小麥秸稈酶法制備低聚木糖及其抗氧化活性

田 龍，王 云，馬曉建

（1.南陽師范學院生命科學與技術(shù)學院，河南 南陽 473061；2.鄭州大學化工與能源學院，河南 鄭州 450001）

小麥秸稈酶法制備低聚木糖及其抗氧化活性

田 龍1,2，王 云1，馬曉建2

（1.南陽師范學院生命科學與技術(shù)學院，河南 南陽 473061；2.鄭州大學化工與能源學院，河南 鄭州 450001）

研究小麥秸稈酶法制備低聚木糖的最佳工藝及其抗氧化作用。確定低聚木糖的最佳制備條件為：酶解pH 6.0、木聚糖酶用量3 g/L、底物質(zhì)量濃度70 g/L、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h。在此條件下，酶解產(chǎn)生的還原糖含量為9.5 g/L，可溶性總糖含量為26.3 g/L，平均聚合度為2.77?？疾斓途勰咎堑目寡趸钚裕l(fā)現(xiàn)其對·OH、O2－·和DPPH自由基的清除能力呈量效關(guān)系。

小麥秸稈；低聚木糖；抗氧化活性

低聚木糖是一種具有獨特生理活性的功能性低聚糖，由2～7 個木糖分子以β-1,4-糖苷鍵相連構(gòu)成，其中木二糖、木三糖為主要有效成分。低聚木糖除了具有低熱、穩(wěn)定、安全、無毒等良好的理化特性外，還有促進腸內(nèi)雙歧桿菌等有益菌增殖，抑制有害菌生長的特性，因而亦被稱作雙歧因子[1-8]。

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，每年都產(chǎn)生數(shù)量巨大的農(nóng)作物秸稈等纖維廢棄物，現(xiàn)階段對于這些寶貴的資源沒有效利用，造成資源浪費和環(huán)境污染，基于此，本實驗以小麥秸稈經(jīng)丙酸法預處理得到的半纖維素降解液為原料，采用木聚糖酶法制備低聚木糖，考慮到近年來天然提取物的抗氧化活性研究成為研究熱點，本實驗還將對低聚木糖的抗氧化活性進行研究[9-24]，以期為木質(zhì)纖維素資源的綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥秸稈丙酸降解液，實驗室自制，其主要成分是半纖維素降解糖；利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在低溫條件下適當濃縮后，置于4 ℃冰箱中保存，備用。木聚糖酶（酶比活力為986 IU/g） 河南天冠企業(yè)集團有限公司；木聚糖美國Sigma公司。

1.2 低聚木糖的酶解法制備

在250 mL的三角瓶中加入適量的酶解底物和木聚糖酶，在一定的pH值和溫度條件下反應(yīng)一定時間。酶解結(jié)束后，將三角瓶置于沸水浴中10 min使木聚糖酶失活，冷卻后離心，取上清液測定還原糖和可溶性總糖。

1.3 方法

1.3.1 測定方法

1.3.1.1 還原糖含量測定

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法。

1.3.1.2 木聚糖酶活力測定

以質(zhì)量濃度為1.2 g/L的木聚糖為底物，在pH 4.8、50 ℃水浴中酶解反應(yīng)30 min，用DNS法測定反應(yīng)所生成的還原糖。在上述條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol還原糖（以木糖計）所需要的木聚糖酶定義為1 個國際單位（IU）。以純木糖作標準曲線。

1.3.1.3 可溶性總糖含量測定

取一定量的樣品3 000 r/min離心15 min，取上清液加入濃H2SO4，使H2SO4的質(zhì)量分數(shù)達6.5%，100 ℃條件下反應(yīng)2 h，用20%的NaOH溶液中和反應(yīng)液，過濾，濾液采用DNS法測定還原糖。

1.3.1.4 平均聚合度（degree of polymerization，DP）的計算

1.3.2 抗氧化活性的測定

1.3.2.1 清除羥自由基（·OH）實驗[25]

采用Fenton試劑生成·OH，具體操作方法：量取7.5 mmol/L的鄰二氮菲溶液1 mL，加入pH 7.4的磷酸鹽緩沖液1.5 mL，混勻，加入7.5 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，立即混勻，加入1 mL試樣，再加入質(zhì)量分數(shù)0.01%的H2O2溶液1 mL，最后以蒸餾水補充至10 mL，37 ℃水浴保溫1 h，在510 nm波長處測定吸光度A1，蒸餾水代替試樣的吸光度為A2，蒸餾水代替試樣及H2O2溶液的吸光度為A0，按式（2）計算清除率P（%）：

1.3.2.2 清除1,1-二苯基-二苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基實驗[26]

準確稱取10 mg DPPH自由基溶于100 mL無水乙醇得儲備液，避光保存。用時稀釋4 倍得6.5×10－5mol/L DPPH自由基溶液，另將待測樣品配制成系列溶液，按表1加樣，反應(yīng)10 min后于517 nm波長處測定吸光度。重復測定3 次，結(jié)果取平均值。

表1 DPPH實驗加樣量Table1 Experimental protocol for DPPH free radical scavenging assay

按式（3）計算清除率Y（%）：

1.3.2.3 清除超氧陰離子自由基（O2－·）實驗

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，置于25 ℃水浴中預熱20 min，加入提取液0.1 mL，2.5 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混勻后在25 ℃水浴中反應(yīng)4 min，立即用2 滴8 mmol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，并在299 nm波長處測定吸光度A（用蒸餾水調(diào)零）?？瞻捉M以0.1 mL蒸餾水代替樣品，重復3 次。按式（4）計算清除率I（%）：

2 結(jié)果與分析

圖1 木聚糖酶用量對水解效果的影響Fig.1 Effect of pentopan dosage on the hydrolysis efficiency of wheat straw

2.1 木聚糖酶用量對酶解的影響

酶解條件為：酶解溫度50.0 ℃、底物質(zhì)量濃度60 g/L、酶解pH 5.5、酶解時間4.0 h。從圖1可知，水解液中的還原糖質(zhì)量濃度和可溶性總糖質(zhì)量濃度均隨著酶用量的增加而增大，這是因為隨著酶用量的增加，單位體積水解液中的酶分子數(shù)量相應(yīng)提高，使得酶分子與反應(yīng)底物結(jié)合的幾率相應(yīng)增大，所以可有效提高反應(yīng)速度。當酶用量達到某一數(shù)值時，所有的底物與酶分子相結(jié)合，此時酶解效果達到最大。從圖1可知，當酶用量增加到3.0 g/L時，可溶性總糖的增加趨于平緩。隨著加木聚糖酶用量的增加，低聚木糖的聚合度在逐漸降低，當酶用量為3.0 g/L時，產(chǎn)物的聚合度基本保持不變。因此確定木聚糖酶用量應(yīng)以3.0 g/L為宜。

2.2 底物質(zhì)量濃度對酶解的影響

圖2 底物質(zhì)量濃度對水解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on the hydrolysis efficiency of wheat straw

酶解條件為：木聚糖酶用量4.0 g/L、酶解溫度50.0 ℃、酶解pH 5.5、酶解時間4.0 h。由圖2可知，酶促反應(yīng)中，底物質(zhì)量濃度對酶解反應(yīng)的進行具有重要影響：當?shù)孜镔|(zhì)量濃度較低時，提高底物的質(zhì)量濃度可以提高反應(yīng)速度，這是因為低底物質(zhì)量濃度時，木聚糖酶可以和底物充分接觸，因此反應(yīng)產(chǎn)物中的可溶性總糖和還原糖含量均在顯著增加。但在高底物質(zhì)量濃度情況下，底物質(zhì)量濃度的提高會導致產(chǎn)品得率的下降，這是因為底物黏稠會影響酶、底物和產(chǎn)物的擴散以及酶與底物的接觸，同時也可能產(chǎn)生底物對酶促反應(yīng)的抑制，使酶解效率下降。綜合考慮還原糖和總糖的得率及產(chǎn)物的平均聚合度，選擇底物質(zhì)量濃度在60 g/L的時候水解效果較好。由圖2可知，底物質(zhì)量濃度對酶解產(chǎn)物的平均聚合度也有一定影響。底物質(zhì)量濃度過低，則酶解產(chǎn)物的聚合度較大，說明酶解效率較低；但當?shù)孜镔|(zhì)量濃度過大時，反應(yīng)底物中只有部分被轉(zhuǎn)化為低聚木糖，產(chǎn)率較低，這對反應(yīng)底物來說是一種浪費。

2.3 酶解溫度對酶解的影響

圖3 酶解溫度對水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the hydrolysis efficiency of wheat straw

酶解條件為：木聚糖酶用量4.0 g/L、底物質(zhì)量濃度60 g/L、酶解pH 5.5、酶解時間4.0 h。溫度是影響酶促反應(yīng)的重要因素：溫度過低時，酶反應(yīng)速率很慢，適當升高溫度可以加快酶-底物絡(luò)合物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的速度，但酶的本質(zhì)是一種具有特殊催化活性的蛋白質(zhì)，溫度過高會使酶分子變性，導致酶的活性降低甚至失活，從而影響酶的作用效果。從圖3可以看出，從40～50 ℃，隨著酶解溫度的升高，酶解產(chǎn)物的可溶性總糖的質(zhì)量濃度和還原糖質(zhì)量濃度呈增加趨勢，這是因為溫度升高加速了反應(yīng)體系中酶分子與木聚糖底物的碰撞機會，有利于酶促反應(yīng)的進行。但當酶解溫度超過50 ℃時，酶解產(chǎn)物的可溶性總糖和還原糖質(zhì)量濃度下降，這是因為酶蛋白的構(gòu)象和參與酶促反應(yīng)的功能團離解狀態(tài)等發(fā)生了變化，酶的活力下降，所以選擇酶解溫度為50 ℃。

2.4 酶解pH值對酶解的影響

酶解條件為：木聚糖酶用量4.0 g/L、酶解溫度50.0 ℃、底物質(zhì)量濃度60 g/L、酶解時間4.0 h。反應(yīng)體系的pH值影響木聚糖酶的構(gòu)象，進而影響酶的活性部位與底物的接近和結(jié)合。酶在不同的pH值條件下以不同的解離狀態(tài)存在，通常只有一種解離狀態(tài)最適合酶促反應(yīng)進行。從圖4可看出，在反應(yīng)體系的pH 5.5時，可溶性總糖及還原糖的質(zhì)量濃度最高，分別為9.7 g/L和25.2 g/L，而此時酶解產(chǎn)物的聚合度為2.6；當pH值大于5.5或小于4.5時，可溶性總糖及還原糖的質(zhì)量濃度均下降，說明pH值在5.5時，木聚糖酶穩(wěn)定性和活力均較好，此時能夠發(fā)揮良好的作用。從圖4可知，酶解產(chǎn)物的平均聚合度隨著pH值的升高呈下降趨勢，而當pH值大于5時，平均聚合度基本保持恒定，綜合考慮，可以確定最佳pH值為5.5。

圖4 pH值對水解效果的影晌Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis efficiency of wheat straw

2.5 酶解時間對酶解的影響

圖5 酶解時間對水解液糖質(zhì)量濃度的影晌Fig.5 Effect of hydrolysis time on the hydrolysis efficiency of wheat straw

酶解條件為：木聚糖酶用量4.0 g/L、酶解溫度50.0 ℃、底物質(zhì)量濃度60 g/L、酶解pH 5.0。從圖5可以看出，在1.0～4.0 h的反應(yīng)時間內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，酶解液中的還原糖質(zhì)量濃度從6.3 g/L升高到9.7 g/L，而可溶性總糖質(zhì)量濃度由20.8 g/L升高到25.2 g/L。但當反應(yīng)時間繼續(xù)延長，可溶性總糖質(zhì)量濃度和還原糖質(zhì)量濃度增加緩慢。

對酶解產(chǎn)物的平均聚合度來說，其變化趨勢呈現(xiàn)類似的規(guī)律，在1.0～4.0 h的反應(yīng)時間內(nèi)，平均聚合度從起始的3.3降至2.6，這說明所采用的木聚糖酶具有很高的內(nèi)切型木聚糖酶活力，可快速切斷主鏈β-l,4木糖苷鍵，生成短鏈低聚物。而酶解4.0 h后，產(chǎn)物的平均聚合度變化趨緩，這是由于產(chǎn)物低聚木糖對酶的反饋抑制作用增強所致，同時也顯示出所用的木聚糖酶制劑中缺乏木二糖酶，而這一特性對于低聚木糖的制備是有利的。由此可知，適宜的酶解時間為4.0 h。

2.6 正交試驗

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table2 Orthogonal array design and results

從表2的極差分析可知，對于還原糖含量這個指標來說，5 個因素的影響程度依次是：酶解pH值＞木聚糖酶用量＞底物質(zhì)量濃度＞酶解溫度＞酶解時間。最佳組合為：酶解pH 6.0、木聚糖酶用量3 g/L、底物質(zhì)量濃度70 g/L、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h。

對于可溶性總糖含量這個指標來說，5 個因素的影響程度依次是：底物質(zhì)量濃度＞木聚糖酶用量＞酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時間。最佳組合為底物質(zhì)量濃度70 g/L、木聚糖酶用量4 g/L、酶解pH 6.0、酶解溫度50 ℃、酶解時間5 h。

對于平均聚合度這個指標來說，5 個因素的影響程度依次是：酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時間＞底物質(zhì)量濃度＞木聚糖酶用量。最佳組合為酶解pH 4.5、酶解溫度40 ℃、酶解時間2 h、底物質(zhì)量濃度50 g/L、木聚糖酶用量4 g/L。

綜合考慮，小麥秸稈酶法制備低聚木糖的最佳工藝條件為：酶解pH 6.0、木聚糖酶用量3 g/L、底物質(zhì)量濃度70 g/L、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h。此組合條件在表2中并未出現(xiàn)，因此需要做驗證性實驗。而驗證性實驗表明，在此最佳工藝條件下，酶解產(chǎn)生的還原糖含量為9.5 g/L，可溶性總糖含量為26.3 g/L，平均聚合度為2.77。

2.7 低聚木糖對·OH的清除作用

圖6 低聚木糖對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging capacity of xylooligosaccharides on hydroxyl free radicals

從圖6可以看出，低聚木糖對·OH具有一定的清除作用，隨著低聚木糖質(zhì)量濃度的增加，其對·OH的清除率也隨之增加，量效關(guān)系明顯。當?shù)途勰咎堑馁|(zhì)量濃度達到1.4 g/L時，對·OH的清除率達到97.2%。而以L-抗壞血酸作對照，在相同質(zhì)量濃度下低聚木糖對·OH的清除率低于L-抗壞血酸，原因可能是因為本實驗得到的低聚木糖是粗提物，純度較低，影響了其抗氧化活性。

2.8 低聚木糖對DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性主要來自3 個苯環(huán)的共振穩(wěn)定作用及空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對的電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對作用。作為一種穩(wěn)定的自由基，DPPH可以清除其他的自由基。DPPH法于1958年提出，現(xiàn)在已廣泛用于定量測定生物試樣和食品的抗氧化能力。其原理是：DPPH自由基有單電子，在517 nm波長處有一強吸收，其醇溶液呈紫色，然而當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量呈定量關(guān)系，因而可用分光光度計進行快速的定量分析[27-29]。由圖7可知，L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率基本不變，但低聚木糖對DPPH自由基的抑制率與其質(zhì)量濃度呈明顯的量效關(guān)系，進一步增加低聚木糖的質(zhì)量濃度，清除率趨于平緩。與同質(zhì)量濃度L-抗壞血酸的清除率相當，當質(zhì)量濃度大于100 mg/L時，低聚木糖對DPPH自由基的清除率大于同質(zhì)量濃度的L-抗壞血酸。由此可知，低聚木糖對DPPH自由基有顯著的清除作用，低聚木糖的抗氧化活性是由于其具有供給質(zhì)子的能力。

圖7 低聚木糖對DPPH自由基的清除作用Fig.7 Scavenging capacity of xylooligosaccharides on DPPH free radicals

2.9 低聚木糖對O2－·的清除作用

圖8 低聚木糖對·的清除作用Fig.8 Scavenging capacity of xylooligosaccharides on superoxide anion free radicals

3 結(jié) 論

通過單因素試驗和正交試驗確定木聚糖酶催化水解木聚糖最佳條件為：酶解pH 6.0、木聚糖酶用量3 g/L、底物質(zhì)量濃度70 g/L、酶解溫度50 ℃、酶解時間4 h。在此條件下，酶解產(chǎn)生的還原糖含量為9.5 g/L，可溶性總糖含量為26.3 g/L，平均聚合度為2.77?？寡趸钚詫嶒灡砻?，低聚木糖能有效地清除·OH、O2－·和DPPH自由基，且呈顯著的量效關(guān)系。

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Preparation and Antioxidant Activity of Xylooligosaccharides from Wheat Straw by Enzymatic Hydrolysis with Xylanase

TIAN Long1,2, WANG Yun1, MA Xiao-jian2
(1. School of Life Science and Technology, Nanyang Normal University, Nanyang 473061, China; 2. College of Chemical Engineering and Energy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China)

The enzymatic hydrolysis of wheat straw for preparing xylooligosaccharides using xylanase was optimized using an orthogonal array design, and the xylooligosaccharides obtained were assessed for antioxidant activity. A hydrolysis temperature and 4 h hydrolysis at an enzyme concentration of 3 g/L and a substrate concentration of 70 g/L with an initial pH of 6.0 proved optimal for the preparation of xylooligosaccharides. The optimized conditions yielded 9.5 g/L of reducing sugar and 26.3 g/L of soluble sugar in the product with an average degree of polymerization of 2.77. The xylooligosaccharides showed dose-dependent radical scavenging activity against 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), hydroxyl and superoxide anion radicals.

wheat straw; xylooligosaccharides; antioxidant activity

TS249.2

A

1002-6630（2014）20-0088-05

10.7506/spkx1002-6630-201420018

2011-09-03

田龍（1977—），男，講師，博士，研究方向為生物化工。E-mail：858687144@163.com