羅丹明B表面分子印跡聚合物制備及其熒光檢測

趙 晨，賈光鋒，陸文總，倪 原

（西安工業(yè)大學(xué)電子信息工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

羅丹明B表面分子印跡聚合物制備及其熒光檢測

趙 晨，賈光鋒，陸文總，倪 原

（西安工業(yè)大學(xué)電子信息工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

以羅丹明B為模板分子，制備了一種基于氧化硅的表面分子印跡聚合物，并采用掃描電鏡對表面分子印跡聚合物的性狀進行檢測，證明表面分子印跡聚合物是在硅膠表面形成了印跡空穴。同時，使用熒光顯微鏡檢測證明羅丹明B可被表面分子印跡聚合物有效結(jié)合和快速洗脫。采用熒光分光度計檢測表面分子印跡聚合對底物結(jié)合能力和特異性，結(jié)果顯示，表面印跡聚合物對羅丹明B具有高的識別性能，其Kd值為163.6，而相似物羅丹明6G和丁基羅丹明B分別為50和54.5。該方法與傳統(tǒng)羅丹明B檢測方法（高效液相色譜-紫外檢測法）相比更為靈敏，檢測限更低，即0.1 mg/L，可檢測出痕量物質(zhì)。

表面分子印跡聚合物；羅丹明B ；熒光分光光度計；硅膠；熒光顯微鏡

羅丹明B是一種鮮桃紅色的人工合成染料，在溶液中有強烈的熒光性，用作實驗室中細胞染色劑。研究發(fā)現(xiàn)羅丹明B具有致癌性，所以羅丹明B在食品等行業(yè)的使用被禁止。由于羅丹明B價格低廉，不法商販為謀取暴利，在食品中添加羅丹明B，因此對食品中添加劑羅丹明B的檢測方法的研究已被研究者重視[1-6]。在食品工業(yè)中色素添加量小，因此羅丹明B的添加是微量的。通過對食品肉眼觀察或氣味等簡單方法無法判斷食品中是否含有羅丹明B。而采用高效液相法檢測速度慢，周期長（樣品要預(yù)處理），成本高，無法滿足市場需求。故需要研制一種簡便、快速的檢測方法，該方法可直接檢測，且樣品不需處理，檢測成本低，且靈敏、快速。

分子印跡技術(shù)是一種可對特定物質(zhì)進行選擇性識別和分離的技術(shù)。該方法可實現(xiàn)對被檢測物質(zhì)低成本、高特異性的快速檢測。目前關(guān)于羅丹明B分子印跡法檢測已經(jīng)多有報道[7-11]。本實驗采用一種新的分子印跡方法，即設(shè)計表面分子印跡聚合物（molecularly imprintied polymer，MIP）。用羅丹明B作為印跡分子（模板分子），硅膠為基質(zhì)/載體，形成的印跡位點位于硅膠表面，易于印跡分子的結(jié)合與洗脫，提高表面分子印跡聚合物的結(jié)合率。且根據(jù)羅丹明B具有熒光性，可使用熒光分光光度儀對表面分子印跡聚合物的結(jié)合能力進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)采用熒光法檢測其靈敏性要高于紫外檢測方法。且與高效液相色譜法[12]（線性范圍是0.5～50 μg/mL）相比檢測限更低。因此，表面分子印跡法是一種有效的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

羅丹明B、羅丹明6G、丁基羅丹明B、乙二醇二甲基丙烯酸酯 阿拉丁試劑公司；甲烷磺酸、偶氮二異丁腈國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲基丙烯酸 成都市科龍化工試劑廠；乙烯基三乙氧基硅烷 美國Sigma-Alorich公司；乙二醇二縮水甘油醚 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；過硫酸銨 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；硅膠（300～400目） 青島海洋化學(xué)公司。實驗試劑均為分析純。

101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；Jobin Yvonn熒光分光光度計 日本Horiba公司；空氣浴振蕩器 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；G2pro掃描電鏡 美國Phenom公司；CX41熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 方法[13]

1.2.1 羅丹明B表面分子印跡聚合物的制備

取10 g硅膠顆粒，用50%甲烷磺酸溶液活化，并用丙酮、去離子水洗去雜質(zhì)，烘干得活化硅膠。活化硅膠10 g，15 mL乙烯基三乙氧基硅烷（triethoxyvinylsilane，TTS），于200 mL 50%乙醇溶液中，50 ℃水浴反應(yīng)24 h。得到乙烯基三乙氧基硅烷-硅膠（triethoxyvinylsilane-SiO2，TTS-SiO2）。取3 g TTSSiO2，10 g甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）和0.01 g過硫酸銨加入200 mL溶液中，通氮氣，在70 ℃條件下反應(yīng)7 h。用乙醇和蒸餾水洗反應(yīng)產(chǎn)物，并烘干。得到PMAA/SiO2。且PMAA/SiO2作為非印跡聚合物NIP。最后取1 g PMAA/SiO2和0.191 6 g的羅丹明B于100 mL氯仿溶液中。將混合的溶液在25 ℃條件下攪拌6 h。然后，加入0.1 g交聯(lián)劑乙二醇二縮水甘油醚（ethylene glycol digly cidyl ether，EGDE），入氮氣5 min，在50 ℃條件下反應(yīng)24 h。得到的產(chǎn)物被洗脫液（甲醇、乙酸、水的體積比為7∶2∶1）和甲醇沖洗去模板分子羅丹明B。然后再60 ℃條件下干燥，獲得羅丹明的MIP-PMAA/SiO2。

1.2.2 傳統(tǒng)方法制備羅丹明B分子印跡聚合物

采用本體聚合的方法制備分子印跡聚合物，即將0.2 g羅丹明B，0.5 mL MAA，50 mg偶氮二異丁氰（2,2’-azobisisobutyronitrile，AIBN），5.6 mL EGDMA依次加入50 mL的氯仿溶液中，并在室溫條件下攪拌10 min。然后，通入氮氣5 min，且在60 ℃條件下反應(yīng)24 h，得到塊狀聚合物。將塊狀聚合物研磨成顆粒均勻的粉末。最后用洗脫液（甲醇-乙酸（9∶1，V/V））洗脫分子印跡聚合物中的羅丹明B，即可得傳統(tǒng)MIP。

1.2.3 羅丹明B表面分子印跡聚合物性狀檢測

1.2.3.1 掃描電鏡檢測

對羅丹明表面分子印跡聚合物、非印跡聚合物進行掃描電鏡檢測，比較兩種物質(zhì)的掃描電鏡圖，可知MIPPMAA/SiO2的表面結(jié)構(gòu)。

1.2.3.2 熒光顯微鏡檢測

對洗脫羅丹明前后的MIP-PMAA/SiO2顆粒進行了熒光顯微鏡檢測，得到熒光顯微鏡圖，對比前后熒光強弱變化可知模板分子是否洗脫。

1.2.4 表面分子印跡聚合物與傳統(tǒng)印跡聚合物對羅丹明B的結(jié)合率檢測

由于羅丹明B具有熒光性，故采用熒光光度計對羅丹明B溶液進行檢測。

首先制作羅丹明B氯仿溶液中質(zhì)量濃度與熒光強度之間的標準曲線。制備0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/L的羅丹明B溶液，并檢測其熒光強度，制作標準曲線。然后取6 個10 mL離心管，各加入40 mg MIPPMAA/SiO2或傳統(tǒng)MIP，并加入5 mL不同質(zhì)量濃度的羅丹明B溶液（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mg/L），混合后再振蕩器中振蕩3 h。3 500 r/min離心1.5 min，取上清液進行熒光光度計檢測，并根據(jù)標準曲線得到溶液的質(zhì)量濃度。最后根據(jù)結(jié)合率公式（1）計算羅丹明B結(jié)合率。并根據(jù)公式（2）和（3）計算出分散系數(shù)Kd和選擇系數(shù)k。其中以NIP作為空白對照。

式（1）中：c1為初始時羅丹明B溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）；c2為平衡時羅丹明B溶液質(zhì)量濃度/（mg/L）；v為羅丹明B溶液的體積/L；m為MIP-PMAA/SiO2的質(zhì)量/g；Q為平衡時單位質(zhì)量MIP-PMAA/SiO2結(jié)合的羅丹明B量/（mg/g）。

式（2）、（3）中：Kd為表面分子印跡聚合物的分散系數(shù)；c2為溶液的平衡時的質(zhì)量濃度；k為表面分子印跡聚合物的相對系數(shù)。

1.2.5 表面分子印跡聚合物對羅丹明B的特異性檢測

羅丹明6G和丁基羅丹明B 均是羅丹明B的相似物，其結(jié)構(gòu)類似。是檢測中常見的干擾物質(zhì)。其結(jié)構(gòu)如圖1所示。制備6 種不同質(zhì)量濃度的羅丹明6G和丁基羅丹明B溶液（0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mg/L），并與等量MIP-PMAA/SiO2和NIP振蕩3 h，使模板分子與聚合物充分結(jié)合。離心后，用熒光光度計檢測上清液質(zhì)量濃度。通過公式（1）、（4）、（5）的計算，得到MIP-PMAA/SiO2和NIP對羅丹明B和相似物結(jié)合率Q值、Kd和k值。根據(jù)所得結(jié)果得到MIP-PMAA/SiO2對羅丹明B的特異性。

圖1 羅丹明B（a）、丁基羅丹明B（b）和羅丹明6G（c）結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structures of Rh B (a), butyl Rh B (b) and Rh 6G (c)

式（4）、（5）中：Ks為表面分子印跡聚合物的的選擇系數(shù)；k’為相對選擇系數(shù)。

Ks和k’都表示了表面分子印跡聚合物對羅丹明B的選擇性和特異性。Kd（B）和Kd（X）分別表示羅丹明和相似物的分散系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅丹明B表面分子印跡聚合物表面形態(tài)檢測

圖2 表面分子印跡聚合物（a）與硅膠（b）掃描電鏡圖Fig.2 SEM images of MIP-PMAA/SiO2bulks (a) and SiO2(b)

使用掃描電鏡對合成的MIP-PMAA/SiO2和SiO2進行觀察，結(jié)果如圖2所示。硅膠顆粒表面光滑，干凈，而表面分子印跡聚合物表面由于MAA發(fā)生聚合而形成的聚MAA層。故MIP-PMAA/SiO2表面形成了能過結(jié)合羅丹明B的印跡孔穴。

2.2 表面分子印跡聚合物熒光顯微鏡觀察

由于羅丹明B具有熒光性，可使用熒光顯微鏡可對表面分子印跡聚合物的洗脫模板分子能力進行初步檢測。如圖3所示，羅丹明B與表面分子印跡聚合物結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可看到明顯的熒光（圖3a），而當(dāng)用洗脫液洗去羅丹明分子后，熒光基本消失（圖3b）。說明制備的表面分子印跡聚合物可有效結(jié)合和洗脫模板分子。這是因為表面分子印跡聚合物與模板分子結(jié)合位點是位于基質(zhì)表面，而不是“包埋”在聚合物的內(nèi)部，因此模板分子可快速與分子印跡聚合物結(jié)合。且因為印跡位點位于表面，模板分子也易于從分子印跡聚合物上洗脫下來，因此在圖3b中基本看不到熒光，說明具有熒光性能的羅丹明B基本被洗脫。

圖3 結(jié)合羅丹明B的MIP-PMAA/SiO2（a）和洗脫后的MIP-PMAAA//SSiiOO2（b）的熒光顯微鏡圖Fig.3 Fluorescence microscope images of MIP-PMAA/SiO2bulks binding Rh B (a) and MIP-PMAA/SiO2bulks (b)

2.3 表面分子印跡聚合物與傳統(tǒng)分子印跡聚合物對羅丹明B的結(jié)合率檢測

根據(jù)標準溶液濃度和熒光強度的關(guān)系，得到標準曲線。且公式為：

式（6）中：PL為熒光強度；c為羅丹明B質(zhì)量濃度/（mg/L）。

根據(jù)標準曲線得到的公式（6），計算分子印跡聚合物和非印跡聚合物結(jié)合羅丹明B前后溶液質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（1）計算出Q值，并作圖，如圖4所示。

圖4 表面分子印跡聚合物與非印跡聚合物（a）和表面分子印跡聚合物與傳統(tǒng)印跡聚合物（b）對羅丹明B的結(jié)合曲線Fig.4 Adsorption isotherm of Rh B onto MIP-PMAA/SiO2and NIP (a), and MIP-PMAA/SiO2and traditional MIP (b)

由圖4a可看出，非印跡聚合物對羅丹明B的結(jié)合能力遠低于表面分子印跡聚合物。非印跡聚合物對羅丹明B的結(jié)合表示了印跡聚合與羅丹明B的非特異性結(jié)合，可看出結(jié)合量很低，大概在50 mg/g。而表面分子印跡聚合物對羅丹明B的高結(jié)合能力，顯示了表面印跡聚合物對羅丹明B的高識別性能。同時，可根據(jù)Kd（MIP）為163.6和Kd（NIP）為45.5（表1），得知MIP-PMAA/SiO2對羅丹明B具有高的結(jié)合能力。

同時，將表面分子印跡聚合物與傳統(tǒng)制備的分子印跡聚合物對羅丹明B結(jié)合能力進行了檢測，如圖4b所示?？芍砻娣肿佑≯E聚合物結(jié)合羅丹明B的能力遠遠強于傳統(tǒng)方法制備的印跡聚合物。討論其原因認為是傳統(tǒng)方法制備的分子印跡聚合物具有三維空間結(jié)構(gòu)，羅丹明B分子和功能基團嵌入聚合物中形成具有高交聯(lián)性的聚合物。導(dǎo)致結(jié)合位點存在于聚合物空間結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，模板分子與識別位點很難接近。而表面分子印跡技術(shù)是在惰性固體表面進行分子印跡聚合物的合成，本實驗選用硅膠作為基質(zhì)，這樣制備的表面分子印跡聚合物印跡位點和空間結(jié)構(gòu)位于基質(zhì)表面，避免羅丹明B分子包埋過深，易于結(jié)合與洗脫。

2.4 表面分子印跡聚合物對羅丹明B的特異性檢測

同時選擇羅丹明B的兩種結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，羅丹明6G和丁基羅丹明B作為對照，進行了結(jié)合率的檢測。已證明制備的羅丹明表面分子印跡聚合物對羅丹明B具有特異性吸附。由圖5可看到，羅丹明B表面分子印跡聚合物和非印跡聚合物對羅丹明6G和丁基羅丹明B的結(jié)合能力，且可看出表面分子印跡聚合物與非印跡聚合物對兩種相似物的結(jié)合能力基本相同。圖6表示了表面分子印跡聚合物對羅丹明B和其兩種相似物的結(jié)合能力，可知表面分子印跡聚合物對兩種相似物的結(jié)合能力要明顯低于羅丹明B。在表1中，羅丹明B的表面分子印跡聚合物的Kd（分散系數(shù)）為163.6，而羅丹明6G和丁基羅丹明B為50和54.5。而非印跡聚合物與表面分子印跡聚合物對相似物的結(jié)合能力值基本相似，羅丹明B、羅丹明6G、丁基羅丹明B的Kd值分別為45.5、54.5和55.5。因此，非印跡聚合物的選擇系數(shù)Ks為0.83（羅丹明B/羅丹明6G）和0.82（羅丹明B/丁基羅丹明B），基本相同且很低。而表面分子印跡聚合物的Ks值分別為3.27（羅丹明B/羅丹明6G）和3.0（羅丹明B/丁基羅丹明B）。這是因為位于硅膠表面的羅丹明B印跡孔穴可專一與羅丹明B結(jié)合，且該印跡孔穴在大小、形狀和空間作用位點的排列上均與相似物不匹配。因此，盡管羅丹明6G和丁基羅丹明B在結(jié)構(gòu)和大小上與羅丹明B十分相似（圖1），甚至羅丹明6G的分子質(zhì)量與羅丹明B都是一樣的，但由于結(jié)合位點的不匹配，兩種相似物無法與MIP-PMAA/SiO2結(jié)合。很明顯，MIP-PMAA/SiO2對羅丹明B的高識別能力和高選擇特異性結(jié)合是由于羅丹明B與印跡孔穴的完美配對。

圖5 MIP-PMAA/SiO2和NIP對羅丹明6G（a）和丁基羅丹明B（b）的結(jié)合曲線Fig.5 Adsorption isotherms of Rh 6G (a) and butyl Rh B (b) onto MIP-PMAA/SiO2and NIP

圖6 MIP-PMAA/SiO2對羅丹明B及其相似物的結(jié)合曲線Fig.6 Binding curve of MIP-PMAA/SiO2of Rh B and its analogues

表1 分子印跡聚合物分散系數(shù)和選擇性系數(shù)值Table1 Distribution and selection coefficients of molecularly imprinted polymers

3 結(jié) 論

目前，食品安全已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ钪胁豢珊鲆暤膯栴}。各種有毒的物質(zhì)作為添加劑加入到日常食品中，導(dǎo)致疾病甚至死亡。對于食品中微量添加成分的檢測方法已被研究者逐漸重視[14-17]。羅丹明B由于其低廉的價格，鮮艷的顏色被不法商販作為食品添加劑替代品加入到調(diào)料品種，如花椒、辣椒粉。而研究證明羅丹明B對人體的致癌性，使其成為危害人類健康的殺手。本實驗就是探討了一種快速、專一檢測羅丹明B的方法。

首先分別采用表面分子印跡技術(shù)[18-28]與傳統(tǒng)方法制備了羅丹明B的分子印跡聚合物，MIP-PMAA/SiO2和傳統(tǒng)MIP。表面分子印跡技術(shù)是以羅丹明B作為模板分子，硅膠為基質(zhì)/載體，在硅膠表面形成印跡孔穴。該方法對基質(zhì)表面進行修飾，如接入含雙鍵的硅烷，這樣可以將同樣含有雙鍵的單體接入基質(zhì)表面。然后，加入單體，單體之間在基質(zhì)表面發(fā)生聚合反應(yīng)，生成多聚單體。最后，加入模板、交聯(lián)劑、引發(fā)劑，并在無氧條件下合成表面分子印跡聚合物。通過掃描電鏡對制備的表面印跡聚合物形狀進行了檢測，可清楚地看到表面分子印跡聚合物表面形成的聚甲基丙烯酸層和印跡孔穴，證明表面分子印跡聚合物中的印跡位點和空間結(jié)構(gòu)均位于基質(zhì)的表面。而熒光顯微鏡對洗脫前后表面分子印跡聚合物的檢測說明該聚合物的結(jié)構(gòu)可避免模板分子包埋過深，易于模板分子的結(jié)合與洗脫。這是因為由于印跡位點位于基質(zhì)表面，模板與印跡位點相互作用阻力減少，結(jié)合動力加快。而傳統(tǒng)分子印跡方法制備的分子印跡聚合物形成的是一個高交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，印跡位點位于聚合物空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部，不易于模板分子的結(jié)合與洗脫。通過對表面分子印跡聚合物與傳統(tǒng)印跡聚合物的結(jié)合能力實驗，可知表面分子印跡聚合物的結(jié)合能力強于傳統(tǒng)印跡聚合物（圖4b）。同時，選取兩種在結(jié)構(gòu)上與羅丹明B十分相似的物質(zhì)，對制備的表面分子印跡聚合物的特異性進行了檢測，結(jié)果證明表面印跡聚合物具有高選擇性和特異性，是一種能夠快速、高效地檢測羅丹明B的方法。

目前國內(nèi)對羅丹明B的檢測方法主要是高效液相色譜法。黃奕娜等[14]報道了采用高效液相法檢測調(diào)味品中的羅丹明B，采用色譜柱C18為固定相，乙酸胺-甲醇（30∶70，V/V）為流動相，對辣椒油中的羅丹明B進行檢測。在該檢測方法中，辣椒油必須先通過丙酮和正己烷混合提取，并經(jīng)過固相萃取柱凈化后才能用色譜法檢測，樣品預(yù)處理步驟繁瑣。而檢測結(jié)果對羅丹明B的最低檢測限為0.5 μg/mL。李小燕等[12]采用高效液相色譜-紫外檢測檢測葡萄酒中羅丹明含量，同樣需要先將葡萄酒液中進行固相萃取，后再通過色譜柱進行測定，最低檢測限為1.0 μg/mL。該方法具有特異性和靈敏性，但檢測時需要對樣品進行前處理，且由于儀器昂貴，檢測步驟繁瑣，限制了食品檢測的應(yīng)用范圍。表面分子印跡法具對印跡分子羅丹明B具有特異性，可對羅丹明B特異性吸附，且經(jīng)過特異性實驗可知相似物對檢測結(jié)果干擾很小。且檢測方法簡單，樣品無需前處理，制備成本低廉。同時，將熒光法應(yīng)用于表面分子印跡聚合物對羅丹明B的檢測，提高了檢測的靈敏性。表面分子印跡聚合物對羅丹明B的最低檢測限為0.1 mg/L，即0.1 μg/mL。與高效液相色譜-紫外檢測中的最低檢測限0.5 μg/mL和1.0 μg/mL相比，該檢測方法更為靈敏。

由于被檢測物質(zhì)羅丹明B具有熒光性，因此與羅丹明B結(jié)合后的表面分子印跡聚合物也具有熒光性，故可采用熒光分光度計檢測分子印跡聚合對底物結(jié)合能力，且該方法與傳統(tǒng)羅丹明B檢測方法相比更為靈敏，檢測限更低（達到0.1 mg/L）[14]，可檢測出痕量物質(zhì)。但此方法只能應(yīng)用于具有熒光性質(zhì)的物質(zhì)，故需要改進方法，制備一種具有熒光的分子印跡聚合物，以實現(xiàn)所有底物均可進行熒光檢測，提高檢測靈敏性。

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Preparation and Fluorescence Microscopic Characterization of Surface Molecularly Imprinted Polymer of Rhodamine B

ZHAO Chen, JIA Guang-feng, LU Wen-zong, NI Yuan
(College of Electronic Information, Xi’an Technological University, Xi’an 710021, China)

Poly (methacrylic acid) was grafted onto the surface of bulk SiO2by solution polymerization to produce a molecularly imprinted polymer with a two-layer PMAA/SiO2bulk structure (surface molecularly imprinted polymer, SMIP). The morphology of SMIP was characterized by scanning electron microscopy (SEM) and fluorescence microscopy (FM). The SEM im age demonstrated that imprinted cavities were formed on the surface of SMIP. The FM image showed that rhodamine B (Rh B) could be combined and eluted quickly and effectively. SMIP had better binding property and selectivity as detected by a fluorescence spectrophotometer. The Kdof Rh B was 163.6, which was higher than that (50 and 54.5, respectively) of Rh 6G and butyl Rh B. Compared with the traditional detection method (HPLC-UV), the molecular imprinting method had better sensitivity and lower detection limit (0.1 mg/L) for trace-level determination of Rh B.

surface molecular imprinting polymer (SMIP); rhodamine B (Rh B)；fluorescence microscopy; silica gel; fluorescence microscope

TP212.2

A

1002-6630（2014）20-0236-06

10.7506/spkx1002-6630-201420047

2014-03-31

西安工業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項目（201210702060）；陜西省教育廳2012科學(xué)研究項目計劃項目（12JK0839）

趙晨（1981—），女，講師，博士研究生，研究方向為生物醫(yī)學(xué)工程。E-mail：19379886@qq.com