(xì)胞大量增生形成結(jié)節(jié);C 組海馬CA1 區(qū)結(jié)構(gòu)欠完整，錐體細(xì)胞排列不整齊，神經(jīng)元數(shù)目減少，但較B 組多，細(xì)胞有脫失，膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯;D 組海馬CA1 區(qū)結(jié)構(gòu)較完整，錐體細(xì)胞排列基本整齊，神經(jīng)元數(shù)目較B 組增多，細(xì)胞脫失較少，膠質(zhì)細(xì)胞輕度增生。見圖1。結(jié)果提示，醒腦丸對海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的損傷有保護(hù)作用。

2.5 大腦海馬促細(xì)胞凋亡蛋白Bax 的表達(dá)

Bax 免疫陽性細(xì)胞呈黃褐色，未加Bax 抗體的陰性對照為淡藍(lán)色。在A 組中，非缺血大鼠的海馬區(qū)極少見Bax 免疫陽性細(xì)胞，僅存在于個別皮層區(qū)域，且從形態(tài)學(xué)上看出，此表達(dá)局限于錐體細(xì)胞和中間神經(jīng)元中。而在B 組中，可發(fā)現(xiàn)海馬CA1 及CA4 區(qū)出現(xiàn)明顯的Bax 免疫陽性反應(yīng);腦皮層也呈現(xiàn)與海馬區(qū)類似的Bax免疫陽性反應(yīng)，呈散在較均勻地分布。C 組Bax 的表達(dá)較B 組有一定減少。D 組Bax 的表達(dá)明顯減少，特別是海馬CA1 區(qū)及大腦皮層區(qū)。見圖1。結(jié)果提示，醒腦丸能下調(diào)腦缺血后Bax的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。

圖1 各組大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)光鏡圖

3 討論

中醫(yī)對癡呆的認(rèn)識，早在先秦時期《左傳》中就有“不慧，蓋世所謂白癡”的記載，漢代華佗始稱之為“癡呆”，此后亦有愚癡、癡證、呆癡、呆病、神呆等不同名稱[6]。其成因在《醫(yī)林改錯》中已有“靈機(jī)記性在腦，年高無記性者，腦髓漸空”的概述，并說明癡呆與腦髓充盈的程度有直接關(guān)系，即腦髓充盈則人的腦神具有靈性智慧，神機(jī)聰穎，否則神機(jī)衰退以至不慧而成癡呆。

中風(fēng)癡呆是癡呆的一個重要類型，其發(fā)病于中風(fēng)之后，出現(xiàn)“迷惑善忘”“言善誤”“語無倫次”“懈怠安臥”“苦憂悲”等一系列精神異常癥狀。《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病》:“邪入于腑，即不識人?！薄杜R證指南醫(yī)案·中風(fēng)》:“或風(fēng)陽上僭，痰火阻竅，神識不清……”，均明言中風(fēng)時神志受累之實(shí)[7]。中風(fēng)癡呆的發(fā)病機(jī)制，不可脫離“年老體衰”“發(fā)于中風(fēng)”這兩個特點(diǎn)。

血管性癡呆的發(fā)生與腦動脈硬化、頸內(nèi)動脈閉塞及基底動脈硬化關(guān)系密切[8]。本病病因?yàn)閮?nèi)有所傷，外有所擾。人至老年，體力漸衰，五臟皆虛，尤其是心、腎、脾、胃等臟氣虧虛，則腦髓漸空，復(fù)因?qū)⑾⑹б恕﹦谶^度等，致使人體陰陽失調(diào)、氣虛血瘀、腦絡(luò)不通、腦脈失養(yǎng)、神明失用，遂癡呆、善忘。病性為本虛標(biāo)實(shí)，五臟氣虛為本，瘀血閉阻腦脈為標(biāo)，虛瘀并見，以益氣養(yǎng)血、活血化瘀為其治療的有效方法。

醒腦丸方中，黃芪大補(bǔ)元?dú)?，使氣旺以促血行，祛瘀而不傷?西洋參助黃芪補(bǔ)氣，有人參之功，無溫燥之弊，補(bǔ)氣而不傷陰，與黃芪共為君藥;當(dāng)歸為臣，能補(bǔ)血又能行血，可攻可補(bǔ)，有祛瘀而不傷好血之妙;川芎、三七活血化瘀，地龍通絡(luò)之功無處不到，水蛭性寒、入血分而長于逐瘀、性遲緩則不傷正氣，菖蒲、遠(yuǎn)志化痰開竅、安神益智，共為佐藥;冰片為使，香竄善行，通諸竅更能清心醒腦。全方構(gòu)思周密、精巧，共奏益氣活血開竅之功[9]。

現(xiàn)代藥理研究證明[10]，黃芪能加強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，有利于大腦對信息的貯存作用。黃芪總黃酮可降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物的生成，升高細(xì)胞超過氧化物歧化酶(SOD)的活性，維持細(xì)胞正常代謝。西洋參可調(diào)節(jié)大腦皮層的興奮、抑制過程，西洋參莖葉皂苷能增加循環(huán)血容量，減少休克時去甲腎上腺素的合成和釋放，從而改善微循環(huán)的灌流狀態(tài)，顯示出良好的全身性抗缺氧作用。當(dāng)歸能明顯改善大鼠試驗(yàn)性腦缺血癥狀，抑制TXB2產(chǎn)生，糾正腦缺血血檢素A2/前列環(huán)素I2(TXA2/PGI2)比值，對急性腦缺血大鼠具有明顯的治療作用。當(dāng)歸、黃芪均能抑制大鼠血小板聚集，二者合用時作用更強(qiáng)，具明顯的協(xié)同作用。川芎嗪可通過血腦屏障，能抗血栓形成，顯著減輕兔腦組織缺血性損害和神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。水蛭可明顯增加腦血流量，給試驗(yàn)性腦水腫的家兔靜脈注射水蛭水提醇沉液，可減少腦切片的血腫面積、促進(jìn)腦血腫吸收。地龍?zhí)崛∫耗苊黠@延長血小板血栓和纖維蛋白血栓的形成時間，減少血栓長度和干重。三七能抑制血小板聚集，降低血液黏度，能阻止再灌注時Ca2+內(nèi)流，對腦缺血損傷起保護(hù)作用。三七莖葉皂苷能提高腦組織SOD 活性，起到抗衰老作用。菖蒲水、醇提取物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜作用，并能明顯促進(jìn)正常小鼠的記憶獲得，并可對抗亞硝酸鈉或乙醇對記憶的不良作用。

本研究結(jié)果表明，醒腦丸能有效抑制腦缺血時體內(nèi)血小板的激活，降低血漿TXB2的水平，減輕微循環(huán)障礙，提示醒腦丸對缺血性腦血管病具有積極的防治作用，對氣虛血瘀的病理狀態(tài)有明顯改善作用。同時，醒腦丸可降低血管性癡呆大鼠腦組織NO 含量，減少過量NO 的毒性作用，減輕腦缺血后期神經(jīng)元的損害，這可能是醒腦丸治療血管性癡呆的作用機(jī)理之一。

本研究中，血管性癡呆大鼠腦切片用HE 染色后，光鏡結(jié)果證實(shí)了缺血對海馬的損傷，也表明了醒腦丸對血管性癡呆大鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元的缺血性損傷具有保護(hù)作用，這可能是該藥治療血管性癡呆的主要作用機(jī)制之一。采用免疫組織化學(xué)方法研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用醒腦丸后，Bax 免疫陽性細(xì)胞數(shù)目明顯減少，證實(shí)醒腦丸能下調(diào)腦缺血后Bax 蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡的神經(jīng)保護(hù)作用。但關(guān)于醒腦丸對缺血后腦細(xì)胞中Bax 的表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的確切機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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